DE2149675C3 - Verfahren zur quantitativen Be Stimmung von Harnsaure - Google Patents
Verfahren zur quantitativen Be Stimmung von HarnsaureInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase.
Bekannte Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure können grob in zwei Kategorien
eingeordnet werden. Die zur ersten Kategorie gehörenden Verfahren nutzen die reduzierende Wirkung
der Harnsäure aus. Hierbei wird Phosphor-Wolframsäure einer Harnsäure enthaltenden Probe zugesetzt
und das bei der Reduktion der Phosphor-Wolframsäure mit Harnsäure entstandene Phosphor-Wolfram-Blau
kolorimetrisch gemessen. Dieses Verfahren ist jedoch nicht genügend genau, da andere in der Probe
enthaltene reduzierende Verbindungen den gemessenen Wert beeinflussen können. Ferner ist eine
vorhergehende Enteiweißung der Probe erforderlich, wodurch die Bestimmung kompliziert wird. Die zur
zweiten Kategorie gehörenden Verfahren werden mittels Uricase durchgeführt, wobei hauptsächlich
die Absorption im ultravioletten Bereich bestimmt wird. Hierbei wird die auf dem Abbau von Harzsäure
zu Allantoin unter der Einwirkung von Uricase beruhende Absorptionsabnahme der Harnsäure bestimmt.
Die Harnsäure hat ein Absorptionsmaximum bei 293 πΐμ. Obwohl dieses Verfahren spezifisch für
Harnsäure ist, ist seine Reproduzierbarkeit gering, und es können Verfälschungen auftreten, die auf der
Absorption von in der Probe enthaltenden Proteinen beruhen. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist,
daß ein spezielles Spektrophotometer erforderlich ist, das eine Absorptionsmessung im ultravioletten Bereich
gestattet.
Es ist ferner bekannt, daß Harnsäure kolorimetrisch unter Verwendung von Phosphor-Wolframsäure aus
der Absorptionsdifferenz einer nicht behandelten Probe und einer zuvor mit Uricase behandelten Probe
bestimmt werden kann. Weiterhin ist es bekannt, daß Harnsäure durch kolorimetrische Bestimmung der
unter der Einwirkung von Uricase entstandenen Wasserstoffperoxidmenge bestimmt werden kann.
30
35
40
45 Diese Bestimmung wird mit Peroxidase und 0-D1-anisidin durchgeführt Obwohl diese Verfahren den
Vorteil haben, daß die Messung im sichtbaren Bereich durchgeführt werden kann, ist deren Durchführung
kompliziert, da sie eine Enteiweißung als verfahrenswesentlichen Schritt enthalten.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein einfaches, genaues und reproduzierbares Verfahren zur quantitativen
Bestimmung von Harnsäure zur Verfugung zu stellen, das die Nachteile der bekannten Verfahren
nicht aufweist und insbesondere ohne vorhergehende Enteiweißung der Probe durchgeführt werden kann.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittels
Uricase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase
in Gegenwart von Methanol einwirken läßt, den entstandenen Formaldehyd mit Acetylaceton
und Ammoniak zu S.S-Diacetyl-lAdihydrolutidin
umsetzt und die Gelbfärbung spektrophotometrisch mißt.
Der Reaktion&ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens,
das nachstehend als »Uricase-Katalyse-Verfahren« bezeichnet wird, ist im nachstehenden Reaktionsschema
dargestellt.
+ 2H2O + O2
II. H2O2 + CH3OH
NH
+ CO2 + H2O2
HCHO + 2H2O
III. HCHO + 2CH3COCH2COCH3 + NH3
55 CH,CO
H,C
C-CH,
+ 3H2O
Die gemäß der Reaktion nach Hantzsch (Hantzsch Pyridine Synthesis, Merck Index, 8. Auflage,
1174) erfolgende Bildung von 3,5-Diacetyl-l,4-dihydrolutidin ist spezifisch auf die in der Probe enthaltene
Harnsäure, und die Harnsäuremenge kanr durch kolorimetrische Messung der auf 3,5-Diacetyl·
1,4-dihydrolutidin beruhenden Gelbfärbung bei 410 πΐμ exakt bestimmt werden.
Es wird angenommen, daß die Reaktion wie im vorstehenden Reaktionsschema dargestellt abläuft
Eine stufenweise Zugabe der erforderlichen Reagenzien, d. h. Uricase, Katalase und das Hantzsch-
Reagens, zu der Harnsäureprobe ist zur Durchführung des Uricase-Katalase-Verfahrens nicht erforderlich.
Die vorgenannten drei Reagenzien können in kombinierter Form als Testreagens verwendet
werden, und die enzymatischen Reaktionen und die Farbreaktion können gleichzeitig ablaufen.
Im allgemeinen liegt das pH-Optimnm für Uricase bzw. Katalase bei etwa pH 8,5 bzw. 6,3. Andererseits
erreicht die Farbentwicklung bei der Reaktion eines Ammoniumsalzes, Acetylaceton und Formaldehyd
nach Hantzsch ihr Maximum im pH-Bereich von etwa 5,5 bis etwa 6,5 (vgl. Biochemical Journal,
Bd. 55 [1953], S. 416). Beruhend auf den vorgenannten
Tatsachen wurde nun festgestellt, daß sich das Uricase-Katalase-Verfahren
vorzugsweise bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes durchführen läßt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden 0,2 ml einer Harnsäurelösung mit einer Konzentration von "
20 mg/100 ml in 3,0 ml einer wäßrigen Lösung von Ammoniumphosphat und Phosphorsäure mit einem
pH-Wert von 7, die 2 mg Uricase pro 100 ml enthält, innerhalb von 30 Minuten bei 37 C vollständig abgebaut.
Vorzugsweise wird daher ein aas einer Probe und dem Testieagens bestehendes Gemisch mindestens
30 Minuten nach dem Vermischen bei einer Temperatur von etwa 37° C gehalten, um die im vorstehenden
Reaktionsschema unter I. dargestellte Reaktion zu vervollständigen. Eine Katalase-Konzentration
von 10 mg/100 ml ist ausreichend; bei Verwendung höherer Katalase-Konzentrationen wurden keine Anderungen
in der Farbentwicklung beobachtet. Vorzugsweise wird im Uricase-Katalase-Verfahren Methanol
als Alkohol verwendet. Die bevorzugte Methanolkonzentration beträgt 8 bis 10 ml pro 100 ml.
In F i g. 1 bzw. 2 sind die aus menschlichem Blutserum bzw. aus menschlichem Urin erhaltenen Harnsäurewerte
nach dem Uricase-Katalase-Verfahren mil den durch Absorptionsmessung im ultravioletten
Bereich nach Behandeln der Probe mit Uricase erhaltenen Werten verglichen.
In F i g. 3 ist die Beziehung zwischen der Harnsäurekonzentration und der Absorption dargestellt.
Die zur Durchführung der Reaktion nach Hantzsch erforderlichen Reagenzien können gemäß
der vorstehend zitierten Literaturstelle hergestellt werden.
Die Herstellung der für das Uricase-Katalase-Verfahren benötigten Reagenzien ist nachfolgend aufgeführt.
2 mg ebenfalls im H-andel erhältliche Uricase werden
in destilliertem Wasser zu einem Volumen von 100,0 ml
gelöst. Die Lösung wird filtriert und vor dem Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt.
4. Nullwertreagens
10,0 g Diammoniumhydrogenphosphat, 0,3 ml Phosphorsäure, 10,0 ml Methanol, 0,2 ml Acetylaceton
und 10 mg Katalase W2rden in destilliertem Wasser zu einem Volumen von 100 ml gelöst. Die
Lösung wird filtriert und vor dem Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen werden die vorstehend hergestellten Reagenzien
verwendet.
Die Versuche werden in jeweils vier Teströhrchen durchgeführt, die mit A, B, C und D bezeichnet sind.
In die Röhrchen A und B werden jeweils 0,2 ml menschliches Blutserum und in die Röhrchen C und D
jeweils 0,2 ml Harnsäure-Standard-Lösung gegeben. Anschließend werden in die Röhrchen A und C je
3,0 ml des Farbreagens und in die Röhrchen B und D je 3,0 ml des Nullwertreagens gegeben. Die Röhrcheninhalte
werden heftig gerührt und 70 Minuten bei 37" C in einem thermostatisierten Bad inkubiert.
Die Röhrchen werden dann unter fließendem Wasser abgekühlt, und es wird die Absorption bei 410 πΐμ
von A und C unter Verwendung von B und D als Null wert gemessen. Die Harnsäurekonzentration in
der Probe wird mittels nachfolgender Gleichung berechnet, in der Ea die Absorption der Probe A und Ec
die Absorption der Probe C bedeutet.
mg Harnsäure/100 ml Blutserum =
Ea Ec
10.
1. Harnsäure-Standard-Stammlösung
1OO mg reine Harnsäure und 80 mg Lithiumcarbonat werden in einen 100 ml fassenden Meßkolben gegeben
und in 15 ml destilliertem Wasser unter nachfolgendem Erwärmen auf 600C gelöst. Nach dem Abkühlen wird
die Lösung mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt und nach Zugabe von einigen Tropfen
Chloroform im Kühlschrank aufbewahrt.
2. Harnsäure-Standard-Lösung
10 ml der Harnsäure-Standard-Stammlösung werden unmittelbar vor Gebrauch mit destilliertem
Wasser auf ein Volumen von 100 ml verdünnt.
3. Farbreagens
10,0 g Diammoniumhydrogenphosphat, 0,3 ml Phosphorsäure, 10,0 ml Methanol, 0,2 ml Acetylaceton,
10 mg im Handel erhältliche Katalase und Das vorstehend beschriebene Verfahrei. wurde mit
118 menschlichen Blutseren durchgeführt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen
verglichen, die bei der Absorptionsmessung im ultravioleUen
Bereich nach Behandlung der Probe mit Uricase (J. Lab. din. Med. Bd. 54 [1959], S. 903)
erhalten wurden. Diese Ergebnisse sind in F i g. 1 dargestellt. Aus F i g. 1 ist ersichtlich, daß die nach
beiden Verfahren erhaltenen Werte auf einer Geraden mit einem Neigungswinkel von 45° liegen und miteinander
übereinstimmen.
Gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wird die Harnsäurekonzentration in 107 Proben von
zehnfach verdünntem menschlichem Urin bestimmt. Die Ergebnisse sind in F i g. 2 dargestellt.
Durch Verdünnen der Harnsäure-Standard-Stammlösung mit destilliertem Wasser werden Proben mit
Harnsäurekonzentrationen von 5, 10, 15 und 20 mg/ 100 ml lies gestellt. In vier Teströhrchen werden jeweils
0,2 ml dieser Lösungen gegeben, und ein fünftes Teströhrchen wird mit 0,2 ml destilliertem Wasser beschickt.
Anschließend werden in jedes Röhrchen 3,0 ml Farbreagens gegeben. Die Röhrcheninhalte
werden heftig gerührt und 70 Minuten bei 37° C in einem thermostatisierten Bad inkubiert. Die Röhrchen
werden dann unter fließendem Wasser abgekühlt, und es wird die Absorption der Proben bei,410 ηΐμ
gegen den nur destilliertes Wasser enthaltenden Nullwert gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 3 dargestellt.
Aus F i g. 3 ist ersichtlich, daß die Beziehung der Harnsäurekonzentration und der Absorption
einer Funktion genügt, die durch eine Ursprungsgerade darstellbar ist.
Es wird die Harnsäuremenge in einem Serum gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt.
Anschließend wird dieses Serum mit verschiedenen bekannten Harnsäuremengen versetzt und die im
Serum enthaltene gesamte Harnsäuremenge entsprechend dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren
bestimmt. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der
ίο Tabelle zusammengestellt;
Harnsäurekonzentration | Zu 100 ml Blutserum | Theoretische Harnsäure- | Gemessene Harnsäure | Meßuusbeute |
im Blutserum | zugesetzte Harnsäuremenge | konzentraiion | konzentration | (%) |
(mg/100 ml) | (mg) | (mg/100 ml) | (mg/100 ml) | 100,0 |
3,4 | 2,0 | 5,4 | 5,4 | 100,0 |
3,4 | 4,0 | 7,4 | 7,4 | 100,0 |
3,4 | 6.0 | 9.4 | 9,4 | 100,0 |
6,0 | 2,0 | 8,0 | 8,0 | 99,0 |
6,0 | 4,0 | 10,0 | 9,9 | 101,7 |
6,0 | 6,0 | 12,0 | 12,2 | 100,0 |
8,2 | 2,0 | 10,2 | 10,2 | 100,8 |
8,2 | 4,0 | 12,2 | 12,3 | 100,7 |
8,2 . | 6,0 | 14,2 | 14,3 | Durchschnitt |
100,2 | ||||
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase, dadurch gekennzeichnet,
daß man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Methanol einwirken läßt, den
entstandenen Formaldehyd mit Acetylaceton und Ammoniak zu 3,5-Diacetyl-l,4-dihydrolutidin umsetzt
und die Gelbfärbung spektrophotometrisch mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man das Verfahren bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes durchführt
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mindestens
30 Minuten bei 37° C durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit 8 bis
10 ml Methanol pro 100 ml Farbreagens durchrührt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelbfärbung bei
410 πΐμ mißt.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8664970 | 1970-10-05 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2149675A1 DE2149675A1 (de) | 1972-04-06 |
DE2149675B2 DE2149675B2 (de) | 1973-03-08 |
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ID=13892866
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19712149675 Expired DE2149675C3 (de) | 1970-10-05 | 1971-10-05 | Verfahren zur quantitativen Be Stimmung von Harnsaure |
Country Status (1)
Country | Link |
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Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4230798A (en) * | 1978-02-13 | 1980-10-28 | Miles Laboratories, Inc. | Unitized uric acid test composition and device |
CN110411969B (zh) * | 2019-08-02 | 2021-10-01 | 淮阴师范学院 | 紫外分光光度法测定禽类粪便中尿酸含量的方法 |
-
1971
- 1971-10-05 DE DE19712149675 patent/DE2149675C3/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
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DE2149675A1 (de) | 1972-04-06 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
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