DE3909530C2

DE3909530C2 -

Info

Publication number: DE3909530C2
Application number: DE19893909530
Authority: DE
Inventors: Rolf D. Prof. Dr. Schmid; Jong Min Dr. Kim; Masayasu Dr. 3300 Braunschweig De Suzuki
Original assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Current assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Priority date: 1989-03-22
Filing date: 1989-03-22
Publication date: 1992-01-02
Also published as: DE3909530A1

Description

Es ist bereits ein Verfahren zur Bestimmung von Hypoxanthin in wäßrigem Medium in Gegenwart von Sulfit und Xanthinoxi dase bekannt, bei dem der Verbrauch an Sauerstoff manometrisch ermittelt wird; vgl. J. Biol. Chem., 233 (1958) 1578-1580. Die Nachweisgrenze bei diesem Stand der Technik dürfte bei 10^-6 M liegen.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, den bekannten Stand der Technik dahingehend zu verbessern, daß man auch noch geringere Xanthin- oder Hypoxanthinkonzentrationen nachweisen kann, und zwar vorzugsweise quantitativ.

Dazu wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Bestimmung von Xanthin oder Hypoxanthin, insbesondere in Nahrungsmitteln, bei Konzentrationen kleiner etwa 0,1 µM in wäßrigem Medium in Gegen wart von Xanthinoxidase und gezielte Zugabe von Sulfit vorge schlagen, bei dem man bei einer Sulfitkonzentration im Bereich von 10 bis 150 mM arbeitet, die zu einem überstöchiometrischen Sauerstoffverbrauch führt, und den Verbrauch an gelöstem Sauerstoff mit Hilfe einer Sauerstoffelektrode ermittelt und daraus die Menge und/oder Konzentration an Xanthin oder Hypoxanthin ermittelt.

Wenn man erfindungsgemäß im Unterschied zum bekannten Stand der Technik nicht den Sauerstoffverbrauch in der Gasphase, sondern im flüssigen Medium mit Hilfe einer Sauerstoffelek trode ermittelt, kann man von dem Umstand Gebrauch machen, daß die Rate des Sauerstoffverbrauchs exponentiell (und nicht linear) von der Sulfitkonzentration abhängt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann man beispielsweise mit einer Clark- oder einer Mikro-Sauerstoffelektrode durchführen.

Vorzugsweise arbeitet man in Gegenwart von Chelatbildnern, wie Ethylendiamintetraessigsäure, Histidin oder Tyrosin. Mit derartigen Chelatbildnern läßt sich der Einfluß von Metallionen unterdrücken.

Man kann das erfindungsgemäße Verfahren auch unter Lichtaus schluß durchführen. Dadurch läßt sich der Einfluß anderer in Gegenwart von Licht oxidierbarer Substanzen unterdrücken.

Wegen der enormen Herabsetzung der Nachweisgrenze läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft zur Hypoxanthin bestimmung in Fisch und Fleisch als Nahrungsmitteln oder in Körper- oder Gewebeflüssigkeiten einsetzen.

Nachstehend wird die Erfindung durch Figuren und Beispiele näher erläutert.

Fig. 1 zeigt den Einfluß von Sulfit auf den Sauerstoffver brauch bei der Hypoxanthinoxidation.

Fig. 2 zeigt den Einfluß des pH-Wertes auf den Sauerstoff verbrauch bei der Hypoxanthinoxidation. Die Natriumsulfitkon zentration betrug 25 mM bei der Kurve mit weißen Kreisen.

Fig. 3 zeigt den Einfluß von Natriumsulfit auf den Sauer stoffverbrauch bei der Hypoxanthinoxidation. Die Hypoxanthin- Mengen, die für einen Verbrauch von 1 mg O₂/l bis zum Gleich gewicht erforderlich waren, wurden aus Eichkurven erhalten, die unter Reaktionsbedingungen ermittelt wurden. Die EDTA-Kon zentration betrug 10 mM (weiße Kreise) bzw. 2 mM (schwarze Kreise). Ohne Sulfit wurde ein geringer Sauerstoffverbrauch bei 10 mM EDTA bis zu einer Hypoxanthinkonzentration von 25 µM beobachtet.

Fig. 4 zeigt eine Standardkurve für Hypoxanthin ohne Sulfit.

Fig. 5 zeigt eine Standardkurve für Hypoxanthin mit 25 mM Sulfit.

Fig. 6 zeigt eine Standardkurve für Hypoxanthin mit 75 mM Sulfit.

Fig. 7 zeigt eine Standardkurve für Hypoxanthin mit 150 mM Sulfit.

Beispiel 1 1.1. Materialien und Methoden 1.1.1. Reagenzien

Xanthinoxidase (EC 1.2.3.2., aus Kuh milch) wurde von Boehringer Mannheim bezogen. Natriumsulfit und Hypoxanthin stammten von E. Merck, Xanthin von Sigma. Die anderen Reagenzien besaßen Reinheitsgrade für die Ana lyse oder das Labor. Während des gesamten Experiments wurde ausschließlich destilliertes Wasser verwendet.

1.1.2. Messungen des Sauerstoffverbrauchs

Die Natriumsulfit- und Substratlösungen wurden vor ihrer Verwendung frisch hergestellt. Ein digitales Sauerstoffmeßgerät (Typ CG 867, Schott Instrumente, Hofheim) wurde für die Bestimmungen des gelösten Sauerstoffs eingesetzt. Der vom Sauerstoffmeß gerät erzeugte Stromfluß wurde mit einem elektronischen Auf schreiber (Typ 2045, Linesis, Selb) aufgezeichnet. Die Reak tionsmischung enthielt 0,1 M Tris-HCl-Buffer (pH 7,3, sofern nichts anderes vermerkt ist), wäßrige Natriumsulfit- und Substrat-Lösungen, jeweils 1,0, 0,5 bzw. 0,5 ml. Die Reak tionsmischung wurde in einem Glasröhrchen (Innendurchmesser 14 mm, 100 mm lang) in einem temperaturjustierten Wasser bad (Typ 000-8700, Haake, Karlsruhe) mit Luft gesättigt. Anschließend wurde die Sauerstoffelektrode in die Reaktions mischung eingetaucht. Wenn sich der Stromfluß stabilisiert hatte, wurden 4 µl einer 0,08 Einheiten (bezogen auf die Enzym-Beschreibung des Herstellers) enthaltenden Enzymlösung zu der Reaktionsmischung zugesetzt. Nachdem man mit der Hand gut durchgeschüttelt hatte, wurde der Sauerstoffver brauch aufgezeichnet.

1.2. Ergebnisse 1.2.1. Wirkung der Sulfit-Zugabe

Natriumsulfit wird norma lerweise verwendet, um gelösten Sauerstoff zu reduzieren. Wenn sie jedoch in nur niedriger Konzentration vorliegen, reduzieren Sulfit-Ionen Sauerstoff in Tris-HCl-Puffer mit stark verminderter Geschwindigkeit; dies gilt jedoch nicht für Kaliumphosphat-Puffer (nicht gezeigt). Die Fig. 1 zeigt die Wirkung der Sulfit-Konzentration auf den Sauerstoffver brauch bei 25 µM Hypoxanthin. Ohne Sulfit stellt sich nach einem Reaktionszeitraum von etwa 10 min ein Gleichgewicht zwischen Sauerstoffverbrauch und Sauerstoffdiffusion auf sehr hohem Niveau ein, das nahe dem Sättigungsgrad an gelö stem Sauerstoff lag. Mit steigender Sulfitkonzentration wurde das Gleichgewicht nach und nach, jedoch im großen Maße, zu einer geringeren Menge an gelöstem Sauerstoff ver schoben. Bei 25 mM Sulfit stellt sich innerhalb von 3 min ein Gleichgewicht unter 1 mg/ml an gelöstem Sauerstoff ein. Bis zu einer Konzentration von 25 mM Sulfit war die nicht enzymatische Reduktion von Sauerstoff nicht bedeutend. Bei 35 mM Sulfit kam es jedoch zu einem leichten Anstieg der nichtenzymatischen Reduktion von Sauerstoff, und diese könnte eine Bestimmung von Hypoxanthin in niedrigen Konzentrationen bis zu 1 µM stören (Daten nicht gezeigt). Die Verschiebung des Gleichgewichts durch die enzymatische Redoxreaktion betrug 0,5 bzw. 5,9 mg/l an gelöstem Sauerstoff bei Sulfit konzentrationen von 0 bzw. 25 mM.

1.2.2. Einfluß des pH

Xanthinoxidase aus Milch besitzt ein relativ breites pH-Optimum von 7 bis 9. In Gegenwart von 25 mM Sulfit wurde bei einem pH von 8,8 die Stimulierung des Sauerstoffverbrauchs zu einem großen Teil unterdrückt, während sich unter den experimentellen Bedingungen eine maximale Stimulierung bei pH 7,3 erzielen ließ, wie in Fig. 2 dargestellt. Deshalb wurden die weiteren Experimente unter Verwendung von Tris-HCl-Puffer, pH 7,3 durchgeführt.

1.2.3. Einfluß der Temperatur

Die Löslichkeit von Sauerstoff sinkt mit steigender Temperatur. Die Oxidation von Glukose durch Glukoseoxidase zeigt ein fast gleichmäßiges Temperatur- Optimum zwischen 30 und 60°C, da bei einem Anstieg der Temperatur die Abnahme der Konzentration an gelöstem Sauer stoff durch einen Abstieg der katalytischen Aktivität des Enzyms negativ kompensiert wird (Scott 1975). Wir untersuch ten den Einfluß der Temperatur auf den Sauerstoffverbrauch bis hinaus zu 30°C. Wie erwartet, stieg die Geschwindig keit des Sauerstoffverbrauchs mit dem Anheben der Temperatur. Bei 30°C konnte man einen geringfügigen Anstieg der Geschwin digkeit der nichtenzymatischen Reduktion von Sauerstoff beobachten, der jedoch für eine quantitative Bestimmung von Hypoxanthin vernachlässigbar ist. Bis 25°C war der Anstieg des nichtenzymatischen Verbrauchs von Sauerstoff nicht signi fikant. Da unter den experimentellen Bedingungen zwischen 20 und 30°C kein großer Unterschied im Sauerstoffverbrauch durch die Enzymreaktion beobachtet wurde, wurden die folgen den Experimente bei 20°C durchgeführt.

1.2.4. Einfluß des Substrats

Bei der Zersetzung von ATP akkumuliert Hypoxanthin merklich. Wenn man die Bestimmung auf der Basis von Harnsäure-Bildung durchführt, erhält man mit Xanthin als Substrat höhere Oxidationsraten als mit Hypoxanthin (Biochemica Information, Seiten 8485, Boehringer Mannheim, 1987). Dies ist nicht wünschenswert, wenn man die Bestimmung von Hypoxanthin für die Bewertung des Frische grades von Fleisch und Fisch verwenden will. Die Tab. 1 zeigt, daß sowohl mit als auch ohne Sulfit das Relativverhält nis der Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs annähernd gleichbleibt. Eine Substratkonzentration von 50 µM liegt im enzymatischen Test ohne Sulfit im unteren Bereich der Linearität, während sie in Gegenwart von Sulfit unter den experimentellen Bedingungen oberhalb des Linearitätsbereichs liegt. Deshalb wurden 15 µM Hypoxanthin oder Xanthin verwen det, um im Test in Gegenwart von Sulfit den Sauerstoffver brauch zu messen. In Abwesenheit von Sulfit war die Geschwin digkeit des Sauerstoffverbrauchs bei 50 µM Hypoxanthin etwa doppelt so hoch wie diejenige, die man bei derselben Konzen tration von Xanthin beobachtete. Analog dazu war in Gegenwart von Sulfit die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs bei 15 µM Hypoxanthin annähernd doppelt so hoch wie die jenige, die man bei 15 µM Xanthin beobachtete.

1.2.5. Standardkurve für Hypoxanthin

In Abwesenheit von Sulfit wird Hypoxanthin oder Xanthin unter annähernd stoichio metrischem Verbrauch von Sauerstoff oxidiert (Daten nicht gezeigt). Die Anwesenheit von Sulfit-Ionen verursacht da gegen nicht nur eine Beschleunigung des Sauerstoffverbrauchs, sondern auch einen Verbrauch von wesentlich mehr Sauerstoff, als er stoichiometrisch für die Hypoxanthin-Oxidation benö tigt würde. Dieser doppelte Effekt von (a) beschleunigtem Sauerstoffverbrauch und (b) Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs ermöglicht es, das Bestimmungsverfahren für Hypoxanthin stark zu verbessern. Während ohne Sulfit das Gleichgewicht nur sehr langsam erreicht wird (bis zu etwa 15 min innerhalb des in Fig. 4 dargestellten Meßbereichs), betrug der Equi librierungszeitraum innerhab des in Fig. 5 dargestellten Meßbereichs in Gegenwart von Sulfit weniger als 4 min. Da eine Ansprechzeit von 4 min für eine Routinebestimmung durch aus annehmbar ist, erstellten wir die Standardkurve für Hypoxanthin unter Verwendung der Gleichgewichts-Methode. Wie in Fig. 5 gezeigt, erhielt man in einem Konzentrations bereich von 0,5 bis 10 µM gute Linearität zwischen dem Sauer stoffverbrauch und der Hypoxanthin-Konzentration. Bei diesem Verfahren wird die Sensitivität hauptsächlich durch den Multiplikationsfaktor eingeschränkt, der dem überschüssigen Sauerstoffverbrauch über die stoichiometrisch erforderliche Menge für die Hypoxanthin-Oxidation hinaus entspricht. Diesen Multiplikationsfaktor zu berechnen ist nicht einfach; aus der Kalibrierungskurve läßt sich ein Wert von annähernd 10 ableiten. Die gesteigerte Sensitivität des erfindungsge mäßen Verfahrens, die mehr als das 10fache im Vergleich zum Verfahren ohne Sulfit beträgt, beruht teilweise auf diesem Effekt. Daß der Anstieg der Sensitivität noch größer ist als die Abschätzung dieses Multiplikations-Faktors er warten läßt, könnte durch die stark gesteigerte Geschwindig keit des Sauerstoffverbrauchs verursacht sein, die dazu führt, daß der Gleichgewichtszustand - bei einer niedrigeren Menge an gelöstem Sauerstoff - schneller erreicht wird. Ohne Sulfit stellt sich ein Gleichgewicht mit einem höheren Spiegel an gelöstem Sauerstoff ein, als man es von der Stoi chiometrie erwarten dürfte, und zwar wegen der kontinuier lichen Diffusion von Sauerstoff von der Oberfläche her, die man bei einer relativ geringen Geschwindigkeit des enzy matischen Sauerstoffverbrauchs nicht vernachlässigen dürfte.

Beispiel 2 2.1. Materialien und Methode 2.1.1. Reagenzien

Xanthinoxidase (EC 1.2.3.2, aus Kuhmilch) wurde von Boehringer Mannheim bezogen. Natriumsulfit, EDTA und Hypoxanthin stammten von E. Merck. Alle anderen einge setzten Chemikalien waren analytisch rein. Über das gesamte Experiment hinweg wurde destilliertes Wasser verwendet.

2.1.2. Messungen des Sauerstoffverbrauchs

Die Natriumsulfit- und Substratlösungen wurden vor ihrer Verwendung frisch hergestellt. Ein digitales Sauerstoffmeßgerät (Typ CG 867, Schott Instrumente, Hofheim) wurde für die Bestimmungen des gelösten Sauerstoffs eingesetzt. Der vom Sauerstoffmeß gerät erzeugte Stromfluß wurde mit einem elektronischen Aufschreiber (Typ 2045, Linesis, Selb) aufgezeichnet. Die Reaktionsmischung enthielt wäßrige Lösungen von 0,1 M Puffer (pH 7,3), Natriumsulfit und Hypoxanthin, und zwar jeweils 1,0, 0,5 bzw. 0,5 ml. Die Reaktionsmischung wurde in einem Glasröhrchen (innerer Durchmesser 14 mm, 100 mm lang) in einem temperaturkontrollierten Wasserbad (Typ 000-8700 Haake, Karlsruhe) mit Luft gesättigt; anschließend wurde die Sauerstoffelektrode in die Reaktionsmischung eingetaucht. Wenn sich der erzeugte Stromfluß stabilisiert hatte, wurden 10 µl einer 10fach mit dem verwendeten Puffer verdünnten Enzymlösung (0,02 Einheiten) zu der Reaktionsmischung zuge geben. Sofort wurde gut durchgeschüttelt, und anschließend wurde der Sauerstoffverbrauch aufgezeichnet.

2.2. Ergebnisse 2.2.1. Einfluß von EDTA

Bereits in Beispiel 1 wurde ange merkt, daß in Kaliumphosphat-Puffer die nichtenzymatische Sulfit-Oxidation nicht unterdrückt wurde, während dies nicht für die Oxidation in Tris-HCl-Puffer galt (1). Auch in Ab wesenheit von EDTA war die nichtenzymatische Oxidation von Sulfit bis zu einer Konzentration von 150 mM in Tris-HCl- Puffer stark unterdrückt. Mit steigender Zugabe von EDTA zur Reaktionsmischung wurde die Suppression weiter gesteigert. Das war jedoch kaum zu erwarten, daß eine Steigerung der EDTA-Konzentration auch über 10 mM die Oxidation vollständig unterdrücken würde. EDTA in Konzentrationen über 0,5 mM unterdrückte die nichtenzymatische Sulfitoxidation in Kalium phosphat-Puffer in vergleichbaren Ausmaße wie in Tris-HCl- Puffer. In den folgenden Experimenten wurde deshalb EDTA in Konzentrationen von 10 mM zu der Reaktionsmischung zugesetzt, sofern nichts anderes angegeben ist, und zwar, weil man hierdurch eine zuverlässigere Basislinie erhält als bei niedrigeren Konzentrationen von EDTA.

2.2.2. Einfluß von Sulfit

Wir untersuchten, ob sich durch gesteigerte Sulfitkonzentrationen in der Reaktionsmischung die Sensitivität steigern ließe. Da man durch die Zugabe von 10 mM EDTA bis hin zu einer Konzentration von 150 mM Sulfit zuverlässige Basislinien erhielt, untersuchten wir den Einfluß von Sulfit auf den Sauerstoffverbrauch im Detail (Fig. 3). Die Hypoxanthin-Konzentration, die für den Ver brauch von 1 mg O₂/l bis zum Gleichgewicht benötigte Hypo xanthin-Konzentration wurde logarithmisch gesenkt, während die Sulfit-Konzentration bis auf 50 mM gesteigert wurde; 10 bis 0,1 µM Hypoxanthin bis 0 bis 50 mM Sulfit. Eine weitere Steigerung der Sulfitkonzentration auf 150 mM hatte einen weiter gesteigerten Sauerstoffverbrauch zur Folge. Oberhalb einer Konzentration von 150 mM Sulfit war jedoch kein drastischer Anstieg des Sauerstoffverbrauchs mehr zu erwarten, was auf die Sättigung von Sulfit bezüglich der Sauerstoffaufnahme zurückzuführen sein könnte. In Gegenwart von 150 mM Sulfit wurde eine 3000fache Steigerung des Sauer stoffverbrauchs im Vergleich zur stoichoimetrisch erforder lichen Menge für die Hypoxanthinoxidation beobachtet.

2.2.3. Standardkurve für Hypoxanthin

Im Vergleich zur Bestim mung in Abwesenheit von Sulfit kann man durch Zugabe von Sulfit leicht eine bis 1000fach gesteigerte Sensitivität erreichen. Darüber hinaus kann man die Sensitivität in ein facher Weise über einen weiten Bereich der Hypoxanthin-Konzen tration hinweg einfach dadurch einregeln, daß man die Sulfit- Konzentration in der Testmischung variiert. In Fig. 4 bis 7 ist gezeigt, daß in Gegenwart von 0, 25, 75 und 150 mM Sulfit in den Hypoxanthin-Konzentrationsbereichen von 10 bis 100, 0,5 bis 10, 0,05 bis 1,0 bzw. 0,01 bis 0,06 µM eine lineare Beziehung bestand.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von Xanthin oder Hypoxanthin, insbe sondere in Nahrungsmitteln, bei einer Konzentration kleiner etwa 0,1 µM in wäßrigem Medium in Gegenwart von Xanthin-Oxi dase und gezielter Zugabe von Sulfit, bei dem man bei einer Sulfitkonzentration im Bereich von 10 bis 150 mM arbeitet, die zu einem überstöchiometrischen Sauerstoffverbrauch führt, und den Verbrauch an gelöstem Sauerstoff mit Hilfe einer Sauerstoffelektrode ermittelt und daraus die Menge und/oder Konzentration an Xanthin oder Hypoxanthin ermittelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Clark-Sauerstoffelektrode oder eine Mikro-Sauerstoffelektrode verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Gegenwart von Chelat-Bildnern arbeitet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chelat-Bildner Ethylendiamintetraessigsäure, Histidin oder Tyrosin verwendet.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man unter Lichtausschluß arbeitet.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Hypoxanthin in Fisch und Fleisch als Nahrungsmitteln bestimmt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Hypoxanthin in Körper- oder Gewebeflüssig keiten bestimmt.