DE2937322B2 - Verfahren zur Bestimmung von Harnstoff - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von HarnstoffInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein vereinfachtes Verfahren zur enzymatisch-kolorimetrischen Bestimmung von Harnstoff,
das auf der Verwendung von lediglich zwei Reaktionssystemen beruht
Bekanntlich hydrolysiert das Enzym Urease Harnstoff unter Bildung von CO>
und NHj (dies ist der enzymatischeTeil der Bestimmung, I).
υ) und Hypochlorit unter Bildung von Indophcnolbau in
alkalischem Medium reagiert; das Indophenolblau kann phototnetrisch gemessen werden (dies ist der nichtenzymatische
Teil der Bestimmung, bekannt als Berthelot-Reaktion; Berthelot hat diese Reaktion 1859 beschrie-
r, ben-1I)1III)1IV).
Die Abfolge der Reaktion, von denen Gebrauch gemacht wird, lautet folgendermaßen:
Urease
—► CO2 + 2NH3
Nitroprussid NH3 + Öd" · NH2CI + OH"
ClN
OH
OH
(Π)
(III)
(III)
(IV)
Die Reaktionsfolge II, III, IV. wurde von Weichselbaum
et al. (Anal. Chem. 41, 848, 1969) untersucht und beschrieben sowie vor kurzem von Patton et al. (Anal. .|-,
Chem. 49.464,1977).
Bei der Reaktion II wirkt die Nitroprussid-Verbin· dung als Katalysator und kann durch andere Substanzen,
beispielsweise Aquopentacyanoferrat ersetzt werden. K)
Patton hat in seiner Veröffentlichung auch einige Verbindungen beschrieben, die anstelle von Phenol für
die Reaktion III und IV eingesetzt werden können. Hierzu gehört auch das 2-Carboxylderivat, allgemein als
Salicylsäure bekannt. Salicylsäure oder besser Natrium- r> salicylat wird in einigen handelsüblichen Ttstpackungen
oder Testsätzen (Kit) für die quantitative Bestimmung von Harnstoff verwendet (beispielsweise im Rochet
Kit).
Alle Veröffentlichungen und handelsüblichen Testsät- mi
ze, die für die quantitative Bestimmung von Harnstoff bekannt sind, sehen drei voneinander getrennte
Reaktionssysteme vor,nämlich:
a) Urease-Puffer
b) Phenol (oder substituiertes Phenol)-Niiroprussid- h-,
Verbindung
c) Alkalihypochlorit (oder eine Substanz, mit gleichartiger
Funktion).
Die Bestimmung des Harnstoffes damit erfolgt ebenfalls in drei Stufen, nämlich:
1) Vermischen der Probe mit Urease-Puffer und Inkubation,
2) Zugabe von Phenol-Nitroprussidkompiex,
3) Zugabe von Hypochlorit, Inkubation und photometrische Ablesung.
Die Anzahl der Reagentien und damit die Anzahl der Zugabe und Stufen kann aus folgenden Gründen nicht
verringert werden:
A) Phenol und/oder Hypochlorit können nicht mit Urease vermischt werden, weil dieses Enzym durch
die beiden Substanzen schnell denatuiert bzw. zerstört wird.
B) Phenol und Hypochlorit können nicht im voraus zusammengemischt werden, weil diese Mischung
rasch ihre Reaktionsfähigkeit verliert; wahrscheinlich aufgrund der Bildung von chlorierten Phenolderivaten,
die für die oben genannte Reaktionsabfolge ungeeignet sind.
Diese seit langem tief verwurzelten Vorstellungen wurden bisher als gültig angesehen, auch für Substanzen,
die anstelle von Phenol oder Hypochlorit treten können.
ErfindungsgemäB wurde nun gefunden, das dies in
einigen Fällen nicht zutrifft. Wird z. B, Salicyalt anstelle
von Phenol verwendet, so kann die Urease gleichzeitig damit eingesetzt werden und die Reaktionsabfolge
lautet dann folgendermaßen:
1, Vermischen der Probe mit einem Reagens, das Urease — Puffer-Salicylat (oder eine äquivalente
Verbindung) — Nitroprussidkomplex enthält und Inkubation;
Z Zugabe des Hypochlorits, Inkubation und photometrische
Ablesung.
Die Zahl der Rsagentien bzw. Reaktionsstufen
verringert sich damit von drei bei den bisher bekannten Systemen auf zwei beim neuen, erfindungsgemäßen
Verfahren. In gleicher Weise wird die Anzahl der Zugaben auf zwei verringert; dies bringt eine erhebliche
Vereinfachung mit sich, sowohl wenn die Harnstoffbestimmung manuell durchgeführt wird (geringere Anzahl
von Pipeltierungcii) als auch wenn die Bestimmung automatisch vorgenommen wird (vereinfachte Vorrichtung),
Die Reaktionen, von denen Gebrauch gemacht wird, sind bekannt und werden seit langem genutzt.
ErfindungsgemäB aber ist es möglich geworden, in einem einzigen Reagens die Urease, den Puffer, das
Salicylai und die Nitroprussidverbindung miteinander
zu kombinieren.
Wie oben bereits gesagt, kann das Salicylat durch eine Verbindung mit äquivalenter Funktion ersetzt -werden.
Hierzu gehören u. a. folgende Substanzen, die sich als günstig erwiesen Inben: 3-Methylsalicylsäure, 4-Methylsalicysäure
und 3-Hydroxybenzoesäure, weiterhin kann auch die NitrcprussidVerbindung ersetzt werden,
beispielsweise durch Aquoper-tacyanoferrat. Dieses
Ergebnis war auf Grund der bekannten Verfahrensweise nicht vorsehbar.
Das folgende Beispiel dient zur näheren Erläü mng
der Erfindung.
Beispiel
Es wurden folgande Lösungen hergestellt:
Es wurden folgande Lösungen hergestellt:
A) (mit Salicylat)
|0 Komponenten für 100 ml
|0 Komponenten für 100 ml
Phosphat Puffer
Natriumsaiicylat
Nitroprussidnatrium
Urease
Natriumsaiicylat
Nitroprussidnatrium
Urease
pH
2-20MilIimoI
0,4-4 g
50-500 mg
2 000-20 000 Einheiten
7,5-10,5
B) (mit 3-Meihylsalicylsäure)
Komponenten für 100 ml Lösung:
Komponenten für 100 ml Lösung:
K2HPO4 150-2 300 mg
3-Methylsalicylsäure 30 - 300 mg
pil 7,5-10^
Die Reagentien Λ) und B) wurden zusammen mit dem
folgenden Reagens C) verwendet, dessen für sofortige Verwendung geeignete Konzentration lautet:
Natriumhypochlcrit 2-12 Millimol
NaOH 50-250 Millimol.
2,5 ml Reagens (A bzw. B) und je 0,020 ml Probe
wurden 5 bis 10 Minuten inkubiert und darauf je 2,5 ml Reagens C) zugegeben; die erhaltene Lösung wurde
weitere 5 bis 10 Minuten inkubiert
Die entstandene Farbe bzw. Färbung wurde im Spektrophotometer bei 580 bis 700 muxn gemessen.
Claims (5)
1. Verfahren zur enzymatisch-kolorimetrischen
Bestimmung von Harnstoff durch Spaltung mittels Urease und Umsetzung mit einer Nitroprussidverbindung,
Phenolverbindung und Hypochlorit, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) die Probe mit einem Reagens vermischt, die Urease, einen Puffer, ein Salicylat und eine
Nitroprussid-Verbindung enthält, inkubiert, und
dann erst das
b) Hypochlorit zugibt, erneut inkubiert und dann photometrisch abliest
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet,
daß man anstelle von Salicylat 3-Methylsalicylsäure verwendet
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle von Salicylat 4-Methylsalicylsäure
verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle von Salicylat 3-Hydroxybenzoesäure
verwendet
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß man anstelle der
Nitroprussidverbindung Aquopentacyanoferrat verwendet
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