DE2149675C3

DE2149675C3 - Verfahren zur quantitativen Be Stimmung von Harnsaure

Info

Publication number: DE2149675C3
Application number: DE19712149675
Authority: DE
Inventors: Toshio Tokio Kanzaki
Original assignee: DR HEINZ HAURY CHEMISCHE FABRIK 8000 MUENCHEN
Current assignee: DR HEINZ HAURY CHEMISCHE FABRIK 8000 MUENCHEN
Priority date: 1970-10-05
Filing date: 1971-10-05
Publication date: 1973-11-29
Also published as: DE2149675B2; DE2149675A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase.

Bekannte Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure können grob in zwei Kategorien eingeordnet werden. Die zur ersten Kategorie gehörenden Verfahren nutzen die reduzierende Wirkung der Harnsäure aus. Hierbei wird Phosphor-Wolframsäure einer Harnsäure enthaltenden Probe zugesetzt und das bei der Reduktion der Phosphor-Wolframsäure mit Harnsäure entstandene Phosphor-Wolfram-Blau kolorimetrisch gemessen. Dieses Verfahren ist jedoch nicht genügend genau, da andere in der Probe enthaltene reduzierende Verbindungen den gemessenen Wert beeinflussen können. Ferner ist eine vorhergehende Enteiweißung der Probe erforderlich, wodurch die Bestimmung kompliziert wird. Die zur zweiten Kategorie gehörenden Verfahren werden mittels Uricase durchgeführt, wobei hauptsächlich die Absorption im ultravioletten Bereich bestimmt wird. Hierbei wird die auf dem Abbau von Harzsäure zu Allantoin unter der Einwirkung von Uricase beruhende Absorptionsabnahme der Harnsäure bestimmt. Die Harnsäure hat ein Absorptionsmaximum bei 293 πΐμ. Obwohl dieses Verfahren spezifisch für Harnsäure ist, ist seine Reproduzierbarkeit gering, und es können Verfälschungen auftreten, die auf der Absorption von in der Probe enthaltenden Proteinen beruhen. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist, daß ein spezielles Spektrophotometer erforderlich ist, das eine Absorptionsmessung im ultravioletten Bereich gestattet.

Es ist ferner bekannt, daß Harnsäure kolorimetrisch unter Verwendung von Phosphor-Wolframsäure aus der Absorptionsdifferenz einer nicht behandelten Probe und einer zuvor mit Uricase behandelten Probe bestimmt werden kann. Weiterhin ist es bekannt, daß Harnsäure durch kolorimetrische Bestimmung der unter der Einwirkung von Uricase entstandenen Wasserstoffperoxidmenge bestimmt werden kann.

30

35

40

45 Diese Bestimmung wird mit Peroxidase und 0-D1-anisidin durchgeführt Obwohl diese Verfahren den Vorteil haben, daß die Messung im sichtbaren Bereich durchgeführt werden kann, ist deren Durchführung kompliziert, da sie eine Enteiweißung als verfahrenswesentlichen Schritt enthalten.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein einfaches, genaues und reproduzierbares Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure zur Verfugung zu stellen, das die Nachteile der bekannten Verfahren nicht aufweist und insbesondere ohne vorhergehende Enteiweißung der Probe durchgeführt werden kann. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Methanol einwirken läßt, den entstandenen Formaldehyd mit Acetylaceton und Ammoniak zu S.S-Diacetyl-lAdihydrolutidin umsetzt und die Gelbfärbung spektrophotometrisch mißt.

Der Reaktion&ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens, das nachstehend als »Uricase-Katalyse-Verfahren« bezeichnet wird, ist im nachstehenden Reaktionsschema dargestellt.

+ 2H₂O + O₂

II. H₂O₂ + CH₃OH

NH

+ CO₂ + H₂O₂

HCHO + 2H₂O

III. HCHO + 2CH₃COCH₂COCH₃ + NH₃

55 CH,CO

H,C

C-CH,

+ 3H₂O

Die gemäß der Reaktion nach Hantzsch (Hantzsch Pyridine Synthesis, Merck Index, 8. Auflage, 1174) erfolgende Bildung von 3,5-Diacetyl-l,4-dihydrolutidin ist spezifisch auf die in der Probe enthaltene Harnsäure, und die Harnsäuremenge kanr durch kolorimetrische Messung der auf 3,5-Diacetyl· 1,4-dihydrolutidin beruhenden Gelbfärbung bei 410 πΐμ exakt bestimmt werden.

Es wird angenommen, daß die Reaktion wie im vorstehenden Reaktionsschema dargestellt abläuft Eine stufenweise Zugabe der erforderlichen Reagenzien, d. h. Uricase, Katalase und das Hantzsch-

Reagens, zu der Harnsäureprobe ist zur Durchführung des Uricase-Katalase-Verfahrens nicht erforderlich. Die vorgenannten drei Reagenzien können in kombinierter Form als Testreagens verwendet werden, und die enzymatischen Reaktionen und die Farbreaktion können gleichzeitig ablaufen.

Im allgemeinen liegt das pH-Optimnm für Uricase bzw. Katalase bei etwa pH 8,5 bzw. 6,3. Andererseits erreicht die Farbentwicklung bei der Reaktion eines Ammoniumsalzes, Acetylaceton und Formaldehyd nach Hantzsch ihr Maximum im pH-Bereich von etwa 5,5 bis etwa 6,5 (vgl. Biochemical Journal, Bd. 55 [1953], S. 416). Beruhend auf den vorgenannten Tatsachen wurde nun festgestellt, daß sich das Uricase-Katalase-Verfahren vorzugsweise bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes durchführen läßt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden 0,2 ml einer Harnsäurelösung mit einer Konzentration von " 20 mg/100 ml in 3,0 ml einer wäßrigen Lösung von Ammoniumphosphat und Phosphorsäure mit einem pH-Wert von 7, die 2 mg Uricase pro 100 ml enthält, innerhalb von 30 Minuten bei 37 C vollständig abgebaut. Vorzugsweise wird daher ein aas einer Probe und dem Testieagens bestehendes Gemisch mindestens 30 Minuten nach dem Vermischen bei einer Temperatur von etwa 37° C gehalten, um die im vorstehenden Reaktionsschema unter I. dargestellte Reaktion zu vervollständigen. Eine Katalase-Konzentration von 10 mg/100 ml ist ausreichend; bei Verwendung höherer Katalase-Konzentrationen wurden keine Anderungen in der Farbentwicklung beobachtet. Vorzugsweise wird im Uricase-Katalase-Verfahren Methanol als Alkohol verwendet. Die bevorzugte Methanolkonzentration beträgt 8 bis 10 ml pro 100 ml.

In F i g. 1 bzw. 2 sind die aus menschlichem Blutserum bzw. aus menschlichem Urin erhaltenen Harnsäurewerte nach dem Uricase-Katalase-Verfahren mil den durch Absorptionsmessung im ultravioletten Bereich nach Behandeln der Probe mit Uricase erhaltenen Werten verglichen.

In F i g. 3 ist die Beziehung zwischen der Harnsäurekonzentration und der Absorption dargestellt.

Die zur Durchführung der Reaktion nach Hantzsch erforderlichen Reagenzien können gemäß der vorstehend zitierten Literaturstelle hergestellt werden.

Die Herstellung der für das Uricase-Katalase-Verfahren benötigten Reagenzien ist nachfolgend aufgeführt.

2 mg ebenfalls im H-andel erhältliche Uricase werden in destilliertem Wasser zu einem Volumen von 100,0 ml gelöst. Die Lösung wird filtriert und vor dem Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt.

4. Nullwertreagens

10,0 g Diammoniumhydrogenphosphat, 0,3 ml Phosphorsäure, 10,0 ml Methanol, 0,2 ml Acetylaceton und 10 mg Katalase W2rden in destilliertem Wasser zu einem Volumen von 100 ml gelöst. Die Lösung wird filtriert und vor dem Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen werden die vorstehend hergestellten Reagenzien verwendet.

Beispiel 1

Die Versuche werden in jeweils vier Teströhrchen durchgeführt, die mit A, B, C und D bezeichnet sind. In die Röhrchen A und B werden jeweils 0,2 ml menschliches Blutserum und in die Röhrchen C und D jeweils 0,2 ml Harnsäure-Standard-Lösung gegeben. Anschließend werden in die Röhrchen A und C je 3,0 ml des Farbreagens und in die Röhrchen B und D je 3,0 ml des Nullwertreagens gegeben. Die Röhrcheninhalte werden heftig gerührt und 70 Minuten bei 37" C in einem thermostatisierten Bad inkubiert. Die Röhrchen werden dann unter fließendem Wasser abgekühlt, und es wird die Absorption bei 410 πΐμ von A und C unter Verwendung von B und D als Null wert gemessen. Die Harnsäurekonzentration in der Probe wird mittels nachfolgender Gleichung berechnet, in der Ea die Absorption der Probe A und Ec die Absorption der Probe C bedeutet.

mg Harnsäure/100 ml Blutserum =

Ea Ec

10.

1. Harnsäure-Standard-Stammlösung

1OO mg reine Harnsäure und 80 mg Lithiumcarbonat werden in einen 100 ml fassenden Meßkolben gegeben und in 15 ml destilliertem Wasser unter nachfolgendem Erwärmen auf 60⁰C gelöst. Nach dem Abkühlen wird die Lösung mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt und nach Zugabe von einigen Tropfen Chloroform im Kühlschrank aufbewahrt.

2. Harnsäure-Standard-Lösung

10 ml der Harnsäure-Standard-Stammlösung werden unmittelbar vor Gebrauch mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 ml verdünnt.

3. Farbreagens

10,0 g Diammoniumhydrogenphosphat, 0,3 ml Phosphorsäure, 10,0 ml Methanol, 0,2 ml Acetylaceton, 10 mg im Handel erhältliche Katalase und Das vorstehend beschriebene Verfahrei. wurde mit 118 menschlichen Blutseren durchgeführt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen verglichen, die bei der Absorptionsmessung im ultravioleUen Bereich nach Behandlung der Probe mit Uricase (J. Lab. din. Med. Bd. 54 [1959], S. 903) erhalten wurden. Diese Ergebnisse sind in F i g. 1 dargestellt. Aus F i g. 1 ist ersichtlich, daß die nach beiden Verfahren erhaltenen Werte auf einer Geraden mit einem Neigungswinkel von 45° liegen und miteinander übereinstimmen.

Beispiel 2

Gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wird die Harnsäurekonzentration in 107 Proben von zehnfach verdünntem menschlichem Urin bestimmt. Die Ergebnisse sind in F i g. 2 dargestellt.

Beispiel 3

Durch Verdünnen der Harnsäure-Standard-Stammlösung mit destilliertem Wasser werden Proben mit Harnsäurekonzentrationen von 5, 10, 15 und 20 mg/ 100 ml lies gestellt. In vier Teströhrchen werden jeweils 0,2 ml dieser Lösungen gegeben, und ein fünftes Teströhrchen wird mit 0,2 ml destilliertem Wasser beschickt. Anschließend werden in jedes Röhrchen 3,0 ml Farbreagens gegeben. Die Röhrcheninhalte

werden heftig gerührt und 70 Minuten bei 37° C in einem thermostatisierten Bad inkubiert. Die Röhrchen werden dann unter fließendem Wasser abgekühlt, und es wird die Absorption der Proben bei,410 ηΐμ gegen den nur destilliertes Wasser enthaltenden Nullwert gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 3 dargestellt. Aus F i g. 3 ist ersichtlich, daß die Beziehung der Harnsäurekonzentration und der Absorption einer Funktion genügt, die durch eine Ursprungsgerade darstellbar ist.

Beispiel 4

Es wird die Harnsäuremenge in einem Serum gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt.

Anschließend wird dieses Serum mit verschiedenen bekannten Harnsäuremengen versetzt und die im Serum enthaltene gesamte Harnsäuremenge entsprechend dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der

ίο Tabelle zusammengestellt;

Harnsäurekonzentration	Zu 100 ml Blutserum	Theoretische Harnsäure-	Gemessene Harnsäure	Meßuusbeute
im Blutserum	zugesetzte Harnsäuremenge	konzentraiion	konzentration	(%)
(mg/100 ml)	(mg)	(mg/100 ml)	(mg/100 ml)	100,0
3,4	2,0	5,4	5,4	100,0
3,4	4,0	7,4	7,4	100,0
3,4	6.0	9.4	9,4	100,0
6,0	2,0	8,0	8,0	99,0
6,0	4,0	10,0	9,9	101,7
6,0	6,0	12,0	12,2	100,0
8,2	2,0	10,2	10,2	100,8
8,2	4,0	12,2	12,3	100,7
8,2 .	6,0	14,2	14,3	Durchschnitt
				100,2

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase, dadurch gekennzeichnet, daß man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Methanol einwirken läßt, den entstandenen Formaldehyd mit Acetylaceton und Ammoniak zu 3,5-Diacetyl-l,4-dihydrolutidin umsetzt und die Gelbfärbung spektrophotometrisch mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes durchführt

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mindestens 30 Minuten bei 37° C durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit 8 bis 10 ml Methanol pro 100 ml Farbreagens durchrührt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelbfärbung bei 410 πΐμ mißt.