DE1673294C

DE1673294C - Verfahren zur Konzentrationsbestimmung von Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase in Körperflüssigkeiten

Info

Publication number: DE1673294C
Authority: DE
Inventors: Arthur Lawrence Morris Plane N.J. Babson (V.StA.)
Original assignee: Warner Lambert Pharmaceutical Co
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Publication date: 1971-12-30

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzen- gekennzeichnet ist, daß die so erhaltene gefärbte

trationshestimmung von Glutaminsäure-Oxalessig- Mischung vor der an sich bekannten Bestimmung

säure-Transaminase in KörperfRissigkeiten.bei welchem ihrer Farbtiefe mit einer Säure auf einen pH-Wert von

die Körperflüssigkeit etwa 15 bis etwa 30 Minuten lang nicht mehr als 2,5 eingestellt wird,

hei etwa 25 bis etwa 40"C mit einer Mischung aus 5 Durch die Erfindung wird erreicht, daß die Farh-

Λ-Ketoglutarsäure und 1- oder d,l-Asparaginsäure und intensität der gebildeten Diazofarbstofflösung über

einem den pH-Wert auf 7 bis 7,5 haltenden Puffer- längere Zeit stabil bleibt. Dies bedeutet, daß die kolo-

gemisch in Berührung gehalten wird, worauf man rimetrische Messung der Farbintensität nicht sofort

zwecks Entwicklung einer sichtbaren Färbung ein nach der Farbstoffbildung erfolgen muß Somit können

Dia/oniiimsalz zugibt. io also — da die gefärbten Proben längere Zeit stehen

Das Enzym Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Trans- hleihen können — zahlreiche Proben gleichzeitig auf

aminase (GOT) erhält seinen Namen wegen seiner ihren GO Γ-Gehalt untersucht werden.

Fähigkeit, die Reaktionsgeschwindigkeit der Umkehr- Im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung

reaktion: inkubiert man eine kleine Menge der zu prüfenden

Λ-KetoglLitarsäure + 1-A.sparaginsäure ^= ¹^ Flüssigkeit mit einem !-Asparaginsäure und x-Kelo-

, „, ... /-VI·.. glutarsäure enthaltenden Substrat und gibt danach ein

!-Glutaminsäure -|- Oxalessigsaure farbstoffbildendes Diazoniumsalz zu, wobei eine sieht-

katalytisch zu beeinflussen. bare Färbung entsteht, deren Intensität der Enzym-

Die Reaktionsgeschwindigkeit ist dabei der Kon- konzentration in der Körperflüssigkeit proportional

zentration an diesem Enzym im Reaktionsmedium -° ist. Da die entstehende Farbtönung im sichtbaren

direkt proportional. Spektralbereich liegt, benötigt man kein kompliziertes

Das Enzym (GOT) wird bekanntlich im Körper bei UV-Spektralphotometer. Da das Diazoniumsalz ledigbestimmten Formen von Zellzerstörung freigesetzt, Hch mit der Oxalessigsaure reagiert, gestattet das Ver- und daher bietet seine Gehaltsbestimmung eine wert- fahren gemäß der Erfindung eine sehr genaue Messung, volle Hilfe bei der Diagnose von Krankheiten mit der- 35 Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Beartigem Zcllverfall, wie z. B. Myokardinfarkten, intra- Stimmung des Enzyms Glutaminsäure-Oxalessigsäiirehepatären Lymphomen und Carcinomen, Hepatitis, Transaminase in jeder beliebigen Körperflüssigkeit ein-Zirrhosc u. dgl. Das Enzym wird in Körperflüssig- schließlich RückenmarkHüssigkeit, Blutserum u. dgl. keilen, wie Blut, Rückenmarksflüssigkeit u. dgl., frei- Da das Enzym meist im Blutserum enthalten ist, argesetzt und meist im Blutserum, d. h. in dem beim Zen- 3° beitet man auch im vorliegenden Verfahren vorzugstrifugicreii von geronnenem Vollblut gewonnenen weise mit dieser Körperflüssigkeit. Man erhält das flüssigen Anteil, bestimmt. Blutserun· in üblicher Weise durch Abzentrifugieren

Die Bestimmung der Konzentration an GOT in aus geronnenem Vollblut.

Körpcrflüssigkeitcn, wie Blut, beruht üblicherweise auf Als Substrat für die geschilderte GOT-Bestimmung einer Messung der Reaktions-Geschwindigkeit der ge- 35 dient im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung nannten Reaktion; hierbei wird die Geschwindigkeit eine gepufferte Mischung von !-Asparaginsäure und bestimmt, mit der einer der Reaktionsteilnehmer ge- «-Ketoglutarsäure, die man der zu prüfenden Körperbildet oder verbraucht wird. flüssigkeit in kleiner Menge zusetzt. Mit dem erfin-

Aus der USA.-Patentschrift 3 069 330 ist ein Ver- dungsgemäßen Verfahren läßt sich eine genaue Transfahren zur Bestimmung von GOT in Körperflüssig- 40 aminase-Bestimmung in nur 0,1 ml Körperflüssigkeit keiten bekannt, bei dem in der eingangs geschilderten durchführen. Das benutzte Substrat braucht als Aktiv-Weise vorgegangen wird. Nachteilig an dem bekannten bestandteile nur «-Ketoglutarsäure und I-Asparagin-Verfahren ist jedoch, daß die Messung der Farbinten- säure entweder in reiner Form oder als Racemat, d. h. sität der gebildeten Diazofarbstofflösung unmittelbar als d,!-Asparaginsäure, zu enthalten. Auf die annach Bildung des Farbstoffs erfolgen muß, da die In- 45 wesenden Mengen kommt es nicht an. nur müssen tensität beim Stehenlassen der Probe zunimmt. Das beide in beträchtlichem Überschuß vorliegen.
Ergebnis sind Fehlmcssungen, die zu hohe GOT-Werte Das gepufferte Substrat enthält auch noch alkalische vortäuschen. Puffersubstanzen, um ihm die Azidität zu nehmen und

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, das bc- seinen pH-Wert während der Inkubation, in der sich

kannte Verfahren zur Bestimmung von GOT in Kör- 50 die Oxalessigsaure bildet, zwischen etwa 6,5 und 8 und

perflüssigkciten so weit zu verbessern, daß die Messung vorzugsweise auf dem für die Enzymwirksamkeit opti-

der Farbintcnsität der gebildeten Diazofarbstofflösung malen Wert von 7 bis 7,5 zu halten. Als Puffersubstanz

nicht sofort nach der Farbstoffbildung erfolgen muß, eignen sich beispielsweise Trinatriumphosphat, Natri-

•ondern einige Zeit ausgesetzt werden kann. umbarbiturat,Tris(hydrojiymcthyl)aminomelhanu.dgl.

Es wurde nun gefunden, daß sich die gestellte Auf- 55 Man kann die Substratbcstandtcile entweder in einer

gäbe lösen laut, wenn man die gebildete Diazofarb* wäßrigen Lösung ansetzen oder zusammen mit einem

stofflösiing vor der Messung der Farbintensität an- neutralen pharmazeutischen Füllmittel wie Laktose,

säuert. Leucin oder Stearinsäure !tablettieren. In letzterem Fall

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren löst man das Substrat natürlich vor der Umsetzung mit

zur Kon7cntru(ionsbestimmung von Glutaminsäure- βο der Körperflüssigkeit in wenig Wasser auf.

Oxalessigsäurc-Transaminase in KürpcrflUssigkeitcn, Erfahrungsgemäß ist ein Zusatz eines Schutzkolloi-

bei welchem die Körperflüssigkeit etwa 15 bis etwa des, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon, zum Substrat bc-

30 Minuten lung bei etwa 25 bis etwa 4O⁰C mit einer sonders günstig.

Mischung uns «-Ketoglutarsäure und 1· oder d,l-Aspa- Der Vorteil dieser Polyvinylpyrrolidon-Zugabe zum

raginsäure und einem den pH-Wert auf ' bis 7,5 hai· 63 Substrat liegt darin, daß das zugesetzte Polyvinylpyrro*

tenden Puffcrgcmisch in Berührung gehalten wird, lidon den Farbstoff stabilisiert, der bei der Kupplung

worauf man zwecks Entwicklung einer sichtbaren des als Farbentwickler zugegebenen Diazoniumsalze»

Färbung ein Diazoniumsalz zugibt, welches dadurch mit der bei der Inkubation des PrUfgemisches im Sub'

strat entstehenden Oxalessigsäure sich bildet. Der gebildete Farbstoff neigt nämlich bei hohen Enzynikon/.'iurationen dazu, sich aus der Lösung abzuscheiden, wodurch natürlich die Ablesung ungenau wird. Wenn man aber dem Suhstrat Polyvinylpyrrolidon zusetzt, wirkt es als Schuukolloid und stabilisiert ilen gebildeten Farbstoff im Medium, so daß man die l'arbliefe zuverlässig und genau bestimmen kann.

Uei der Durchführung des erlindungsgemäßen Verfahrens wird die Mischung aus Substrat und Körper-Ilüssigkeil 15 his 30 Minuten lang auf konstanter Temperatur im Bereich zwischen etwa 25 und etwa 40' C inkubiert, damit die erwünschte Umsetzung vor sich geht und die Oxalessigsäure in Freiheit gesetzt wird. Inkubationstemperatur und -dauer sind an sich variabel, wobei jedoch eine 15 bis 30 Minuten währende Inkubation bei 37°C bevorzugt wird. Niedrigere Temperaturen verlangen ängerc und höhere Temperaturen kürzere Inkubationszeiten. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, sollten bei allen Bestimmungen ao gleichartige Inkubationsbedingungen eingehalten werden.

Falls das farbentwickelnde Diazoniumsalz bei der Temperatur, bei der die Inkubation durchgeführt wird, ungenügend stabil ist, kühlt man die inkubierte as Mischung nach Beendigung der Inkubation zweckmäßigerweise auf etwa 10 bis etwa 20 C ab. Ein solches Abkühlen ist auch dswegen zweckmäßig, weil es eine beträchtliche Verlangsamung der enzymatKchen Umsetzung im Substrat hervorruft und dadurch eine nennenswerte Bildung von wei-.erer Oxalessigsäure während der Kupplungsreaktion verhindert. Ein Abkühlen auf niedrigere Temperatur ist auch dann zweckmäPig, wenn das zugesetzte Diazoniumsalz gegen Zersetzung stabilisiert werden soll.

Nach dem Abkühlen gibt man dann das farbentwickelnde Diazoniumsalz zu, das mit der während der Inkubationsperiode im Substrat gebildeten Oxalessigsäure kuppelt. Zu den Diazoniumsalzen, die sich zur Bildung eines Kupplungsfarbstoffcs mit Oxalessig- <> säure eignen, gehören beispielsweise

4-Amino-2,5-diäthoxybenzaniliddiazoniumchlorid,

diazotiertes 2-Amino-4-chloranisol,

diazotiertes 5-Chlor-o-toluidin,

p-Chlor-o-toluidindiazoniumchlorid,

diazotiertcs 4-Benzoyliimin-2,5-dimcthoxyanilin,

o-Benzamido-^methoxy-m-toluidindiazoniiimchlorid,

4-Bcnzamido-2,5-diäthoxyanilindiazonium-

chlorid, ,.

tctrazoticrtes o-Dianisidin u. dgl.

Erfahrungsgemäß sind 4 - Amino · 2,5 - diäthoxybenzaniliddiazoniumchlorid und 6 · Uenzaniido* 4 · mcthoxy - m - toluidindiazonitiinchlorid für die ·><· Durchführung des Verfahrens gemitli der Erfindung besonders geeignet, da sie mit Oxalessigsäuie ausgeprägt blaue bzw. rote Kupplungsfarbstnffe bilden.

Die Verwendung von 6 - Benzamide * 4 · methoxy· nvloliiidindiazoniumchlorid ist außerdem auch noch es deshalb besonders vorteilhaft, weil es mit der gebildeten Oxalessigsäure bei dem pH-Wert, bei dem Trans· nt»« iiseaktivität am höchsten ist, kuppelt. Da es außerdem auch stabil genug ist, um bei der Inkubationstemperatur von 37"C angewandt werden zu können, braucht man das Reaktioiihgemiseh vor Zugabe des farbentwiekelnden Diazoniumsalze* nicht abzukühlen. Schließlich besitzt die sich bildende Farbe auch noch ein breites Absorplionsmaximuin, das sich leicht kolorimetrisch auswerten läßt.

Die günstigsten pH-Werte für die Kupplung liegen bei etwa ¹J für das 4-Aininu-2,5-diälhnxyhenzaniliddiazoniumchlorid und bei etwa 7,4 für das 6-Ilen/. amido-4-methoxy-ni-toluidindiazoniunichlund. Falls ein Puffer benötigt wird, benutzt man vorzugsweise Na'riumbarbiuirai, kann aber auch, wie bereu·, gesagt, mit anderen alkalischen PufTersubstanzeii wie Trmatriumphocplut, Tris( hydroxy met hy I Jaminomethan u. dgl. arbeiten.

Nach Zugabe des Diazoniumsalze* läßt man die Mischung einige Minuten stehen, damit die Kupplungsreaktion vor sich gehen kann. Hierauf wir.l die Intensität der gebildeten Farbstofflösung durch Zugabe einer verdünnten Säure stabilisiert, indem der pH-Wert auf nicht mehr als 2,5 eingestellt wird. Zum Stabilisieren eignen sich vorzugsweise Mineralsäuren, wie Salz-, Schwefel-, Phosphor- oder Salpetersäure u. dgl. Im allgemeinen verwendet man die jeweilige Säure in Form einer 0,01- bis 0,05normalen wäßrigen Lösung in einer solchen Menge, daß sich ein pH-Wert von etwa 1 bis 2 einstellt. Man kann auch mit organischen Säuren, wie Essig- oder Benzoesäure, stabilisieren, muß sie aber in höherer, z. B. !normalen Konzentration einsetzen. Durch die Säurezugabe wird tue Farbintensität zwar stabilisiert, gleichzeitig aber auch in ihrer Intensität geschwächt. Diese Schwächung läßt sich aber durch Zusatz eines nichtionischen oberflächenaktiven Stoffes wiederaufheben. Hierfür geeignete Stoffe sind Polyoxyäthylcnrvbitanmonoolcate, äthoxylierte Fcttalkoholc, älhoxylicrtc Fettsäuren oder äthoxylierte Octylphenole. Wegen inrer leichten Mischbarkeit mit Wasser verdienen im allgemeinen mit 6 bis 10 Mol Äthylenoxyd kondensierter Tridecylalkohol oder mit 40 Mol Äthylenoxyd kondensiertes Octylphenyl den Vorzug. Man kann diese oberflächenaktiven Stoffe in einer Konzentration von 0,5 bis 1 Gewichtsprozent der verdünnten Säurelösung zusetzen. An Stelle c'.er vorstehend aufgezählten oberflächenaktiven Stoffe eignen sich auch viele andere nichtionische Stoffe dieser Art, wie sie üblicherweise in der kosmetischen und pharmazeutischen Technik verwendet werden. Die äthoxylierten Fcltalkoholc, die äthoxylierten Octylphenole und die Polyoxyäthylcnsorbitanmonooleate sind im Handel erhältlich.

Durch die Zugabe der wät'rigen Säure oder einer wäL'rigen Säurclösung mit einem Gehalt an einem geeigneten nichtionischen oberflächenaktiven Stoff erzielt man eine beachtenswerte Stabilisierung der Farbintensität, so daß selbst hei laiigzeitigcm Stehenlassen keine wesentliche Änderung des Absorptionsvermögens eintritt.

Falls mit einem farbentwickclnikn Diazoniumsuk gearbeitet wird, das bei seiner Herstellung durch Ausfällen beispielsweise als Zinkchloriddoppelsalz oder sonstiges Schwermetall*»!/, stabilisiert wurde, so ist es höchst vorteilhaft, einen Komplex· oder Chelatbildner zuzugeben, der mit dem vorhandenen Zink* oder Schwermetallion einen Komplex bilden kann, da dadurch bei Zugabe der Diuzoniumfarbstoffkupplungskomponente zum inkubierten Substrat eine Lösungstrübung vermieden wird.

Hei einer vorteilhaften Ausführungsfarm des Verfahrens gemäß der llrlindung werden bei 37⁰C 6,2 ml Serum mil I₁OmI Substrat vereinigt, worauf die ertialicnc Mischung bei dieser Temperatur genau 20 Minuten lang inkubiert wird. Danach wird 1 ecm Kupplungskomponente zugesetzt, die Gesamtmischung 10 Minuten lang auf 37°C gehalten, danach mit JO ecm in vorstellender Weise angesetzter verdünnter wäßriger Saure versetzt und schließlich die Absorption der gebildeten i^;arbstofflösung bei 530 ηψ festgestellt.

Die Tninsamiiiaseaktivilüt des Serums wird an Hand einer Eichkurve bestimmt.

Um den Einfluß des Süurezusaizes und gegebenenfalls des Zusatzes eines nichlionischen oberflächenaktiven Stoffes (Verdünnungsmittel) auf die Stabilität der Farbintensität zu erläutern, sind in der folgenden Tabelle die Ergebnisse von Vergleichswerten angegeben. Die verdünnte Säure wurde jeweils in solcher Menge zugesetzt, daß ein pH-Wert unter 2,5 erreicht wurde.

Einfluß von Verdünnungsmitteln auf die Färbungsstabilität

Verdünnungsmittel zu Beginn

Optische Dichte bei 530 ηιμ I nach 30 Minuten I nach 60 Minuten

Wasser

0,02 n-HCl

0,02 n-HCl +
0,5"/_cälhoxylierter
FclUlkohol

Probe 1
Probe 2
Substrat

0,392
0,392
0,070

0,336
0,344
0,062

0,388
ü,392
0,058

0,448
0,449
0,097

0,332
0,345
0,062

0,385
0,394
0,060

0,512 0,516 0,128

0,336 0,342 0,063

0,385 0,392 0,061

Aus diesen Tabellenwerten ergibt sich klar, daß durch die Zugabe von verdünnter Säure mit oder ohne Gehalt an einem nichlionischen oberflächenaktiven Stoff eine merkliche Erhöhung der Stabilität der Endfarbintensität erzielt wird. Man erkennt fernerhin, daß Säure als alleiniger Zusatz zwar eine Stabilisierung, gleichzeitig aber auch eine Schwächung der Farbinlcnsität hervorruft und letztere also durch Anwendung eines nichtionischen oberflächenaktiven Stoffes leicht rückgängig gemacht wird.

Man kann auch mit Kupplungskomponentenlösungen arbeiten, die andere farbbildende Diazoniumsalze als die vorstehend angegebenen enthalten.

Das folgende Beispiel soll die im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung verwendeten Substrate und Reagenslösungen näher erläutern.

Beispiel

Ein für das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren geeignetes Substrat stellt man in der Weise her, daß man

146,1 mg »-Ketoglutarsäure,
532,4 mg !-Asparaginsäure,

5,68 g Na₂HPO₄,

2 g Polyvinylpyrrolidon und

0,2 g des Tetranatriumsalzes der
Äthylendiaminlelracssigsäurc

in 50 ml Wasser auflöst und die Lösung dann mit Wasser auf 200 ecm auffüllt. Die so erhaltene, gepufferte Lösung weist tiincn pH-Wert von 7,4 auf.

Weiterhin setzt man eine Kupplungskomponente aus 125 mg 6 - Bcnzamififl - 4 - mcthoxy - m - loluidindia/nniumchlorid und 25 ml destilliertem oder entsalztem Wasser an. An Stelle dieses Diazoniumsalzes kann man als Kupplungskomponenten auch andere Verbindungen dieser Art, wie z. B.

diazotiertes 2-Amino-4-chloranisol, diazotiertes 2-Amino-4-nitroanisol, diazotiertes 5-Chlor-o-toluidin, p-Chlor-o-toluidinazoniumchlorid,

diazotiertes 3-Chlor-4-benzamido-5-methoxyanilin,

4-Benzamido-2,5-diäthoxyani^i;,ndiazoniumchlorid,

tetrazotiertes o-Dianisidin,

tetrazotiertes 6-Dianisidin (3,3'-Dimethoxybenzidin) und

diazotiertes 4-Benzoylamino-2,5-dimethoxyanilin

verwenden.

Zur Herstellung der erfindungsgemäS benutzten verdünnten Säure werden 1.7 ml konzentrierte Salzsäure, ml 70°/₀ wäßrige Lösung von mit 6 bis 10 Mol Äthylenoxyd kondensiertem Tridecylalkohol oder von mit 40 Mol Äthylenoxyd kondensiertem Octylphenol und 1000 ml destilliertem Wasser zusammengegeben.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung von Glutaminsäure - Oxalessigsäure - Transamirtase in Körperflüssigkeiten, bei welchem die Körperflüssigkeit etwa 15 bis etwa 30 Minuten lang bei etwa 25 bis etwa 40°C mit einer Mischung aus

niit

«-Ketoglutarsäure und 1- oder d,l-Asparaginsäure und einem den pH-Wert auf 7 bis 7,5 haltenden Puffergemisch in Berührung gehalten wird, worauf man zwecks Entwicklung einer sichtbaren Färbung ein Diazoniumsalz zugibt, dadurchgekennzeichnet, daß die so erhaltene gefärbte Mischung vor der an sich bekannten Bestimmung ihrer Farbtiefe mit einer Säure auf einen pH-Wert von nicht mehr als 2,5 eingestellt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die pH-Einstellung mit einer Mineralsäure vornimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mineralsäure in einer Konzentration von 0,01- bis 0,05normal anwendet.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zur pH-

Einstellung verwendete Mineralsäure einen nichtionischen oberflächenaktiven Stoff enthält.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung einer 0,02normalen Mineralsäure der nichtionische oberflächenaktive Stoff aus einem äthoxylierlen Fettalkohol, äthoxyliertem Octylphenol oder Polyoxyäthylcnsorbitan-oleat besteht, welche in einer Konzentration von 0,5 bis 1 Gewichtsprozent zugesetzt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als äthoxylierten Fettalkohol mit 6 bis 10 Mol Äthylenoxyd kondensierten Tridecylalkohol verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Octylphenol mit 40 Mo Äthylenoxyd kondensiertes Octylphenol 'verwendel