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Verfahren und Röhrchen zur Durchführung klinisch-chemischer Analysen
Es ist bekannt, daß man qualitative und quantitative klinisch-chemische Analysen
in der Weise durchführen kann, daß man Streifen aus saugfähigem Papier mit Reagenz
lösungen imprägniert und die präparierten Streifen mit den zu untersuchenden physioligischen
Flüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum oder Harn in Berührung bringt und anhand einer
negativen oder positiven Farbreaktion die Ab- oder Anwesenheit eines $toffes und
dessen Menge bestimmt. Weiterhin ist bekannt, daß man auf die gleiche Art auch analysen
durchführen kann, denen mehrstufige Reaktionen zugrundeliegen, z. B. Reaktionen,
die unter
Mitwirkung von Enzymen verlaufen. Zu dieaem Zwecks pnsgt
man die Imprkgnierung der Streifen in mehraren Arbeitsschritten durchzuführen, so
daß verachieden, aufeinanderfolgeade Reaktionszonen erzeugt werden, in denen die
einzelnen Stufen der Gesamtreaktion nacheinander ablaufen.
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Bei diesem Verfahren der Imprägnierung läßt sich nicht vermeiden,
daß die Reagenzien der einzelnen Zonen ineinander Laufen und dadurch die gewünschte
Trennung der einzelnen Reaktionestufen verhindern. Dur@ dieses Ausbluten der Reaktionszonen
wird das Ergebnis der Analyse verfälscht.
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Weiterhin ist bekannt, daß bei der Durchführung von Analysen mit Hilfe
imprägnierter Papierstreifen das Analysenergebnis entweder mit Hilfe einer Vergleichsskala
aufgrund der Intensität der entstandenen Färbung der Nuancierung der ursprünglichen
Färbung oder mit Hilfe eines Maßstabes anhand der Länge der gefärbten Zonen festgestellt
werden kann.
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Bei der Auswertung der gefärbten Zone der imprägnierten Papierstreifen
kommen folgende Nachteile hinzu, die gleichfalls das Analysenergebnis verfälschen:
1.
Es ist schwierig, den Streifen genau vertikal zu orientieren, so daß bei Vergleichsanalysen
der Kapillarweg schwierig gleichlang zu halten ist.
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2. Durch Berührung des Streifens mit der Wand des Reaktionsgefäßes
kann das Analysenergebnis aufgrun kapi flarer Elevation und dadurch verursachte
Querdiffusion verfälscht werden.
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3. Wäbrend der Durchführung der Reaktion kann der Einfluß von Luftfeuchtigkeit
und Luftsauerstoff nicht ausgeschlossen werden.
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4. Das Entweichen von flüchtigen Reaktionsprodukte kann nicht verhindert
werden.
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5. Das Ausbluten der Reagenzien in die zu untersuc de Lösung durch
Auslaugung kann nicht verhindert werde Alle diese Nachteile lassen sich vermeiden,
wenn jan diese Analysen nach des Verfahren durchführt, das Gege stand dieser erfindung
ist.
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Bei des erfindungsgemäßen Verfahren werden anstelle von saugfähigen
Papierstreifen chemisch indifferente,
saugfähige Pulver mit möglichst
gleichmäßiger Korngröße als Träger der Reagenzien verwendet. Als Träger eignen sich
z. B. Cellulosepulver, Aluminiumoxyd oder Silikate, wie die Molekularsiebe, überhaupt
saugfähige feste Stoffe, sofern sie die Bedingung chemischer Indifferenz erfüllen.
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Bestimmte Mengen des chemisch indifferenten Pulvers werden mit bestimmten
Mengen von Reagenzienlösungen bestimmter Konzentration imprägniert und getrocknet.
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Die auf diese Weise erhaltenen Pulver werden in der Reihenfolge der
mit den Reagenzien durchzuführenden Reaktionen in Schiohtlängen, die den optimalen
Bedingungen der einzelnen Reaktionestufen entsprechen, in Röhrchen aus chemisch
indifferentem Material übereiflan der geschichtet.
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Als indifferentes Material kommen z. B. Glas oder Kunststoffe, wie
PVC, Polyäthylen, Polycarbonat, Acetalharz oder Polystyrol, infrage. Die Röhrchen
frauen vorzugsweise einen Durchmesser von ca, 3 mm und eine Länge bis zu 100 mm.
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Die fertigen Röhrchen werden schließlich mit ihrem unteren Ende in
die zu untersuchende physiologische
Flüssigkeit eingetaucht, die
infolge der Kapillarwirkung in die Röhrchen steigt und darin den gewünschten Reaktionen
unterworfen wird.
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Beispiel 1 In dieses Beispiel wird die Herstellung eines Teströhrchens
beschrieben, das zur enzymatischen Bestimmung des Harnstoffs im serum dienen kann.
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Zur Aafns?ne der Pulver dient ein Röhrchen aus Polysty@ mit einem
Durchmesser von etwa 3 mm und einer Länge vo@ etwa 100 mm. In den untersten Teil
des Röhrchens schic@ tet man eine Zone aus neutralem, nicht imprägnierten Trägermaterial,
z. B. Cellulosepulver, Darüber schichte an eine mit Hilfe eines Puffers (s. B. eines
Phosphat puffers) auf ein bestimmtes pH, z. B. pH 7,5, eingestel te Zone des gleichen
Trägermaterials, die zugleich das Ferment, die Urease, enthält. Darüber schichtet
man eine stark alkalische, z. B. Natriumcarbonat enthaltende Zone des gleichen Trägermaterials,
in der das durch die Urease gebildete Ammonium als Ammoniak in freiheit gesetzt
wird. Diese Zone dient gleichzeitig als Eiwei@perrzone, indem Eiwei@stoffe und deren
Spaltprodukte koaguliert werden, und hat 5. B. ein
ein pH = 12.
Als nächste Zone folgt eine Sperrzone, die z. B. mit in einem organischen Lösungsmittel,
wie Tetrachloracetylen, gelöster Acetylcellulose imprägniert ist und nur fitr das
Ammoniak durchlässig ist.
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Letzte Spuren von niedermolekularen Eiweißstoffen werden in dieser
Zone zurückgehalten.
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Zur qualitativen bzw. semiquantitativen Auswertung dient die abschließende
Indikatorzone, in der die Farbreaktion stattfindet. Die quantitative Auswertung
beruht auf der Messung der Länge der ausgebildeten Farbzone. Als Indikator wird
eine mit 0,1 %iger Bromkresolgrünlösung imprägnierte Zone aus Cellulosepulver verwendet,
die durch Zugabe eines Puffers, z. B.
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Natriumcitrat oder -tartrat, auf ein pH von 3 einges-tellt ist. durch
das Ammoniak schlägt die Parbe der Indikatorzone von gelb nach blau um. Für die
quantitative Auswertung des Farbumschlags ist zu beachten, daX bei diesem Test nicht
die Intensität der Farbe, sondern die Länge der gebildeten Farbzone m gebend ist.
Zur Erleichterung der Auswertung kann man deshalb die Röhrchen i@ Bereich der Indikatorzone
mit einer Skala versehen, an welcher der Harnstoffgehalt i mg % unmittelbar abgel@sen
werden kann.
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Beispiel 2 In diesem Beispiel wird die Herstellung eines Teströhrchens
beschrieben, das zur Bestimmung des Ammoniak gehaltes im Blut dienen kann.
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In den untersten Teil eines Teströhrchens füllt man eine Schicht von
neutralem, nicht imprägniertem Träger material, z. B. Cellulosepulver. Barauf folgt
eine stark alkalische, z. B. mit Natriumcarbonat imprägnier te Zone des gleichen
Trägermaterials vom pH 12 und danach als Eiweißschranke eine semipermeable Zone
des gleichen Trägermaterials, die mit Celluloseacetat, gelöst in einem organischen
Lösungsmittel, z. B. Dichlor acetylen, iiprägniert ist und die nur das in der alkalischen
Zone freigesetzte Ammoniak in die nachfolgende Indikatorzone übergehen läßt. In
dieser Zone, die mit tels eines Puffers, z. B. Natriumcitrat oder -tartrat, auf
pH 3 eingestellt ist, ruft das Ammoniak eine Erz reaktion hervor, deren Nuance durch
Vergleich mit eir empirischen Farbskala den Ammoniakgehalt zu ermitteln gestattet.
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Beispiel 3 In diesem Beispiel wird die Herstellung eines Teströhrchens
beschrieben, das zur enzymatischen @ @@im@@
der Glucose im Serum
oder ilarn dienen kann.
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Zur Aufnahme der einzelnen Pulver dient wiederum ein durchsichtiges
Röhrchen aus Glas oder einem geeigneten Kunststoff, wie Polyäthylen, Polystyrol,
PVC, Polycarbonat oder Acetalharz mit einem Durchmesser von etwa 3 mm und einer
Länge von etwa 60 mm. In den untersten Teil des Röhrchens schichtet an eine Zone
aus neutralem, nicht imprägnierten Trägermaterial, z. B. Cellulosepulver oder Aluminiumoxyd.
Darüber schichtet man eine mit Hilfe eines Puffers, beispielsweise eines Natriumcitratpuffers,
auf ein pH von 4,7 eingestellte Zone des gleichen Trägermaterials, die zugleich
des Ferment, die Glucose Oxydase, enthält.
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Darüber schichtet man eine Indikatorzone aus dem gleichen Trägermaterial,
die wahlweise mit einer @@@loida@@@, wäßrigen Lösung von Stärkeglykolat oder @@@@@@
@@@@ @@el, einer @äßrigen Kaliumjodidlösung @@@@ @@@ @@@@@ Peroxy@@@@lösung imprägniert
worden @@.
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@ lung des bei d@@ @@zymatischen Spal-@@@@@ gebild@ten W@@@@@@toffperoxyds
und @ @ @ @@@@@@cher @@@l@ung durch die anwesende @@@ di@! @@@@katorz@@ eine Blaju-
bzw.
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Roffärbung, deren Intensität der vorhandenen Glucose direkt proportional
ist. Die quantitative Auswertung dieser Farbreaktion geschieht durch Vergleich mit
einer empirischen Farbskala, welche die Glucosekonzentration semiquantitativ abzulesen
gestattet.
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Beispiel ß In dieses Beispiel wird die Herstellun g eines Test röhrchens
beschrieben, das zur Bestimmung des Eiweißgehaltes im Urin dienen kann.
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Zur Aufnahme der einzehen Pulver dient wieder ein durchsichtiges Röhrchen
aus Glas oder einea geeigneten Kunststoff, wie PVC, Polyäthylen, Polystyrol, Polycarbonat
oder Acetalharz mit einem Durchmesser von etwa 3 am und einer länge von etwa 60
mm. In den unter sten Teil des Röhrchens schichtet man eine Zone aus neutralem,
nicht imnprägniertem Trägermaterial, z. B.
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Cellulosepulver. Darüber schichtet man eine Indikatorzone aus dem
gleichen Trägermaterial, die mit einer Lösung eines geeigneten Indikators, vorzugsweise
mit Tetrabroiaphenolphthaleinäthylester, einer Lösung eine geeigneten Puffers, z.
B. eines Natriumcitrat- oder -tartratpuffers von pH 3 und einer Lösung eines Fixie@
mittels, z. B. Gummiarabicum, Tragantgummi, Stärke
oder Gelatine,
imprägniert ist. Durch das Vorhandensein des Fixiermittels wird eine schärfere Abgrenzung
der Farbzonen erzielt. Je nach dem Eiweißgehalt der z@ untersuchenden Flüssigkeit
erfährt die Indikatorzone eine Nuencierung von gelb über grün nach blau. Der Eiweißgehalt
kann durch Vergleich mit einer empirische Farbskala ermittelt werden.
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Beispiel 5 In diesem Beispiel wird die gleichzeitige Ausführung verschiedener
Koma-Tests beschrieben, die zur Schnelldiagnose der Koma-Ursache dienen können.
Man verwendet dazu eine Kombination der bereits beschriebenen Teströhrchen, die
mittels beliebiger Mittel, z. B. mittels Tesafils, zu einem Bündel vereinigt sind'
Aufgrund der auf diese Weise gewonnenen Resultate kann sofort die einschlägige therapeutische
Behandlung einsetzen, um dem Patienten des Leben zu retten.
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Zur Diagnose des hyperglykämischen bzw. hypoglykämisch' Komas wird
das gleiche Teströhrchen verwendet, wie es zur Bestimmung der Glucose verwendet
und bereits beschriebea worden ist.
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Zur Diagnose des urämischen Kiaas wird das gleiche Teströhrchen verwendet,
wie es zur Bestimmung des Harn stoffes verwendet und bereits beschrieben wurde.
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Die Diagnose des Koma hepaticum geschieht durch Bestimmung des Ammoniakgehaltes
im Blut. Dazu verwende man ein Teströhrchen, wie es bereits beschrieben wurde Zur
Diagnose des Koma barbituricum (Barbitursäurevergiftung) wird ein Teströhrchen verwendet,
wie es für die Barbitursäurebestimmung verwendet werden kann.
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Gerade d.r besohriebene Koma-Test zeigt die Überlegen heit des erfindungsgemäßen
Verfahrens in instruktiver Form, weil er es ermöglicht, vier für ein Roma ursächliche
Bestandteile des Serums gleichzeitig zu bestimopon, und dadurch die Chance bietet,
sofort eine gezielt Therapie anzuwenden. Die @estimmung der vier Werte gelingt innerhalb
weniger Minuten bei höchs@@@ Genau@g@ keit.
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Will man enzymatische Reaktionen durchführen, die eine bestimmte Temperatur
verlangen, so kann man die Zone der enzymatischen Reaktion mit einem Thermophor
umgebe@ der aus einem starkwandigen Hohlzylinder besteht und de
vorher
in einem Thermostaten auf die gewünschte Reaktionsteaperatur eingestellt worden
ist.
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In der beiliegenden Zeichnung zeigt Pig. 1 ein Teströhrchen für die
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und Fig. 2 ein sogenanntes Vierlings
röhrchen sur gleichzeitigen Ausführung mehrerer Tests wie z. B. des Koma-Tests.
Mit 1 ist das Teströhrchen bezeichnet, mit 2 der Tesafilm, mit 3, 4, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12 und 13 sind mit verschiedenen Reagenzien imprägnierte und anschließend
getrocknete Zonen chemisch indifferenter, saugfähiges Pulver und mit 5 die Zone
des nicht imprägnierten, chemisch indifferenten, saugfähigen Pulvers bezeichnet.
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- Patentansprüche -