DE1598263C3

DE1598263C3 - Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität eines Carbonylverbindung-NADH tief 2 -Redoxenzyms

Info

Publication number: DE1598263C3
Application number: DE1598263A
Authority: DE
Inventors: Nobuhiko Prof. Tokushima Katsunuma (Japan)
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1965-05-11
Filing date: 1966-05-10
Publication date: 1974-05-09
Also published as: DE1598263A1; GB1136733A; DE1598263B2; US3493466A

Description

Die Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität eines Carbonylverbindung-NADH₂-Redoxenzyms mit Ausnahme der Malat-Dehydrogenase.

Der in der vorliegenden Anmeldung verwendete Ausdruck »CO-Verbindung« kennzeichnet eine Carbonylverbindung, während der Ausdruck »CO-Verbindung-NADH₂-Redoxenzym« das Enzym definiert, welches bei der enzymatischen Oxydations-Reduktions-Reaktion von CO-Verbindungen und Verbindungen, die Hydroxy-, Aldehyd-, Carbonyl-, Aminoreste od. dgl. (im folgenden als »reduzierte CO-Verbindung« bezeichnet) enthalten, teilnimmt, und zwar nach folgender Reaktionsgleichung:

CO-Verbindung — NADH₂

->- reduzierte CO-Verbindung + NAD

worin NAD-Nicotinamid-Adeninindinucleotid und NADH₂ die reduzierte Form davon ist.

Es ist bekannt, daß die Aktivität von CO-Verbindung-NADH₂-Redoxenzym in Geweben oder Körperflüssigkeiten bei verschiedenen Herzkrankheiten, Leberkrankheiten od. dgl. schwankt. Aus diesem Grunde wurde die Bestimmung der enzymatischen Aktivität in Körperflüssigkeiten von CO-Verbindung-NADH₂-Redoxenzymen zur Diagnose dieser Krankheiten herangezogen.

Bisher wurden zwei Verfahren routinemäßig zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von CO-Verbindung-NADH₂-Redoxenzymen bei klinischen und biochemischen Untersuchungen verwendet. Diese Methoden basieren auf verschiedenen Prinzipien, und zwar arbeitet die eine Methode unter Anwendung der Spektrophotometrie, während bei dem zweiten

ίο Verfahren die Farbe bestimmt wird, die durch 2,4-Dinitrophenylhydrazone von entweder nicht umgesetzten oder umgesetzten a-Ketosäuren entwickelt wird.

Bei dem ersten Verfahren wird eine einzelne Enzymreaktion in Gang gesetzt, und die NADH₂-Abnahme

is wird durch Absorption bei 340 πιμ gemessen. Dieses erstere Verfahren ist exakt und einfach durchzuführen, es erfordert jedoch ein UV-Spektrophotometer zur Bestimmung der Absorption, und es haftet ihm der Nachteil an, daß eine große Anzahl von Proben

ao gemessen werden muß, wie dies beispielsweise bei klinischen Untersuchungen der Fall ist, wodurch ein großer Zeitaufwand erforderlich wird.

Beim zweiten Verfahren wird eine Enzymreaktion in Gang gesetzt, und die Abnahme der Carbonylverbindung wird kolorimetrisch in Form des 2,4-Dinitrophenylhydrazons gemessen. Bei diesem Verfahren ist zwar kein UV-Spektrophotometer erforderlich, jedoch ist das Verfahren als solches wenig empfindlich, ; und man erhält oft ungenaue Ergebnisse.

Bei sonstigen bekannten Verfahrensweisen werden zur Bestimmung von Enzymaktivitäten > zwei enzymatische Reaktionen miteinander kombiniert, jedoch laufen diese enzymatischen Reaktionen über das Substrat ab (z. B. Brenztraubensäure) und nicht über das Coenzym.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues, einfach durchzuführendes und genaue Werte lieferndes Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von CO-Verbindung-NADH₂-Redoxenzymen zu entwickeln.

Überraschenderweise konnte festgestellt werden, daß eine einfache und genaue Bestimmung der Enzymaktivität durchgeführt werden kann, wenn die Malat-Dehydrogenasereaktion als Indikatorreaktion gewählt wird und die von der Malat-Dehydrogenasereaktion verschiedene Carbonylverbindung-NADHa-Redoxenzymreaktion damit gekoppelt wird und die bei den beiden enzymatischen Reaktionen gebildete Oxalessigsäuremenge in üblicher Weise unter Verwendung eines Diazoniumsalzes bestimmt wird. Diese Verfahrensweise hat den Vorteil, daß die Indikatorreaktion stets konstant ist, so daß das verwendete Substratenzym (außer der Carbonylverbindung) in vorteilhafter Weise durch das zu bestimmende Enzym nicht geändert wird.

Die Lösung der genannten Aufgabe besteht somit in einem Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen· Aktivität eines Carbonylverbindung-NADH₂-Redoxenzyms mit Ausnahme der Malat-Dehydrogenase, das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Carbonylverbindung, ein reduziertes Nicotinamid-Adenindinucleotid, Apfelsäure oder eines ihrer wasserlöslichen Salze und Malat-Dehydrogenase in ein geeignetes Volumen einer das zu bestimmende Enzym enthaltenden Probelösung eingeführt werden, daß dadurch die beiden Enzymreaktionen des zu bestimmenden Enzyms und der Malat-Dehydrogenase in Gang gebracht werden und daß die Menge der

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dabei gebildeten Oxalessigsäure in bekannter Weise chlorid verwendet oder als Diazoniumsalz ein Doppelunter Verwendung eines Diäzoniumsalzes kolori- salz aus o-Benzarnido^-methoxy-m-toluidmdiazoniurnmetrisch bestimmt wird. chlorid und Zinkchlorid.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Ver- Erfindungsgemäß wird die enzymatische Aktivität

fahrens nach der Erfindung werden die Apfelsäure, 5 eines CO-Verbindung-NADHa-Redoxenzyms durch

die reduzierte Verbindung des Nicotinamid-Adenin- Zugabe einer CO-Verbindung, NADH₂, Apfelsäure

dinucleotids und die Carbonylverbindung in einem oder deren Salz und MDH zu einem geeigneten

molaren Verhältnis von 300 bis 500 : 0,5 bis 2 : 30 bis 60 Volumen einer Probelösung, wobei die vorstehend

und vorzugsweise in einem molekularen Verhältnis angegebenen enzymatischen Reaktionen ablaufen,

von 400:1,8 : 40 verwendet. io und Messung der gebildeten Oxalessigsäuremenge

Mit dem Verfahren nach der Erfindung erhält man bestimmt.

besonders präzise Werte, wenn man als Diazoniumsalz Der Mechanismus der enzymatischen Reaktionen

das 6-Benzamido-4-methoxy-m-Toluidindiazonium- ist folgender:

CO-Verbindung <—. ι—> NADH₂ <—ι .—> Oxalessigsäure

Reduzierte <=—Γ L> NAD <-i I—> Apfelsäure

CO-Verbindung

CO-Verbindung- Malat-

NAOH₂-Redoxenzym Dehydrogenase

Wie aus dem vorstehenden Mechanismus hervor- 25 schuß an dieser Verbindung zugesetzt werden soll, geht, wird die der Probelösung zugesetzte CO-Ver- Wird beispielsweise die Aktivität in der Körperbindung durch Einwirkung des zu bestimmenden flüssigkeit bestimmt, dann wird MDH zweckmäßiger-CO-Verbindung-NADH₂-Redoxenzyms in eine ent- weise in Mengen über 10 m-I.U. (International Units), sprechende reduzierte CO-Verbindung umgewandelt. vorzugsweise in Mengen von 10 bis 100 m-I.U. pro wobei gleichzeitig die Bildung von NAD aus NADH₂ 30 0,2 ml Körperflüssigkeit zugegeben,
erfolgt. Das gebildete NAD reagiert mit Apfelsäure Um die enzymatische Reaktion ruhig ablaufen zu durch Einwirkung der Malat-Dehydrcgenase unter lassen, wird vorzugsweise eine Puffermischung ver-Bildung der äquivalenten Mengen an Oxalessigsäure wendet, um den pH-Wert des Reaktionsmediums und NADH₂. Die Mengen an gebildeter Oxalessig- während der Messung auf ungefähr 7 bis ungefähr 9 säure sind dem Grad der enzymatischen Aktivität des 35 zu halten. Für diesen Zweck kann ein HCl-Puffer, CO-Verbindung-NADH₂-Redoxenzyms proportional. Phosphat-Puffer od. dgl. in vorteilhafter Weise ver-Daher kann die enzymatische Aktivität eines CO- wendet werden. '■' ^;

Verbindung-NADH₂-Redoxenzyms durch Messung Die Menge der gebildeten Oxalessigsäure wird nach

der gebildeten Oxalessigsäuremenge bestimmt werden. Beendigung der Umsetzung nach einem bekannten

In der Praxis kann die enzymatische Aktivität eines 40 koloritmetrischen Verfahren unter Verwendung eines CO-Verbindung-NADH₂-Redoxenzyms durch Zugabe Diäzoniumsalzes als Farbentwickler bestimmt,
einer CO-Verbindung, NADH₂,.Malat-Dehydrogenase Einige Diazoniumsalze hemmen nicht die enzy-(MDH) und Apfelsäure oder "eines Salzes dieser Säure matischen Reaktionen, sondern reagieren mit Oxalzu einer geeigneten Menge einer Probelösung, die ein essigsaure insbesondere unter den kontrollierten Be-CO-Verbindung-NADH₂-Redoxenzym enthält, Ein- 45 dingungen unter Bildung eines gefärbten Kupplerstellung des pH-Wertes in dem Reaktionsmedium stones, der im sichtbaren Spektrum eine Absorption durch Zugabe einer Puffermischung auf ungefähr 7 bis aufweist. Daher kann ein Diazoniumsalz dem enzyungefähr 9, vorzugsweise 8,0, im allgemeinen 15 bis matischen Reaktionsmedium vor oder nach der Er-30 Minuten andauerndes Erwärmen auf 30 bis 40° C, wärmung (Inkubierung) zugesetzt werden und die vorzugsweise 37° C, zur Bildung der Oxalessigsäure 50 Menge der gebildeten Oxalessigsäure in vorteilhafter und Messung der Menge der gebildeten Oxalessigsäure Weise durch Verwendung eines Colorimeters oder bestimmt werden. Alle diese Mittel können für sich visuell durch Vergleich der entwickelten Farbe mit allein oder in Form einer Mischung oder in Form von einer Standardfarbkarte bestimmt werden. Als der-Mischungen, die vorher auf eine geeignete Weise zu- artige Diazoniumsalze seien beispielsweise 4-Aminosammengemischt wurden, zugegeben werden. 55 2,4-diäthoxybenzaniliddiazoniumchlorid, 6-Eenzamido

Da die vorstehend angegebenen zwei enzymatischen 4-methoxy-m-toluidindiazoniuirichlorid, teträzotiertes Reaktionen reversibel sind, ist es erforderlich, hin- o-di-Anisidin od. dgl. erwähnt. Einige Diazoniumsalze sichtlich der zuzugebenden Substratmengeri Vorsicht werden in vorteilhafterer Weise in Form eines Doppelwalten zu lassen. Apfelsäure oder deren Salze, NADH₂ salzes mit einem ■ anorganischen Halogenid, Sulfat ,und eine CO-Verbindung können im allgemeinen in 60 od. dgl. eines Metalls, wie beispielsweise Cadmium, ■einem molaren Verhältnis von 3C0 bis 5C0: 0,5 bis Mangan, Zink, Magnesium cd.dgl., beispielsweise 2: 30 bis 60, vorzugsweise 4CO: 1,8 : 40, verwendet Manganchlorid, Magnesiumchlorid, Cadmiumchlorid, werden. Apfelsäure kann in Form eines wasserlös- Zinkchlorid od. dgl., aus nachstehend noch näher liehen Salzes, beispielsweise in Form des Mono- oder erläuterten Gründen verwendet.
Dilithiumsalzes, Natrium- oder Kaliumsalzes, ein- 65 Eei der Messung der Menge der gebildeten Oxalrgesetzt werden. , essigsäure unter Verwendung eines Diäzoniumsalzes

Die Menge an MDH ist nicht kritisch, es ist lediglich ist es vorteilhaft, die Messung nach der Abstopplung

dafür Sorge zu tragen, daß ein nennenwerter Über- der enzymatischen und der Farbentwicklungsreaktion

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durchzuführen. Die enzymatische Reaktion kann durch Außer den vorstehend beschriebenen Agenden

Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen können erforderlichenfalls ein Abstoppmittel für die

Lösungsmittels, beispielsweise Methanol, Äthanol, Reaktion sowie ein inaktives Verdünnungsmittel ver-

Isopropanol u. dgl., und die Farbentwicklungsreaktion wendet werden.

durch Steuerung des pH-Wertes in dem Reaktions- 5 Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele

medium, im allgemeinen durch Zugabe einer organi- näher erläutert.

sehen und/oder anorganischen Säure, wie beispiels- _:

weise Essigsäure, Trichloressigsäure, Schwefelsäure, Beispiell

Salzsäure od. dgl., abgestoppt werden. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität

Im allgemeinen _W1rd die Messung nach Abstoppung xo _yQn Milchsäuredehydrogenase der Farbentwicklungsreaktion, die sich an die Abstoppung der enzymatischen Reaktion anschließt, 24,2 mg Tris(hydroxymethyl)-aminornethan, 26,8 mg durchgeführt. Wird jedoch 6-Benzamido-4-methoxy- Apfelsäure, 0,333 mg NADH₂, 0,5 mg des Doppelm-toluidindiazoniumchlorid oder das Doppelsalz die- salzes aus 6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidindiazoser Verbindung mit einem anorganischen Metallsalz 15 niumchlorid und Zinkchlorid, 10.0 mg MDH verwendet, dann können die vorstehend erwähnten (3860 m-I.U./g) und 2,0 mg Natriumpyruvat wurden zwei Reaktionen gleichzeitig abgestoppt werden, da in 3,0 ml destilliertem Wasser gelöst, worauf zu dieser der optimale pH-Wert der enzymatischen und der Lösung 1,0 ml einer Probelösung (1Ofach verdünnte Farbentwicklungsreaktion praktisch gleich ist und die Lösung der überstehenden Flüssigkeit eines homogebildete Oxalessigsäure schnell mit diesem Dia- 20 genisierten Schweineherzens) zugegeben wurde. Die zoniumsalz reagiert. Dementsprechend kann in diesem Mischung wurde bei 37° C 30 Minuten lang umgesetzt, Falle eine Mischung aus Alkohol und Schwefelsäure worauf 3,0 ml Äthanol und 1,0 ml 1 n-HCl zugefügt -oder Salzsäure mit einem Volumenverhältnis von wurden. Nach einer 10 Minuten dauernden Zentri- V_ 95 bis 99 : 5 bis 1 in vorteilhafter Weise als die Reaktion f ugierung mit 3000 Upm wurde die optische Dichte abstoppendes Mittel verwendet werden. 25 der überstehenden Flüssigkeit bei 520 πιμ in einem

Als erfindungsgemäß zu ,bestimmendes CO-Ver- Colorimeter bestimmt. bindung-NADH₂-Redoxenzym sei beispielsweise

Milchsäure dehydrogenase, «-Hydroxybuttersäure- . ■ . Beispiel2

dehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Triosephos- _Λ, „ , _. ; , .,

phatdehydrogenase, Glutaminsäuredehydrogenase od. so Verfahren zur Bestimmung der Aktivität

dgl. : erwähnt. Eine erfindungsgemäß verwendete von «-Hydroxybuttersauredehydrogenase

CO-Verbindung muß entsprechend dem zu bestim- 65 mg einer Mischung, die 2,42 g Tris(hydroxy-

menden CO-Verbindung-NDAH₂-Redoxenzym aus- methyl)-aminomethan, 2,68 g Apfelsäure, 33,3 mg

gewählt werden. " NADH₂, 1,0 g MDH (3860 m-I.U./g) und 246 mg

Als dem zu bestimmenden CO-Verbindung-NADH₂- 35 Natrium-a-ketobutyrat enthielt, wurden in 3 ml Redoxenzym entsprechende CO-Verbindung sei Brenz- destilliertem Wasser gelöst, worauf 1,0 ml einer Probetraubensäure (Milchsäuredehydrogenase), 1,3-Diphos- lösung (die gleiche wie im Beispiel 1) und anschließend phoglycerinsäure (Triosephosphatdehydrogenase), «- 0,5 mg des Doppelsalzes aus o-Benzamido^-methoxy-Ketoglutarsäure (Glutaminsäuredehydrogenase), a-Ke- m-toluidindiazoniumchlorid und Magnesiumchlorid tobuttersäure (a-Hydroxybuttersäuredehydrogenase), ₄₀ zugesetzt wurden. Die Mischung wurde 30 Minuten Acetaldehyd (Alkoholdehydrogenase) erwähnt. lang bei 37⁰C umgesetzt, worauf 3,0 ml Äthanol und

Diese Ketosäuren werden durch die entsprechenden .1,0 ml 1 n-HCl zugegeben wurden. Nach einer

Enzyme in die reduzierten CO-Verbindungen, wie .30 Minuten dauernden Zentrifugierung bei 3000 Upm

beispielsweise Milchsäure, Glycerinaldehyd-3-phos- wurde die optische Dichte der überstehenden Flüssig- C

phat, Glutaminsäure, «-Hydroxybuttersäure und Ätha- 45 keit bei 520 ΐημ in einem Colorimeter bestimmt, nol umgewandelt.

Erfindungsgemäß kann die enzymatische Aktivität _n . . .

aller CO-Verbindung-NADHp-Redoxenzyme auf ein- B e 1 s ρ 1 e l j '·...';

fache und exakte Weise bestimmt werden, ohne daß „ .. ...,._. , ., ....

dabei ein UV-Spektrophotometer verwendet wird; 50 . Präparat fur die Bestimmung der Aktivität

das erfindungsgemäße Verfahren ist auch dann be- . von Milchsäuredehydrogenase

quem durchzuführen, wenn eine große Anzahl von Tris(hydroxymethyl)-aminomethan 24,2 mg

Proben gemessen werden muß. Das erfindungsgemäß NADH₂ 0,333 mg

Bestimmungsverfahren ist insofern sehr bequem, als Apfelsäure 26,8 mg

es möglich ist, die gebildete Oxalessigsäure unter Ver- 55 o-Benzamido^-methoxy-

wendung eines Colorimeters oder visuell durch Ver- m-toluidindiazoniumchlorid .... 0,50 mg

gleich, der entwickelten Farbe mit einer Standard- MDH (3860 m-I.U./g.) 10,0 mg ,

farbkarte zu, messen. , : Natriumpyruvat 2,0 mg

Erfindungsgemäß verwendete Reaktionsmittel sind .-....■

folgende: . . . 60 Zu dieser Mischung wurde so viel Lactose zugegeben,

(1) eine CO-Verbindung, · ' 1 '. ί daß eine Tablette mit einem Gewicht von 80 mg er-

(2) NADH₂, . ' . halten wurde. . ■ . ·

(3) Apfelsäure oder deren Salz, Diese Tabeltte wurde bei ihrer Verwendung in

(4) MDH, 3,0 ml destilliertem Wasser aufgelöst, worauf zu dieser

(5) ein Diazoniumsalz, , 65 Lösung 1,0 ml einer Probelösung (beispielsweise eine

(6) eine Puffermischung, die so ausgewählt wird, daß 1Ofach verdünnte Lösung der überstehenden Lösung sie den pH-Wert in dem Reaktionsmedium eines homogenisierten Schweineherzens) zugesetzt während der Messung aufrechterhält. wurde. ■,.'.■

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Nach einer 30 Minuten dauernden Umsetzung bei Tablette B

38⁰C wurden 3,0 ml Äthanol und I₅OmI In-HCl Doppelsalz aus ö-BenzamiiuM-me-

zugegeoen. thoxy-m-toluidindiazoniumchlorid

Die Lösung wurde 10 Minuten lang bei 3000 Upm _und Manganchlorid 5 mg

zentrifugiert, worauf die optische Dichte der über- 5

stehenden Flüssigkeit bei 520 ΐημ. in einem Colorimeter Zu der vorstehend angegbenen Mischung wurde

bestimmt wurde. bis zu einem Gesamtgewicht derselben von 200 mg

Beispiel 4 Lactose zugegeben, worauf aus dieser Mischung

10 Tabletten hergestellt wurden, von denen jede

Präparat zur Bestimmung der Aktivität ₁₀ 20 mg wog.

von «-Hydroxybuttersäuredehydrogenase zur Verwendung wurde die Tablette A in 3,0 ml

Tablette A ' destilliertem Wasser aufgelöst, wobei der pH-Wert

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan 24,2 mg der Lö^sung erforderHchenfalls mit Natriumhydroxyd

96 8 mσ ^au* 7,4 eingestellt wurde. Darauf wurde 1,0 ml der

η τ« mo- *5 Probelosung (dieselbe wie im Beispiel 1) zugegeben,

MDH (3860 m-I U /g) 2 46 mg worauf die Tablette B zugefugt und aufgelöst wurde.

Natrium-«-ketobutyrat '.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 2,46 mg ^Nac* ^de^ ³S> Minuten dauernden Umsetzung bei 38°C

. wurden 3,0 ml Äthanol und 1,0 ml 1 n-HCl zugefügt.

Zu dieser Mischung wurde Lactose in einer solchen Nach einer 10 Minuten dauernden Zentrifugierung bei Menge zugegeben, daß das Gesamtgewicht einer ao 3000 Upm wurde die optische Dichte der überTablette, die nach einem herkömmlichen Verfahren stehenden Flüssigkeit bei 520 πιμ in einem Colorimeter hergestellt worden war, 80 mg betrug. bestimmt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität eines Carbonylverbindung-NADH₂-Redoxenzyms mit Ausnahme der Malat-Dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß eine Carbonylverbindung, ein reduziertes Nikotinamid-Adenindinucleotid, Apfelsäure oder eines ihrer wasserlöslichen Salze und Malat-Dehydrogenase in ein geeignetes Volumen einer das zu bestimmende Enzym enthaltenden Probelösung eingeführt werden, daß dadurch die beiden Enzymreaktionen des zu bestimmenden Enzyms und der Malat-Dehydrogenase in Gang gebracht werden und daß die Menge der dabei gebildeten Oxalessigsäure in bekannter Weise unter Verwendung eines Diazoniumsalzes kolorimetrisch bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Apfelsäure, die reduzierte Verbindung des Nicotinamid-Adenindinucleotids und die Carbonylverbindung in einem molaren Verhältnis von 300 bis 500:0,5 bis 2: 30 bis 60 und vorzugsweise ,in einem molaren Verhältnis von 400:1,8 : 40 verwendet werden.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Diazoniumsalz 6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid verwendet wird.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Diazoniumsalz ein, Doppelsalz aus 6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid und einem anorganischen Metallsalz verwendet wird.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als anorganisches Metallsalz Zinkchlorid verwendet wird.