DE2937322C3 - Verfahren zur Bestimmung von Harnstoff - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Harnstoff

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urea
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hypochlorite
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Franco Siena Meiattini
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ISTITUTO SIEROTERAPICO E VACCINOGENO TOSCANO SCLAVO SpA SIENA IT
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/58—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving urea or urease

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Description

Die Erfindung betrifft ein vereinfachtes Verfahren zur enzymatisch-kolorimetrischen Bestimmung von Harnstoff, das auf der Verwendung von lediglich zwei Reaktionssystemen beruht.
Bekanntlich hydrolysiert das Enzym Urease ,Harnstoff unter Bildung von CO2 und NH3 (dies ist der enzymatische Teil der Bestimmung, I).
Es ist weiterhin bekannt, daß Ammoniak mit Phenol und Hypochlorit unter Bildung von Indophenolblau in alkalischem Medium reagiert; das Indophenolblau kann photometrisch gemessen werden (dies ist der nichtenzymatische Teil der Bestimmung, bekannt als Berthelot-Reaktion; Berthelot hat diese Reaktion 1859 beschrieben - II), III), IV).
Die Abfolge der Reaktion, von denen Gebrauch gemacht wird, lautet folgendermaßen:
Urease
Harnstoff + H2O
CO2 + 2NH3
Nitroprussid NH3 + Öd" > NH2Cl + OH"
NH2Cl -Ι
NCl +
OH"
OH
(D
(H)
(III)
(IV)
Die Reaktionsfolge II, III, IV, wurde von Weichselbaum et al. (Anal. Chem. 41, 848, 1969) untersucht und beschrieben sowie vor kurzem von Patton et al. (Anal. Chem. 49,464,1977).
Bei der Reaktion II wirkt die Nitroprussid-Verbindung als Katalysator und kann durch andere Substanzen, beispielsweise Aquopentacyanoferrat ersetzt werden.
Patton hat in seiner Veröffentlichung auch einige Verbindungen beschrieben, die anstelle von Phenol für die Reaktion III und IV eingesetzt werden können. Hierzu gehört auch das 2-Carboxylderivat, allgemein als Salicylsäure bekannt. Salicylsäure oder besser Natriumsalicylat wird in einigen handelsüblichen Testpackungen oder Testsätzen (Kit) für die quantitative Bestimmung von Harnstoff verwendet (beispielsweise im Rochet Kit).
Alle Veröffentlichungen und handelsüblichen Testsätze, die für die quantitative Bestimmung von Harnstoff bekannt sind, sehen drei voneinander getrennte Reaktionssysteme vor, nämlich:
a) Urease-Puffer
b) Phenol (oder substituiertes Phenol)-Nitroprussid-Verbindung
c) Alkalihypochlorit (oder eine Substanz mit gleichartiger Funktion).
Die Bestimmung des Harnstoffes damit erfolgt ebenfalls in drei Stufen, nämlich:
1) Vermischen der Probe mit Urease-Puffer und Inkubation,
2) Zugabe von Phenol-Nitroprussidkomplex,
3) Zugabe von Hypochlorit, Inkubation und photometrische Ablesung.
Die Anzahl der Reagentien und damit die Anzahl der Zugabe und Stufen kann aus folgenden Gründen nicht verringert werden:
A) Phenol und/oder Hypochlorit können nicht mit Urease vermischt werden, weil dieses Enzym durch die beiden Substanzen schnell denaturiert bzw. zerstört wird.
B) Phenol und Hypochlorit können nicht im voraus zusammengemischt werden, weil diese Mischung rasch ihre Reaktionsfähigkeit verliert; wahrscheinlich aufgrund der Bildung von chlorierten Phenolderivaten, die für die oben genannte Reaktionsabfolge ungeeignet sind.
Diese seit langem tief verwurzelten Vorstellungen wurden bisher als gültig angesehen, auch für Substanzen, die anstelle von Phenol oder Hypochlorit treten können.
Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, das dies in einigen Fallen nicht zutrifft. Wird z. B. Salicylat ansteile von Phenol verwendet, so kann die Urease gleichzeitig damit eingesetzt werden und die Reaktionsabfolge lautet dann folgendermaßen:
1. Vermischen der Probe mit einem Reagens, das Urease — Puffer-Salicylat (oder eine äquivalente Verbindung) — Nitroprussidkomplex enthält und Inkubation;
2. Zugabe des Hypochlorits, Inkubation und photometrische Ablesung.
Die Zahl der Reagentien bzw. Reaktionsstufen verringert sich damit von drei bei den bisher bekannten Systemen auf zwei beim neuen, erfindungsgemäßen Verfahren. In gleicher Weise wird die Anzahl der Zugaben auf zwei verringert; dies bringt eine erhebliche Vereinfachung mit sich, sowohl wenn die Harnstoffbestimmung manuell durchgeführt wird (geringere Anzahl von Pipettierungen) als auch wenn die Bestimmung automatisch vorgenommen wird (vereinfachte Vorrichtung).
Die Reaktionen, von denen Gebrauch gemacht wird, sind bekannt und werden seit langem genutzt. Erfindungsgemäß aber ist es möglich geworden, in einem einzigen Reagens die Urease, den Puffer, das Salicylat und die Nitroprussidverbindung miteinander zu kombinieren.
Wie oben bereits gesagt, kann das Salicylat durch eine Verbindung mit äquivalenter Funktion ersetzt werden. Hierzu gehören u. a. folgende Substanzen, die sich als günstig erwiesen haben: 3-Methylsalicylsäure, 4-Methylsalicysäure und 3-Hydroxybenzoesäure, weiterhin kann auch die Nitroprussidverbindung ersetzt werden, beispielsweise durch Aquopentacyanoferrat. Dieses Ergebnis war auf Grund der bekannten Verfahrensweise nicht vorhersehbar.
Das folgende Beispiel dient zur näheren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel
Es wurden folgende Lösungen hergestellt:
A) (mit Salicylat)
j 0 Komponenten für 100 ml
Phosphat Puffer
Natriumsalicylat
Nitroprussidnatrium
Urease
pH
2--20Millimol
0,4-4 g
50-500 mg
2 000-20 000 Einheiten
7,5-10,5
B) (mit 3-Methylsalicylsäure)
Komponenten für 100 ml Lösung:
KrHPO4
3-Methylsalicylsäure
Nitroprussidnatrium
Urease
pH
150-2 300 mg
30-300 mg
30-500 mg
2 000-20 000 Einheiten
7,5-10,5
Die Reagentien A) und B) wurden zusammen mit dem folgenden Reagens C) verwendet, dessen für sofortige Verwendung geeignete Konzentration lautet:
Natriurohypochlori t
NaOH
2-12Millimol
50-250 Millimol.
2,5 ml Reagens (A bzw. B) und je 0,020 ml Probe wurden 5 bis 10 Minuten inkubiert und darauf je 2,5 ml Reagens C) zugegeben; die erhaltene Lösung wurde weitere 5 bis 10 Minuten inkubiert.
Die entstandene Farbe bzw. Färbung wurde im Spektrophotometer bei 580 bis 700 nm gemessen.

Claims (5)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur enzymatisch-kolorimetrischen Bestimmung von Harnstoff durch Spaltung mittels Urease und Umsetzung mit einer Nitroprussidverbindung, Phenolverb.ndung und Hypochlorit, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) die Probe mit einem Reagens vermischt, das Urease, einen Puffer, ein Salicylat und eine Nitroprussid-Verbindung enthält, inkubiert, und dann erst das
b) Hypochlorit zugibt, erneut inkubiert und dann photometrisch abliest
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle von Salicylat 3-Methylsalicylsäure verwendet
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle von Salicylat 4-Methylsalicylsäure verwendet
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle von Salicylat 3-Hydroxybenzoesäure verwendet
5. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle der Nitroprussidverbindung Aquopentacyanoferrat verwendet
DE2937322A 1978-09-15 1979-09-14 Verfahren zur Bestimmung von Harnstoff Expired DE2937322C3 (de)

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FR2436185B1 (de) 1983-12-09
GB2030295A (en) 1980-04-02
IT7827718A0 (it) 1978-09-15
GB2030295B (en) 1982-12-22
US4507388A (en) 1985-03-26
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