DE1213641B

DE1213641B - Substrat zur bestimmung der konzentration des enzyms glutaminsaeure-oxylessigtransaminase in koerperfluessigkeiten

Info

Publication number: DE1213641B
Application number: DE19611213641
Authority: DE
Priority date: 1960-08-30
Filing date: 1961-06-03
Publication date: 1973-01-04
Also published as: US3069330A; DE1213641C2; GB925724A; DK103536C

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

GOIn

Deutsche Kl.: 421-3/54

Nummer: 1213 641

Aktenzeichen: W 30099IX b/421

Anmeldetag: 3. Juni 1961

Auslegetag: 31. März 1966

Die Erfindung bezieht sich auf ein bei der Bestimmung des Gehaltes von Körperflüssigkeiten an dem Enzym Glutamin-Oxalessig-Transaminase verwendbares Substrat.

Diese Enzym trägt seinen Namen, weil es die Geschwindigkeitkeit der reversiblen Umsetzung von L-Glutaminsäure mit Oxalessigsäure zu «-Ketoglutarsäure und L-Asparaginsäure, bei der gemäß nachstehendem Formelbild eine Aminogruppe von einem Molekül zum anderen verlagert wird, zu katalysieren vermag.

NH₂	0	O

CH COOH	- C-COOH ±1	C-COOH

CH₂	CH₂ COOH	CH₂

CH₂ COOH	Oxalessig	CH₂-COOH
L-Glutamin-	säure	Ä-Ketoglu-
säure		tarinsäure
		NH₂
		+ CH-COOH ι
		CH₂COOH
	L-Asparagin-

saure

Die Geschwindigkeit dieser Reaktion ist der Enzymkonzentration im Reaktionsmedium direkt proportional. Bekanntlich wird dieses Transaminaseenzym bei gewissen Zeilzerstörungsformen im Körper freigesetzt, und deshalb stellt die Messung der Enzymkonzentration ein wertvolles Mittel bei der Diagnose von Krankheiten, wie Myocardinfarkt, intrahepatärem Lymphom oder Karzinom, Hepatitis, Zirrhose u. dgl. dar, bei denen eine solche Zellzerstörung stattfindet. Dieses Enzym wird in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Liquor u. dgl., hinein freigesetzt und wird meistens im Blutserum, also der beim Zentrifugieren geronnenen, intakten Blutes erhaltenen flüssigen Fraktion, gemessen.

Alle zur Zeit bekannten Methoden zur Bestimmung der Transaminaseenzymkonzentration in Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blutserum, hängen von der Messung der Geschwindigkeit der vorstehend angegebenen Reaktion ab, indem die Geschwindigkeit der Bildung oder des Verschwindens einer der an der Reaktion teilnehmenden Verbindungen gemessen wird. Ein heutzutage benutztes Verfahren beruht auf der Tatsache, daß sich die Oxalessigsäure, die durch Substrat zur Bestimmung der Konzentration

des Enzyms Glutamin-Oxalessig-Transaminase in Körperflüssigkeiten

Anmelder:

Warner-Lambert Pharmaceutical Company,

Morris Plains, N. J. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr. phil. G. Henkel

und Dr. rer. nat. W.-D. Henkel Patentanwälte,

München 9, Eduard-Schmid-Str. 2

Als Erfinder benannt:
Arthur Lawrence Babson,
Morris Plains, N. J. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 30. August 1960 (52 793)

Umsetzung zwischen «-Ketoglutarsäure und L-Asparaginsäure in Gegenwart der Glutamm-Oxalessig-Trans-

ο aminase entsteht, in Gegenwart der Äpf elsäuredehydrogenase mit der reduierten Form des Coenzyme Diphosphopyridinnucleotid (DPNH) zum Diphosphopyridinnucleotid (DPN) und Äpfelsäure umsetzt. Da DPNH eine charakteristische Ultraviolettabsorptionsbande bei 340 πιμ besitzt, ist die Messung der Geschwindigkeit, mit der sich die optische Dichte ändert, der Oxalessigsäure-Bildungsgeschwindigkeit und damit der Konzentration der Glutamin-Oxalessig-Transaminase im untersuchten Blut direkt proportional. Dieses Verfahren ist zwar genau zuverlässig, verlangt aber zur Messung der optischen Dichte bei πιμ ein Ultraviolettspektrophotometer. Da kleine Laboratorien kein solches Gerät besitzen, findet dieses Verfahren nicht die weitverbreitete Anwendung, die für eine diagnostische Hilfe erwünscht ist.

Ein anderes im Gebrauch befindliches Verfahren hängt von der Umsetzung der (bei der vorerwähnten transaminasekatalysierten Reaktion) Oxalessigsäure mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin zu einem Dinitrophenylhydrazon der Oxalessigsäure ab, das Licht im sichtbaren Spektralbereich absorbiert. Diese Methode verlangt also zwar kein Ultraviolettspektrophotometer,

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leidet aber an dem Nachteil, daß auch die «-Ketoglu- werden kann, daß man die Farbtiefe mißt, die durch

tarsäure des Substrats ein Dinitrophenylhydrazon- Kupplung eines Azoniumsalzes mit der bei der Um-

derivat bildet, dessen Absorptionsbereich im sieht- setzung gebildeten Oxalessigsäure entwickelt wird,

baren Spektrum im allgemeinen mit dem des Dinitro- Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein

phenylhydrazons der Oxalessigsäure übereinstimmt. 5 kleines Volumen der zu untersuchenden Körper-

Daher gibt es wegen der optischen Dichte des Substrats flüssigkeit mit einem !.-Asparaginsäure und a-Keto-

eine hohe »Null«-Messung, und das Verfahren hängt glutarsäure enthaltenden Substrat inkubiert und da-

davon ab, daß kleine Unterschiede zwischen hohen nach ein Azoniumsalz zugesetzt, um eine sichtbare

Werten gemessen werden, was allgemein eine ungün- Färbung zu erzeugen, deren Dichte der Enzymkon-

stige Vorbedingung für die Erlangung genauer Ergeb- io zentration in der Körperflüssigkeit proportional ist.

nisse darstellt. Eine zweite und bevorzugte Ausführungsform der

Die zur Überwindung dieser Schwierigkeit vor- Erfindung besteht darin, daß eine kleines Volumen

genommenen Versuche waren nicht ganz erfolgreich. Körperflüssigkeit mit einem Substrat inkubiert wird,

Eine Begrenzung der «-Ketoglutarsäuremenge im das L-Asparaginsäure, «-Ketoglutarsäure und ein

Substrat läßt zwar die »Null«-Ablesung kleiner werden, 15 Azoniumsalz enthält, wobei Oxalessigsäurebildung und

erhöht aber die Ungenauigkeit, da womöglich nicht Färbungsentwicklung gleichzeitig vor sich gehen. Da

genügend Substrat zugegen ist. Bei allen enzymatischen eine sichtbare Färbung hervorgerufen wird, ist kein

Reaktionen und vor allem bei solchen mit Umkehr- kompliziert aufgebautes Ultraviolettspektrophotometer

reaktion kommt es darauf an, daß das Substrat in erforderlich, und da das Azoniumsalz nur mit der

großem Überschuß vorhanden ist. Eine andere Aus- 20 Oxalessigsäure kuppelt, wird eine hochgradige Meß-

führungsform arbeitet damit, das Oxalessigsäure- genauigkeit erzielt.

Dinitrophenylhydrazon mit Hufe eines Lösungsmittels, Das erfindungsgemäße Substrat eignet sich zur Bewie z. B. Toluol, aus dem Substrat zu extrahieren. Stimmung des Enzyms Glutamin-Oxalessig-Trans-Diese Maßnahme ist zwar theoretisch einwandfrei, aminase in jeder beliebigen Körperflüssigkeit einverlangt aber viele Handhabungsschritte und ist daher 25 schließlich Rückenmarksflüssigkeit, Blutserum u. dgl. für regelmäßige und schnelle Analysen durch kleine Da das Enzym am häufigsten im Blutserum bestimmt Laboratorien unpraktisch. wird, ist dieses die normalerweise für die Bestimmung

Daher bestand seit langem ein Bedarf für ein verwendete Flüssigkeit. Das Blutserum wird nach

schnelles und genaues Verfahren zur Bestimmung der üblichen Verfahren durch Zentrifugieren aus geron-

Konzentration des Glutamin-Oxalessig-Transaminase- 30 nenem, intaktem Blut abgetrennt.

Enzyms im Blutserum oder anderen Körperflüssig- Gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung

keiten, das als laufende Arbeit in kleinen Laboratorien besteht das Substrat für die vorerwähnte Bestimmung

von vergleichsweise unerfahrenem, technischen Per- der Glutamin-Oxalessigsäure-Transaminase aus einer

sonal und ohne notwendige Spezialausrüstung durch- gepufferten Mischung aus L-Asparaginsäure und

geführt werden kann. 35 «-Ketoglutarsäure, die einem kleinen Volumen der zu

Ein Hauptziel der Erfindung besteht daher in der untersuchenden Körperflüssigkeit zugesetzt wird. Das

Schaffung eines schnellen und genauen Verfahrens zur neue, erfindungsgemäße Substrat eignet sich zur

Bestimmung der Konzentration der Glutamin-Oxal- genauen Messung der Glutamin-Oxalessig-Transami-

essig-Transaminase in einer kleinen Menge Körper- nase in schon nicht mehr als 0,1 ecm Körperflüssigkeit,

flüssigkeit. 40 Das Substrat braucht nur «-Ketoglutarsäure und

Die Erfindung bezweckt fernerhin die Schaffung L-Asparaginsäure als aktive Bestandteile zu enthalten,

eines Verfahrens zur Bestimmung der Konzentration wobei letztere Säure entweder in reiner L-Form oder

der Glutamin-Oxalessig-Transaminase im Blutserum, als razemisches Gemisch, als als D,L-Asparaginsäure,

das als laufende Arbeit ohne Spezialausrüstung selbst zugesetzt sein kann. Auf die vorhandene Menge kommt

von unerfahrenem Personal durchgeführt werden kann. 45 es nicht entscheidend an, nur müssen beide Säuren in

Ein weiteres Erfindungsziel besteht in der Schaffung beträchtlichem Überschuß vorliegen,

eines Substrats, das zur Bestimmung der Konzentration Das gepufferte Substrat enthält auch alkalische

der Glutamin-Oxalessig-Transaminase in Körperflüs- Puffermaterialien, um die Eigenazidität des Substrats

sigkeiten dient. zu überwinden und den pH-Wert während der Inku-

Weitere Erfindungsziele und -vorteile sind aus der 50 bation, in der die Oxalessigsäure freigesetzt wird,

nachstehenden, ins einzelne gehenden Beschreibung zwischen 6,5 und 8,0 und vorzugsweise bei 7 bis 7,5 zu

ersichtlich. halten. Zu den brauchbaren Puffern gehören Tri-

Erfindungsgemäß wird ein für die Bestimmung der natriumphosphat, Natriumbarbital, Trishydroxyme-

Konzentration des Glutamin-Oxalessig-Transaminase- thylaminomethan u. dgl.

Enzyms brauchbares Substrat geschaffen, das L-Aspara- 55 Bei einer wegen ihrer bequemen Anwendbarkeit

ginsäure, «-Ketoglutarsäure und einen Puffer, der den bevorzugten Art des gepufferten Substrats sind seine

pH-Wert der Körperflüssigkeit während der Messung Bestandteile zu einer Tablette formuliert, die auch

im Bereich von 6,5 bis 8 zu halten vermag, aufweist, noch neutrale, pharmazeutische Verdünnungsmittel,

und dessen Besonderheit darin besteht, daß es ein wie Lactose, Leucin, Stearinsäure, Polyvinylpyrrolidon

Azoniumsalz enthält, das bei einem pH-Wert von 60 u.dgl., enthält. Tabletten im Gewicht von etwa 20 bis

6,5 bis 8 mit Oxalessigsäure zu einem gefärbten Kupp- ,. 40 mg werden bevorzugt. Bei Verwendung eines lungsprodukt zu kuppeln vermag. ..-■ Substrats in Tablettenform wird die Tablette vor der Es wurde gefunden, daß die Geschwindigkeit der Zugabe der Körperflüssigkeit in etwas Wasser gelöst.

Umsetzung von L-Asparaginsäure mit «-Ketoglutar- Bei der Durchführung der Bestimmung wird die

säure, die durch das Enzym Glutamin-Oxalessig-Trans- 65 Mischung aus Substrat und Körperflüssigkeit eine

aminase in einer unbekannten Körperflüssigkeit kata- festgelegte Zeit lang bei konstanter Temperatur

lysiert wird und damit die Konzentration dieses zwischen etwa 25 und etwa 40⁰C inkubiert, um die Enzyms in dieser Körperflüssigkeit dadurch bestimmt gewünschte Umsetzung vor sich gehen zu lassen, bei

der die Oxalessigsäure freigesetzt wird. Temperatur und Dauer der Inkubation können variiert werden, wobei eine Dauer von 15 bis 30 Minuten bei etwa 37° C bevorzugt wird. Niedrigere Temperaturen verlangen längere Zeiten, während bei höheren Temperaturen eine schnellere Umsetzung erzielt wird. Zwecks Erzielung wiederholbarer Ergebnisse müssen natürlich bei allen Bestimmungen dieselben Inkubationsbedingungen innegehalten werden.

Bei Abschluß der Inkubation wird die inkubierte Mischung vorzugsweise auf eine Temperatur zwischen etwa 10 und etwa 20° C abgekühlt. Dieses Abkühlen ist zwar nicht von Bedeutung, aber erwünscht, da es dazu dient, die enzymatische Reaktion im Substrat beträchtlich zu verlangsamen und dadurch eine merkliche Bildung von zusätzlicher Oxalessigsäure während des Kupplungsschrittes zu verhindern. Das Herunterkühlen auf eine niedrigere Temperatur ist auch deshalb wünschenswert, weil das zugesetzte Azoniumsalz gegen Zersetzung gesichert wird.

Der Mischung wird nunmehr das Azoniumsalz zugesetzt, das mit der während der Inkubationszeit im Substrat entstandenen Oxalessigsäure kuppelt. Brauchbare Azoniumsalze sind solche, die mit Oxalessigsäure ein gefärbtes Kupplungsprodukt ergeben. Hierzu gehören beispielsweise

4-Amino-2,5-diäthoxybenzaniliddiazonium-

chlorid,

diazotiertes 2-Amino-4-chloranisol,

diazotiertes 5-Chlor-o-toluidin,

p-Chlor-o-toluidindiazoniumchlorid,

diazotiertes 4-Benzoylamino-2,5-dimethoxy-

anilin,

6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidindiazonium-

chlorid,

4-Benzamido-2,5-diäthoxyanilindiazonium-

chlorid,

tetrazotiertes o-Dianisidin u. dgl.

Erfahrungsgemäß sind 4-Amino-2,5-diäthoxybenzaniliddiazoniumchlorid und 6-Benzamido-4-methoxym-toluidindiazoniumchlorid für die Zwecke der Erfindung besonders wirksame Salze, da sie mit Oxalessigsäure ausgeprägt blau- bzw. rotgefärbte Kupplungsprodukte bilden. Auch hier kommt es nicht auf die absolute Azoniumsalzmenge an, es muß vielmehr ebenfalls nur in beträchtlichem Überschuß zugesetzt werden.

Zweckmäßigerweise wird das Azoniumsalz mit einem geeigneten, alkalischen Puffer ähnlich den im Substrat verwendeten Puffern gemischt, um einen günstigsten pH-Wert für die Kupplungsreaktion sicherzustellen. Beim bevorzugten 4-Amino-2,5-diäthoxybenzaniliddiazoniumchlorid ist ein pH-Wert von etwa 9 und beim 6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid ein pH-Wert von etwa 7,4 besonders wirksam. Erfahrungsgemäß verdient Natriumbarbital den Vorzug, jedoch sind auch andere alkalische Puffer, wie z. B. Trinatriumphosphat, Trishydroxymethylaminomethan u. dgl., verwendbar.

Das Azoniumsalz nebst alkalischem Puffer kann zusammen mit üblichen, neutralen, pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, wie sie auch bei den Substrattabletten verwendet werden, zu Tabletten formuliert werden. Im allgemeinen werden Tabletten von 20 bis 40 mg Gewicht bevorzugt. Diese physikalische Form von Azoniumsalz und Puffer stellt eine sehr bequeme Gebrauchsform dar.

Nach dem Zusatz des Azoniumsalzes läßt man die Mischung einige Minuten stehen, damit die Kupplungsreaktion vor sich gehen kann, und dann wird sie entweder mit einer Standard-Farbkarte verglichen oder zwecks Messung der optischen Dichte mittels normalem Spektrophotometer in eine Küvette eingebracht. Die Konzentration der Glutamin-Oxalessig-Transaminase in der unbekannten Körperflüssigkeit wird durch einen Vergleich der entstandenen und visuell

ίο oder mittels Spektrophotometer bestimmten Färbung mit Farbnormen bestimmt, die nach der Testmethode an Hand von Flüssigkeiten mit bekannten Enzymgehalten erzielt werden.
Diese vorstehend beschriebene Untersuchungsweise gemäß erster Ausführungsform der Erfindung stellt zwar ein genaues und wirksames Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der Glutamin-Oxalessig-Transaminase in Körperflüssigkeiten dar, kann aber erfahrungsgemäß im Sinne einer zweiten und bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ohne wesentliche Beeinträchtigung der Meßgenauigkeit noch weiter vereinfacht werden. Diese zweite Ausführungsform der Erfindung beruht auf der Schaffung eines gepufferten Substrats, das aus einer Mischung von L-Asparaginsäure, «-Ketoglutarsäure und einem Azoniumsalz besteht und bei der Inkubation mit einer Körperflüssigkeit gleichzeitig mit der Oxalessigsäurebildung die Entwicklung eines gefärbten Kupplungsproduktes zwischen der Oxalessigsäure und dem Azoniumsalz hervorruft.

Dieses Substrat gemäß zweiter Ausführungsform der Erfindung besteht aus «-Ketoglutarsäure, L-Asparaginsäure (entweder in reiner L-Form oder als racemisches D,L-Gemisch), einem Azoniumsalz, das in dem pH-Bereich, in dem die durch Glutamin-Oxalessig-Transaminase katalysierte Umsetzung zwischen L-Asparaginsäure und «-Ketoglutarsäure vor sich geht, mit Oxalessigsäure zu kuppeln vermag, und geeigneten, alkalischen Puffersubstanzen. Der Zusatz der Puffersubstanzen dient dazu, die Acidität des Substrats zu überwinden und den pH-Wert während der Inkubation zwischen etwa 6,5 und 8,0 und vorzugsweise zwischen 7 und 7,5 zu halten, wo der günstigste pH-Wert für die durch Glutamin-Oxalessig-Transaminase katalysierte, enzymatische Reaktion zwischen l-Asparaginsäure und «-Ketoglutarsäure liegt. Brauchbare Puffer sind beispielsweise Trinatriumphosphat, Natriumbarbital, Trishydroxymethylaminomethan u. dgl.
Auf die im Substrat enthaltene Menge der aktiven Bestandteile kommt es nicht an; sie müssen lediglich in beträchtlichem Überschuß vorhanden sein.

Bei der Formulierung eines Substrats gemäß zweiter Ausführungsform der Erfindung ist es von Bedeutung, daß das verwendete Azoniumsalz innerhalb des vorstehend angegebenen pH-Bereichs für die enzymatische Reaktion mit Oxalessigsäure zu kuppeln vermag. Erfahrungsgemäß ist 6-Benzamido-4-methoxym-toluidindiazoniumchlorid ein besonders wirksames Azoniumsalz bei der Herstellung eines Substrats gemäß zweiter Ausführungsform der Erfindung, weil es bei einem pH-Wert zwischen 7 und 7,5 mit Oxalessigsäure ein rotgefärbtes Kupplungsprodukt bildet. Bei einer besonders wirksamen und sehr leicht verwendbaren Form des gepufferten Substrats werden die Bestandteile zusammen mit pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, wie Lactose, Stearinsäure, Polyvinylpyrrolidon u. dgl., zu Tabletten formuliert, die vorzugsweise je etwa 20 bis 40 mg wiegen.

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Bei der Bestimmungsdurchführung wird ein kleines Volumen verdünnt, in eine Küvette eingebracht, Volumen der zu untersuchenden Körperflüssigkeit, zwecks Absetzens irgendwelcher Niederschläge 5 Mibeispielsweise Blutserum, mit dem Substrat vermischt nuten lang stehengelassen und dann auf optische und eine festgelegte Zeit lang bei konstanter Tem- Dichte bei 630 ηιμ untersucht.

peratur im Bereich zwischen etwa 25 und etwa 40° C 5 Es können auch andere Farbentwicklertabletten inkubiert. Im allgemeinen wird eine Inkubations- formuliert werden, die an Stelle von 4-Arnino-2,5-diperiode von etwa 15 bis 30 Minuten bei etwa 37° C äthoxybenzaniliddiazoriumchlorid andere Diazoniumbevorzugt. Während der Inkubation wird Oxalessig- salze, wie beispielsweise diazotiertes 2-Amino-4-chlorsäure in der Geschwindigkeit und dem Ausmaß anisol, diazotiertes 5-Chlor-o-toluidin, p-Chlor-o-tolufreigesetzt, wie dies der Konzentration der Glutamin- io idindiazoniumchlorid, 6-Benzamido-4-methoxy-m-tölu-Oxalessig-Transaminase in der Körperflüssigkeit ent- idindiazoniumchlorid, 4-Benzamido-2,5-diäthoxyanüinspricht. Gleichzeitig kuppelt die freigesetzte Oxal- diazoniumchlorid, tetrazotiertes o-Dianisidin und essigsäure mit dem im Substrat vorhandenen Azo- diazotiertes 4-Benzoylamino-2,5-dimethoxyanilin, entniumsalz zum gefärbten Kupplungsprodukt. Nach halten, und das Untersuchungsverfahren kann gemäß Abschluß der Inkubation wir die in der inkubierten 15 Beispiel I in gleicher Weise angewendet werden.
Mischung entwickelte Färbung mit einer Standard-Farbtafel verglichen oder in einem Spektrophoto- Beispiel II
meter gemessen.

Bei Benutzung des Substrats gemäß zweiter Aus- Es werden Substrattabletten von je 25 mg und

führungsform der Erfindung werden mit einer be- 20 folgender Zusammensetzung hergestellt:
merkenswert einfachen Untersuchungsweise genaue . r · -h* ■

Ergebnisse erzielt AUe bisher zur Verfügung stehenden „. ,. , , uewicnt m mg

Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der Tnnatnumphosphat 2,9

Glutamin-Oxalessig-Transaminase in Körperflüssig- ^Asparaginsäure 2,7

keiten erforderten die Verwendung von mindestens 35 «-^^et°g™^saure ■ · · · ·. W

zwei Reagenzsystemen, die während der Unter- ö-Benzamido-^methoxy-m-toluidm-

suchungsdurchführung getrennt zugesetzt werden diazoniumchlond 2,0

mußten. Das vorstehend beschriebene, neue und Polyvinylpyrrolidon 0,5

verbesserte Substrat gestattet die Konzentrations- lactose 15,1

bestimmung dieses Enzyms durch Zugabe nur eines 30 ^L-^^eucin· 1»4

einzigen Reagenzsystems zur Körperflüssigkeit. Daher 25,0

stellt dieses neuartige Substrat eine merkliche Verbesserung gegenüber bisher bekannten Substraten für Eine Substrattablette wird in 0,5 ecm Wasser aufdiese Bestimmung dar. gelöst und mit 0,2 ecm Blutserum versetzt. Die

Die nachstehenden Beispiele wurden zwecks Erläu- 35 Mischung wird 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, terung der Erfindung aufgeführt. Die inkubierte Mischung wird auf 10 ecm verdünnt,

in eine Küvette eingebracht und auf optische Dichte Beispiell ' bei 530 ηιμ untersucht.

Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen

Es werden Substrattabletten von je 25 mg Gewicht 40 Substrats ist eine schnelle, genaue und einfache und folgender Zusammensetzung hergestellt: Messung der Konzentration von Glutamin-Oxalessig-

r· „M,t ν, r™ Transaminase im Blutserum oder anderen Körper-Gewicht in mg „.. . . . ....._. , , . . . *

— ...,,. on flüssigkeiten möglich. Eine solche Genauigkeit und

Tnnatnumphosphat 2,9 Einfachheit war mit den bisher bekannten Verfahren

»,^Asparaginsäure 2,7 ₄₅ ^t _errei_chbar. Das Azoniumsalz gibt nur mit

«-Ketoglutarsäure υ,4 Oxalessigsäure und mit sonst keinem anderen, in der

Polyvinylpyrrolidon 05 j_nkubierten Mischung vorhandenen Bestandteil ein

^Lz? . ¹L'¹. gefärbtes Kupplungsprodukt. Dieses Kupplungspro-

L-.Leucin 1,4 _{dukt besitzt} obendrein eine sichtbare Färbung, so daß

25,0 50 nicht mit einem kompliziert aufgebauten Ultraviolettspektrophotometer gearbeitet zu werden braucht. Die

Es werden Farbentwicklertabletten von je 28 mg Substratzusammensetzung gemäß zweiter Ausführungs-Gewicht und folgender Zusammensetzung hergestellt: form der Erfindung stellt ein ungewöhnlich einfaches

„ . , . - " Substrat für diesen Test dar, da er durch bloßes

Gewicht in mg - _T , , . , -, . . '. ,., . _

at + · v> τ,·+ ι 01 " ⁵⁵ lokubieren des Substrats nut einem kleinen Volumen

Watnumbarbitai .. 21,5- Körperflüssigkeit und anschließendes Vergleichen der

4_:Ammo-2₅5-dia&oxybenzanilid- ^- entwickelten Färbung mit einer Farbnorm durch-

diazomumchlorid ,.... 4,0

Polyvinylpyrrolidon 0,5

L-Leucin 2,0 _6o

Claims

28,0 Patentansprüche:

Eine Substrattablette wird in 0,5 ecm Wasser auf- 1. Substrat zur Bestimmung der Konzentration

gelöst und mit 0,1 ecm Blutserum versetzt. Die des Enzyms Glutamin-Oxalessig-Transaminase in

Mischung wird 20 Minuten lang bei 37° C inkubiert. 65 Körperflüssigkeiten, bestehend aus L-Asparagin-

Die inkubierte Mischung wird auf 15° C abgekühlt säure, α-Ketoglutarsäure und einem Puffer, der

und mit einer Farbentwicklertablette versetzt. Nach den pH-Wert in der Körperflüssigkeit während

5 Minuten wird die Mischung auf ein passendes der Messung im Bereich von 6,5 bis 8,0 zu halten

9 10

vermag, dadurch gekennzeichnet, daß mido-4-methoxy-m-toluidindiazoniumchIorid bees ein Azoniumsalz enthält, das mit Oxalessigsäure steht.

im pH-Bereich von 6,5 bis 8 unter Bildung eines 3. Substrat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch

gefärbten Kupplungsprodukts zu kuppeln vermag. gekennzeichnet, daß es mit einem Verdünnungs-
2. Substrat nach Anspruch 1, dadurch ge- 5 mittel kombiniert ist, um eine Tablette mit einem

kennzeichnet, daß das Azoniumsalz aus 6-Benza- Gewicht im Bereich von 20 bis 40 mg zu bilden.

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