Verfahren zum Bestimmen von Kreatin-Phosphokinase
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestimmen von Kreatin-Phosphokinase durch Umsetzen von Adenosintriphosphat mit Kreatin in einer Lösung mit einem unbestimmten Gehalt an Kreatinphosphokinase unter Bildung von Adenosindiphosphat und Phosphokreatin.
Bei der Herstellung von Kreatin-Phosphokinase und bei der Herstellung von Reagenzien, die frei von Kreatin Phosphokinase sind, wie z.B. Milchsäuredehydrogenase und Pyruvat-Kinase, die bei der Prüfung auf/oder Untersuchung von Kreatin-Phosphokinase benutzt werden, ist es wichtig, ein einfaches aber wirksames Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins und des Gehaltes von Kreatin-Phosphokinase in tierischem Serum oder eines anderen biologischen Mediums aus dem Kreatin-Phosphokinase oder ein anderes Enzym extrahiert wird. Verfahren zur Extraktion von Kreatin-Phosphokinase sind von Noda, Kuby und Lardy in der Zeitschrift Biologische Chemie, Band 209, Zeile 291 ff und Seite 203 ff, 1954 beschrieben.
Vorübergehend erhöhte CPK-Werte wurden weiterhin von milden Herzmuskel-Infarkten berichtet, während bei Lungeninfarkten im wesentlichen normale Werte festgestellt wurden. Sowohl von mässig starker Muskelanstrengung als auch von Unterfunktion der Schilddrüse sind ebenfalls erhöhte CPK-Spiegel berichtet worden. Bei einer grossen Vielfalt von Störungen sind weiterhin im wesentlichen normale Werte festgestellt worden. Die CPK Bestimmung basiert auf der Tatsache, dass dasselbe einen spezifischen Katalysator für eine umkehrbare Reaktion darstellt, in der Adenosin-Triphosphat (ATP) und Kreatin unter Bildung von Adenosin-Diphosphat (ADP) und Kreatin-Phosphorsäure miteinander reagieren: (1) ATP + Kreatin fit ADP + Kreatin-Phosphorsäure.
Das Gleichgewicht der Reaktion (1) ist ausserordentlich pH abhängig. Der optimale pH-Wert für die nach rechts verlaufende Reaktion (Bildung von ADP und Kreatin Phosphorsäure) liegt bei etwa 9, während er für die umgekehrte Reaktion bei etwa 7,2 liegt.
Sowohl die nach rechts verlaufende als auch die Rückreaktion sind bei einer Vielzahl von Methoden zur Bestirnmung von CPK verwendet worden. Eine der zuerst benutzten Methoden [Ebashi et al, J. Biochem. (Tokyo), 46, 103 benutzte die nach rechts verlaufende Reaktion und bestimmte colorimetrisch den freien Phosphor, der durch Hydrolyse der Kreatin-Phosphorsäure gebildet wurde. Diese Methode hat sich als sehr einfach erwiesen; sie ist jedoch nicht sehr empfindlich. Weiterhin ist dabei erforderlich, dass die Serumproben bereits wenige Stunden nach der Probeentnahme für die Tests verwendet werden, weil sogar Proben, die beim Gefrierpunkt gelagert wurden, variierende Verminderungen der CPK-Aktivität zeigten, wenn sie nach dieser Methode geprüft wurden.
Wegen dieser Nachteile wurde eine Anzahl alternativer Methoden entwickelt. Tanzer und Gilvarg (J. Biol.
Chem. 234 - 3201) verbanden mit der vorgenannten Reaktion (1) die nachfolgenden Reaktionen: (2) Phospho (enol) pyruvat + ADP w Pyruvat + ATP (3) Pyruvat + DPNH + H Re Lactat + DPN
Die Geschwindigkeit der Oxydation von DPNH (dihydro diphosphopyridin nucleotido) wird mit einem UV Spektrophotometer bei 340 ma gemessen. Einige der mit dieser Methode verbundenen Schwierigkeiten sind sofort erkennbar. Es ist ein Spektrometer im Empfindlichkeitsbereich von 340 - 360 m'a erforderlich. Während der gesamten Zeit, in der Ablesungen gemacht werden, muss die Temperatur konstant auf 250C gehalten werden. Die Ablesungen müssen innerhalb genauer Zeitintervalle durchgeführt werden.
Ferner erfordert diese Methode 2 ml Serum und gibt sehr geringe, daher ungenaue Ablesungen für Normalserum. Trotz dieser Nachteile scheint dies jedoch die am meisten verwendete Methode zu sein.
Andere Forscher haben die Rückreaktion (1) verwendet. Bereits im Jahre 1954 haben Ennor und Rosenberg (Biochem. J. 57, 203) über eine Reihe von Experimenten berichtet, bei denen sowohl die nach rechts verlaufende als auch die Rückreaktion (1) bei einem pH-Wert von 10,5 für die nach rechts verlaufende Reaktion (1) und einem pH-Wert von 7,2 für die Rückreaktion (1) verwendet wurden. Bei der Verwendung von gereinigten CPK aus Skelettmuskulatur von Schafen und bei der Bestimmung des verbleibenden oder gebildeten Kreatins berichteten sie u.a. über zwei wichtige Feststellungen. Sie fanden zunächst, dass trotz vieler Experimente fünfzigmal so viel CPK für die nach rechts verlaufende Reaktion (1) als für die Umkehrreaktion erforderlich war, um eine geeignete Reaktionsgeschwindigkeit zu erzielen.
Ferner fanden sie, dass der Zusatz von Cystein, obgleich er eine Beschleunigung der Reaktionsgeschwindigkeit der Umkehrreaktion (1) bewirkt, auf die Geschwindigkeit der nach rechts verlaufenden Reaktion keinen Einfluss aus übt. Jüngere Forscher haben die Lehre von Ennor und Rosenberg weiter verfolgt. Hughes Clinica Chemica Acta, 7, 597 (1962) verwendet die Umkehrreaktion (1), setzt eine Sulfhydryl-Verbindung zu und bestimmt das gebildete Kreatin. Er fand, dass diese Methode ein lineares Verhältnis zwischen der Menge des CPK und der Menge des gebildeten Kreatins ergibt und dass reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden, obgleich die Sulfhydryl-Verbindung auf die Berechnung des Kreatins störend einwirkt. Nielsen und Ludvigsen [j. Lab. & Clin.
Med., 62, 159, (1963)] verwenden noch eine andere Methode, die 1,75 ml Serum erfordert und sie zitierten Ennor und Rosenberg bezüglich des Lehrsatzes, dass vergleichbare Messungen unter Verwendung der nach rechts verlaufenden Reaktion (1) eine fünfzigmal so hohe Konzentration an CPK erfordert.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfaches und genaues Verfahren zum Bestimmen von Kreatin-Phosphokinase zu schaffen.
Eine andere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zu schaffen. bei dem die zu prüfenden Sera sowohl frisch als auch gelagert sein können.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man der ATP und Kreatin enthaltenden Testlösung eine Sulfhydrylverbindung, einen Puffer zuni Einhalten eines pH-Wertes von angenähert 9,0, Phosphoenolpyruvat, Pyruvatkinase, Milchsäuredehydrogenase und DPNH zusetzt, eine erste spektrophotome trische Massung der Lösung vornimmt etwa fünf Minuten nachdem alle Reaktionsteilnehmer der Lösung zugemischt worden sind, nach einer bestimmten Zeitspanne eine zweite spektrophotometrische Messung bei derselben Wellenlänge wie bei der ersten vornimmt und aus der Differenz der beiden Messwerte den Gehalt der Lösung an Kreatin phosphokinase ermittelt.
Ganz allgemein wird mit dem erfindungsgemässen Verfahren eine Verbesserung des bekannten Verfahrens zur Bestimmung von Kreatin-Phosphokinase angestrebt und erreicht, indem bei einem Verfahren der vorerwähnten Art die Konzentration von DPNH spektrophotometrisch gemessen und die Abnahme der DPNH Konzentration zu der Aktivität der Kreatinphosphokinase in der Lösung in Beziehung gesetzt wird. Im Gegenteil zu den vorstehenden Lehren von Ennor und Rosenberg wurde nämlich gefunden, dass unter den bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Reaktionsbedingungen bei einem pH von etwa 9 der Zusatz einer Sulfhydryl-Verbindung eine mehrfache Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit und weit besser reproduzierbare Ergebnisse sogar mit Serum, welches eine beträchtliche Zeit gelagert worden ist, ergibt.
Es wird daher ein hochempfindliches und reproduzierbares Verfahren zur Bestimmung der cPK geschaffen, bei dem nur eine geringe Menge Serum erforderlich ist.
Die erfindungsgemässe Methode kann auf zahlreiche Verfahren angewandt werden, die die nach rechts verlaufende Reaktion (1) und entweder ADP oder Kreatinphosphorsäure messen.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch auf eine Methode angewendet werden, bei der Kreatinphosphat hydrolysiert und der dabei in Freiheit gesetzte anorganische Phosphor kolorimetrisch bestimmt wird. Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich ferner auf die oben erwähnte Methode von Tanzer und Gilvarg in einer modifizierten Weise anwenden, die weit einfacher, empfindlicher und zuverlässiger als die nicht modifizierte Methode ist.
Bei dem modifizierten Verfahren werden die folgenden Reaktionen mit der obigen Reaktion (1) gekuppelt, in Gegenwart eines Sulfhydryls: (4) ADP + Phospho (enol) Brenztraubensäure
Pyruvat
ATP
Kinase
Milchsäure (5) Brenztraubensäure + ,3-DPNH
Dehydrogenase
Milchsäure + -DNP
Genau bekannte Mengen aller Reagenzien werden zur Herstellung einer Lösung mit bekanntem Volumen verwendet. Es ist zu erkennen, dass die Regenerierung von ATP in der Reaktion (4) nach einer kurzen Inkubationszeit zu einer konstanten Konzentration von ATP führt.
Unter den Bedingungen des modifizierten Verfahrens hat sich gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit nach einer kurzen Inkubationszeit linear wird. Deshalb besteht keine Notwendigkeit, die Reaktionsgeschwindigkeit durch häufige Ablesungen auf einem UV-Spektrophotometer zu messen: es ist lediglich eine Anfangsablesung nach der Inkubationszeit und eine abschliessende Ablesung nach Ablauf einer vorbestimmten Zeitspanne, z.B. nach 10 Minuten notwendig. Wegen der Instabilität einiger Reagenzien nach ihrem Einmischen in die Lösung wird eine Blindprobe hergestellt, die alle Reagenzien mit Ausnahme von Kreatin enthält; die Anfangs- und Abschlussablesungen am Spektrophotometer werden so durchgeführt, dass diese Blindprobe als Standard dient.
Wie bei der nicht modifizierten Methode wird das Spektrophotometer auf 340 mz eingestellt, eine Wellenlänge, bei der DPNH eine hohe Dichte besitzt. Die Abnahme der optischen Dichte ist proportional der CPK-Aktivität im Serum.
Die bevorzugte modifizierte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist folgende: Es wird so ausgeführt, dass die Lösungen bei einer Temperatur von 250C gehalten werden.
Die folgenden Reagenzien werden in eine Ampulle oder in einen Kolben pipettiert, der 1,0 mg ,3-DPNH enthält:
Beispiel I
0,5 ml Phospho (enol)-pyruvat-Lösung (60 Mikromol aktives Phospho (enol)-pyruvat, z.B. Tricyclohexylaminsalz in 10 ml Mg-tris-Puffer, d.h. 0,015 Mol Mg SO4 und 0,6 Mol Tris-(hydromethylamino)-methan, eingestellt mit HCI auf einen pH von 9,0 bei 250C)
3,5 ml Wasser 0,2 ml Serum 0,2ml ATP-Glutathionlösung (aliquoter Teil einer
Lösung, die 310 mg ATP, Na, 3H20, 190 mg Gluta thion, reduzierte Form, und 3,7 ml Wasser enthält)
0,1 ml PK :
LDH Enzyme (je 2 mg kristalline Pyru vatkinase und Milchsäure-dehydrogenase pro ml 2,2 molare Ammoniumsulfat-Lösung).
Die Ampulle wird mit einer Kapsel verschlossen und mehrmals gekippt, um das DPNH zu lösen. Dann werden 2,0 ml dieser Lösung in je 2 Küvetten mit einer Lichtstrecke von 1 cm pipettiert. In eine dieser Küvetten werden 1,0 ml Mg-Tris-Pufferlösung (0,015 Mol MgSO4 und 0,6 Mol Tris, eingestellt mit HCL auf einen pH von 9,0 bei 250C) pipettiert. Diese Küvette wird als die Bezugsküvette bezeichnet. In die andere Küvette, die Versuchsküvette, werden 1,0 ml Kreatinlösung, die 0,06 Mol Kreatin in Mg-Tris-Pufferlösung enthält, bei einem pH-Wert von 9,0 bei 250C pipettiert. Der Inhalt jeder Küvette wird durch Kippen bzw. Umdrehen vermischt und genau bei 250C gehalten.
Im Idealfall ist das für diese Methode verwendete Spektrophotometer mit einer die Temperatur konstant haltenden Einrichtung versehen, damit die Temperatur von 250C konstant gehalten werden kann und die Küvetten werden sofort in das Spektrophotometer gestellt.
Wenn das Spektrophotometer nicht mit einem Thermostat ausgestattet ist, können die Küvetten in ein Bad von konstanter Temperatur gestellt werden. Nach ungefähr 5 Minuten wird das Spektrophotometer so eingestellt, dass sich bei der Bezugsküvette im Lichtweg bei 340 mu ein Wert von 0,400 für die optische Dichte ablesen lässt.
Die optische Dichte der Versuchsküvette wird dann abgelesen und notiert. Dies ist die Ablesung Null-Zeit (To). Genau zehn Minuten nach der Ablesung der Null Zeit wird das Spektrophotometer auf den Wert 0,400 optische Dichte eingestellt, wenn sich die Bezugsküvette im Lichtweg befindet und die optische Dichte der Versuchsküvette wird erneut abgelesen. Dies ist dann der 10 Minuten Wert (Tlo). Die Differenz zwischen T0 und T1, ist direkt proportional der Aktivität der cPK in dem Serum.
Obwohl die Differenz zwischen To und Tla selbst ausreichend sein kann, um den Aktivitätsgrad der cPK in dem geprüften Serum nach einer grossen Anzahl von Bestimmungen anzuzeigen, will man oft die CPK-Aktivität in Abhängigkeit einer Standardeinheit für diese Methode bestimmen. Diese Einheit kann bestimmt werden als die Aktivität von CPK, welches 1 Milli(mikro)mol Kreatin pro Minute bei 250C unter den Bedingungen des hier beschriebenen Verfahrens phosphorylisiert. Diese Definition erlaubt es, dass die Ergebnisse von verschiedenen Personen, die diese Methode angewandt haben, verglichen werden können und gewährleistet, dass es sich um einen brauchbaren Standard handelt, auf den andere Einheiten für andere Methoden mit Hilfe eines einfachen Umrechnungsfaktors umgewandelt werden können.
Die Einheiten der CPK-Aktivität bei dem erfindungsgemässen Verfahren können durch die folgende Formel erhalten werden:
Einheiten der CPK pro ml Serum = (OD) x (3,0) X (1000) (6,22) X (0,089) X (10) = 540 (hOD)
Der Ausdruck AOD gibt die Differenz zwischen dem T,- und Tl0-Wert an; 3,0 bedeutet das Volumen der Flüssigkeit in jeder Küvette; der Faktor 1000 ist erforderlich für den Übergang von 1l Mol auf m Mol; 6,22 die Extinktion pro m Mol für B-DPNH bei 340 mu; 0,089 stellt das Volumen des Serums in jeder Küvette in ml dar und 10 ist die Zeit in Minuten.
Wenn OD grösser als 0,30 ist, sollte die Bestimmung unter Anwendung einer geeigneten Verdünnung des Serums wiederholt werden und das neue Ergebnis mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert werden.
Hess und Mac Donald haben empfohlen, die Verdünnung mit einem Wärmeinaktivierten Serum (Serum bei 560C 15 Min. lang erhitzt) vorzunehmen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass kein nennenswerter Unterschied besteht, gleichgültig, ob die Verdünnung mit einer Sole (0,9%ige NaCl-Lösung) oder mit einem Wärmeinaktivierten Serum erfolgt.
Obwohl die Interpretation der erhaltenen Ergebnisse keinen Teil der Erfindung darstellt, kann angenommen werden, dass ausgedrückt in Einheiten, wie sie für dieses Verfahren definiert worden sind, normales Serum 0 - 12 Einheiten enthält, wobei die Grenzaktivität bei 12-20 Einheiten pro ml und eine zu hohe Aktivität oberhalb von 20 Einheiten pro ml liegt.
Die Verwendung der Standardlösung ist bei diesem Verfahren erforderlich, weil sogar in Abwesenheit von zugesetztem Kreatin eine Verringerung der optischen Dichte auftritt. Der grösste Anteil dieser Verringerung wird durch die spontane Zersetzung von ATP und DPNH und durch die Gegenwart der folgenden Enzyme im Serum verursacht:
ATPase, DPNH-Oxidase und alkalische Phosphatase.
Ein Vorteil des Verfahrens ist darin zu sehen, dass es sehr leicht einwandfrei geprüft werden kann, ob sich die Reagenzien befriedigend verhalten. Dieses Prüfverfahren kann gelegentlich als Teil der Bestimmung vorgenommen werden. Kurz vor der Ablesung der O-Zeit wird die optische Dichte der Standardlösung unter Verwendung von Wasser als Bezugssubstanz abgelesen. Wenn die optische Dichte der Standardlösung niedriger als 0,8 ist, dann befindet sich zuviel ADP in der ATP oder es befindet sich zuviel freies Pyruvat in der Phospho (enol) -pyruvat-Lösung oder es ist zu wenig -DPNH in der Ampulle. Eine zweite Prüfung wird vorgenommen, indem man die Ablesung 5 Min. nach der O-Zeit (T sowie die gewöhnliche Ablesung nach 10 Min. Tlo) vornimmt.
Der Unterschied zwischen T0 und T, sollte im wesentlichen der gleiche sein, wie der Unterschied zwischen Ta und T10. Wenn dies nicht der Fall ist, ist es wahrscheinlich, dass die Temperatur nicht konstant ist oder dass möglicherweise eines der Reagenzien wie bei der ersten Prüfung versagt hat. Eine dritte Prüfung folgt dann der Ablesung nach 10 Min., indem man wiederum die optische Dichte der Standardlösung unter Verwendung von Wasser als Bezugssubstanz abliest. Eine optische Dichte unterhalb 0,7 zeigt an, dass eines der gleichen Probleme, wie bei der ersten Prüfung vorliegt. Eine vierte Prüfung wird gemacht, indem man etwa ein halbes mg ADP zu der Standardlösung gibt. Nach 2 oder 3 Min. sollte die optische Dichte um 0,4 oder mehr gesunken sein.
Wenn dieser Abfall der optischen Dichte nicht beobachtet wird, und wenn die optische Dichte vor der Zugabe von ADP oder höher war, ist die PK/LDH-Enzymlösung inaktiv.
Aufgrund der obigen Beschreibung sind dem Fachmann zahlreiche Variationsmöglichkeiten des erfindungsgemässen Verfahrens unter Verwendung eines Sulfhy drils bei der obigen Reaktion (1) bei einem pH von etwa 0,9 geläufig. Das im einzelnen näher beschriebene Verfahren kann ebenfalls beträchtlich variiert werden. Beispielsweise kann der Anteil an Phospho (enol)-pyruvat -Lösung beträchtlich erhöht werden. Andere Puffer, z.B.
ein Glycinpuffer können ebenfalls verwendet werden, um den pH bei etwa 9,0 zu halten. Auch Küvetten mit einem anderen Lichtweg als der Küvette mit einem Lichtweg von 1 cm können verwendet werden, wobei in diesem Fall die berechneten Einheiten der CPK-Aktivität dividiert werden müssen durch den tatsächlichen Lichtweg in cm, um die Aktivität in den hier definierten Einheiten zu erhalten. Wenn man ungefähr 5 Min. wartet, bevor die O-Zeit-Ablesung erfolgt, so ermöglicht dies der Reaktion eine lineare Geschwindigkeit zu erreichen.
Durch Erfahrung wird man lernen, wie diese Anfangswarteperiode mit nur geringer Beeinflussung der Ergebnisse verkürzt oder beseitigt werden kann. Obwohl die Temperatur genau bei einem konstanten Wert gehalten werden sollte, kann auch eine andere Temperatur als 250C angewendet werden. Die berechneten Einheiten der Aktivität sollten dann mit einem geeigneten Korrektionsfaktor für die Temperatur (TC) multipliziert werden, wie dies in der folgenden Tabelle dargestellt ist.
Reaktions- (TC) Reaktions- (TC) Reaktions- (TC) temperatur temperatur temperatur 200 C 1.55 260 C 0,93 320 C 0.67
210 C 1.39 270 C 0.88 330 C 0.64 220 C 1.27 280 C 0.86 340 C 0.61
230 C 1.16 290 C 0.78 350 C 0.58
240 C 1.08 300 C 0.74 360 C 0.56 250 C 1.00 310C 0.70 370 C 0.54
Method for determining creatine phosphokinase
The invention relates to a method for determining creatine phosphokinase by reacting adenosine triphosphate with creatine in a solution with an undetermined content of creatine phosphokinase to form adenosine diphosphate and phosphocreatine.
In the production of creatine phosphokinase and in the production of reagents which are free of creatine phosphokinase, e.g. Lactic acid dehydrogenase and pyruvate kinase, which are used in testing for / or testing for creatine phosphokinase, it is important to provide a simple but effective method for determining the presence and level of creatine phosphokinase in animal serum or other biological medium the creatine phosphokinase or another enzyme is extracted. Methods for extracting creatine phosphokinase are described by Noda, Kuby and Lardy in the journal Biologische Chemie, Volume 209, line 291 ff and page 203 ff, 1954.
Mild myocardial infarctions continued to be reported, whereas pulmonary infarctions were essentially normal. Both moderate muscle exertion and hypothyroidism have also been reported to be elevated CPK levels. Substantially normal values have continued to be found in a wide variety of disorders. The CPK determination is based on the fact that it is a specific catalyst for a reversible reaction in which adenosine triphosphate (ATP) and creatine react with each other to form adenosine diphosphate (ADP) and creatine-phosphoric acid: (1) ATP + Creatine fit ADP + creatine phosphoric acid.
The equilibrium of reaction (1) is extremely pH dependent. The optimal pH value for the reaction proceeding to the right (formation of ADP and creatine phosphoric acid) is around 9, while it is around 7.2 for the reverse reaction.
Both right and reverse reactions have been used in a variety of methods for determining CPK. One of the first methods used [Ebashi et al, J. Biochem. (Tokyo), 46, 103 used the reaction proceeding to the right and colorimetrically determined the free phosphorus that was formed by hydrolysis of creatine-phosphoric acid. This method has proven to be very simple; however, it is not very sensitive. It is also necessary that the serum samples are used for the tests just a few hours after the sampling, because even samples that were stored at freezing point showed varying reductions in CPK activity when tested by this method.
Because of these disadvantages, a number of alternative approaches have been developed. Tanzer and Gilvarg (J. Biol.
Chem. 234-3201) combined the following reactions with the aforementioned reaction (1): (2) Phospho (enol) pyruvate + ADP w pyruvate + ATP (3) pyruvate + DPNH + H lactate + DPN
The rate of oxidation of DPNH (dihydro diphosphopyridine nucleotido) is measured with a UV spectrophotometer at 340 ma. Some of the difficulties associated with this method are immediately apparent. A spectrometer with a sensitivity range of 340-360 m'a is required. The temperature must be kept constant at 250C throughout the time that readings are taken. The readings must be taken within precise time intervals.
Furthermore, this method requires 2 ml of serum and gives very small, therefore inaccurate readings for normal serum. However, despite these drawbacks, this seems to be the most widely used method.
Other researchers have used the reverse reaction (1). As early as 1954, Ennor and Rosenberg (Biochem. J. 57, 203) reported a series of experiments in which both the rightward and the reverse reaction (1) at a pH of 10.5 for the after reaction (1) running to the right and a pH of 7.2 were used for the reverse reaction (1). When using purified CPK from sheep skeletal muscles and determining the creatine remaining or formed, they reported inter alia about two important findings. They first found that, despite much experimentation, fifty times as much CPK was required for the right-hand reaction (1) than for the reverse reaction to achieve a suitable reaction rate.
They also found that the addition of cysteine, although it accelerates the reaction rate of the reverse reaction (1), has no effect on the rate of the right-hand reaction. Younger researchers have followed up the teaching of Ennor and Rosenberg. Hughes Clinica Chemica Acta, 7, 597 (1962) uses the reverse reaction (1), adds a sulfhydryl compound and determines the creatine formed. He found that this method gives a linear relationship between the amount of CPK and the amount of creatine produced and that reproducible results are obtained, although the sulfhydryl compound interferes with the calculation of creatine. Nielsen and Ludvigsen [j. Lab. & Clin.
Med., 62, 159, (1963)] use yet another method which requires 1.75 ml of serum and they cited Ennor and Rosenberg for the theorem that comparable measurements using the right-going response (1) do fifty times as much requires high concentration of CPK.
It is therefore the object of the present invention to provide a simple and precise method for determining creatine phosphokinase.
Another task is to create a method. in which the sera to be tested can be both fresh and stored.
The method according to the invention is characterized in that a sulfhydryl compound, a buffer to maintain a pH value of approximately 9.0, phosphoenolpyruvate, pyruvate kinase, lactic acid dehydrogenase and DPNH are added to the test solution containing ATP and creatine, and a first spectrophotometric measurement of the solution is carried out for example Five minutes after all the reaction participants have been mixed into the solution, after a certain period of time, a second spectrophotometric measurement is carried out at the same wavelength as the first and the creatine phosphokinase content of the solution is determined from the difference between the two measured values.
In general, the method according to the invention aims to improve the known method for determining creatine phosphokinase and achieves this by spectrophotometrically measuring the concentration of DPNH in a method of the aforementioned type and the decrease in the DPNH concentration in relation to the activity of creatine phosphokinase in the solution in Relationship is set. In contrast to the above teachings by Ennor and Rosenberg, it was found that under the reaction conditions used in the process according to the invention at a pH of about 9, the addition of a sulfhydryl compound resulted in a multiple increase in the reaction rate and far better reproducible results even with serum, which has been stored for a considerable period of time.
A highly sensitive and reproducible method for determining the cPK is therefore created, in which only a small amount of serum is required.
The method of the present invention can be applied to numerous methods that measure the right-hand reaction (1) and either ADP or creatine phosphoric acid.
The method according to the invention can also be applied to a method in which creatine phosphate is hydrolyzed and the inorganic phosphorus released is determined colorimetrically. The method according to the invention can also be applied to the above-mentioned method by Tanzer and Gilvarg in a modified manner, which is far simpler, more sensitive and more reliable than the unmodified method.
In the modified method, the following reactions are coupled with reaction (1) above, in the presence of a sulfhydryl: (4) ADP + phospho (enol) pyruvic acid
Pyruvate
ATP
Kinase
Lactic Acid (5) Pyruvic Acid +, 3-DPNH
Dehydrogenase
Lactic acid + -DNP
Exactly known amounts of all reagents are used to make a solution of known volume. It can be seen that the regeneration of ATP in reaction (4) leads to a constant concentration of ATP after a short incubation period.
Under the conditions of the modified method it has been shown that the reaction rate becomes linear after a short incubation time. Therefore there is no need to measure the reaction rate by frequent readings on a UV spectrophotometer: there is only an initial reading after the incubation period and a final reading after a predetermined period of time, e.g. necessary after 10 minutes. Because of the instability of some reagents after they have been mixed into the solution, a blank is made containing all reagents except creatine; the initial and final readings on the spectrophotometer are taken using this blank as the standard.
As with the unmodified method, the spectrophotometer is set to 340 mz, a wavelength at which DPNH has a high density. The decrease in optical density is proportional to the CPK activity in the serum.
The preferred modified embodiment of the process according to the invention is as follows: It is carried out in such a way that the solutions are kept at a temperature of 250.degree.
The following reagents are pipetted into an ampoule or flask containing 1.0 mg, 3-DPNH:
Example I.
0.5 ml of phospho (enol) pyruvate solution (60 micromoles of active phospho (enol) pyruvate, e.g. tricyclohexylamine salt in 10 ml of Mg-tris buffer, i.e. 0.015 mol of Mg SO4 and 0.6 mol of tris (hydromethylamino) - methane, adjusted with HCI to a pH of 9.0 at 250C)
3.5 ml water 0.2 ml serum 0.2 ml ATP-glutathione solution (aliquot part of a
Solution containing 310 mg ATP, Na, 3H20, 190 mg glutathione, reduced form, and 3.7 ml water)
0.1 ml PK:
LDH enzymes (2 mg each of crystalline pyruvate kinase and lactic acid dehydrogenase per ml of 2.2 molar ammonium sulfate solution).
The vial is closed with a capsule and tilted several times to release the DPNH. Then 2.0 ml of this solution are pipetted into 2 cuvettes each with a light path of 1 cm. 1.0 ml of Mg-Tris buffer solution (0.015 mol of MgSO4 and 0.6 mol of Tris, adjusted with HCl to a pH of 9.0 at 250 ° C.) are pipetted into one of these cuvettes. This cuvette is called the reference cuvette. In the other cuvette, the test cuvette, 1.0 ml of creatine solution containing 0.06 mol of creatine in Mg-Tris buffer solution is pipetted at a pH of 9.0 at 250C. The contents of each cuvette are mixed by tilting or inverting and kept at exactly 250C.
Ideally, the spectrophotometer used for this method is equipped with a device that keeps the temperature constant so that the temperature of 250C can be kept constant and the cuvettes are immediately placed in the spectrophotometer.
If the spectrophotometer is not equipped with a thermostat, the cuvettes can be placed in a constant temperature bath. After about 5 minutes, the spectrophotometer is adjusted so that a value of 0.400 for the optical density can be read off in the light path of the reference cuvette at 340 μm.
The optical density of the test cuvette is then read and recorded. This is the zero time reading (To). Exactly ten minutes after reading the zero time, the spectrophotometer is set to the value 0.400 optical density when the reference cuvette is in the light path and the optical density of the test cuvette is read again. This is then the 10 minute value (Tlo). The difference between T0 and T1 is directly proportional to the activity of the cPK in the serum.
Although the difference between To and Tla itself can be sufficient to indicate the degree of activity of the cPK in the tested serum after a large number of determinations, one often wants to determine the CPK activity as a function of a standard unit for this method. This unit can be determined as the activity of CPK, which phosphorylates 1 milli (micro) mol of creatine per minute at 250C under the conditions of the method described here. This definition allows the results of different people who have used this method to be compared and ensures that it is a usable standard to which other units for other methods can be converted using a simple conversion factor.
The units of CPK activity in the process according to the invention can be obtained by the following formula:
Units of CPK per ml of serum = (OD) x (3.0) X (1000) (6.22) X (0.089) X (10) = 540 (hOD)
The term AOD indicates the difference between the T 1 and T10 values; 3.0 means the volume of the liquid in each cuvette; the factor 1000 is necessary for the transition from 1l mol to m mol; 6.22 is the absorbance per m mole for B-DPNH at 340 mu; 0.089 represents the volume of serum in each cuvette in ml and 10 is the time in minutes.
If the OD is greater than 0.30, the determination should be repeated using a suitable dilution of the serum and the new result multiplied by the dilution factor.
Hess and Mac Donald have recommended diluting with a heat-inactivated serum (serum heated at 560C for 15 minutes). It has been shown, however, that there is no notable difference, regardless of whether the dilution is carried out with a brine (0.9% NaCl solution) or with a heat-inactivated serum.
Although the interpretation of the results obtained does not form part of the invention, it can be assumed that, expressed in units as defined for this method, normal serum contains 0-12 units, with the limit activity at 12-20 units per ml and one too high activity is above 20 units per ml.
The use of the standard solution is necessary in this method because a decrease in optical density occurs even in the absence of added creatine. Most of this reduction is caused by the spontaneous breakdown of ATP and DPNH and the presence of the following enzymes in the serum:
ATPase, DPNH oxidase and alkaline phosphatase.
One advantage of the method can be seen in the fact that it can be checked very easily whether the reagents behave satisfactorily. This test procedure can occasionally be performed as part of the determination. Shortly before the reading of the O time, the optical density of the standard solution is read using water as the reference substance. If the optical density of the standard solution is lower than 0.8, then there is too much ADP in the ATP or there is too much free pyruvate in the phospho (enol) pyruvate solution or there is too little -DPNH in the ampoule. A second test is made by taking the reading 5 minutes after the O time (T as well as the usual reading after 10 minutes Tlo).
The difference between T0 and T should be essentially the same as the difference between Ta and T10. If it does not, it is likely that the temperature is not constant or that one of the reagents may have failed as in the first test. A third test then follows the reading after 10 minutes by reading the optical density of the standard solution again using water as the reference substance. An optical density below 0.7 indicates that there is one of the same problems as the first test. A fourth test is made by adding about half a mg of ADP to the standard solution. After 2 or 3 minutes, the optical density should have dropped 0.4 or more.
If this drop in optical density is not observed, and if the optical density was or higher before the addition of ADP, the PK / LDH enzyme solution is inactive.
On the basis of the above description, the person skilled in the art is familiar with numerous possible variations of the process according to the invention using a sulfhydride in the above reaction (1) at a pH of about 0.9. The method described in more detail can also be varied considerably. For example, the proportion of phospho (enol) pyruvate solution can be increased considerably. Other buffers, e.g.
glycine buffer can also be used to maintain the pH at about 9.0. Cuvettes with a different light path than the cuvette with a light path of 1 cm can also be used, in which case the calculated units of the CPK activity must be divided by the actual light path in cm in order to obtain the activity in the units defined here . Waiting about 5 minutes before taking the O-time reading will allow the reaction to reach a linear rate.
Experience will teach you how this initial waiting period can be shortened or eliminated with little impact on the results. Although the temperature should be kept precisely at a constant value, a temperature other than 250C can be used. The calculated units of activity should then be multiplied by an appropriate correction factor for temperature (TC), as shown in the table below.
Reaction (TC) reaction (TC) reaction (TC) temperature temperature temperature 200 C 1.55 260 C 0.93 320 C 0.67
210 C 1.39 270 C 0.88 330 C 0.64 220 C 1.27 280 C 0.86 340 C 0.61
230 C 1.16 290 C 0.78 350 C 0.58
240 C 1.08 300 C 0.74 360 C 0.56 250 C 1.00 310C 0.70 370 C 0.54