DE2937322A1

DE2937322A1 - Verfahren zur bestimmung von harnstoff

Info

Publication number: DE2937322A1
Application number: DE19792937322
Authority: DE
Inventors: Franco Meiattini; Alessandro Tabacco
Original assignee: Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano Sclavo SpA
Current assignee: Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano Sclavo SpA
Priority date: 1978-09-15
Filing date: 1979-09-14
Publication date: 1980-03-20
Also published as: JPS5542594A; US4507388A; FR2436185B1; CA1132888A; DE2937322C3; IT1098851B; FR2436185A1; IT7827718A0; DE2937322B2; GB2030295B; GB2030295A

Description

Beschreibung Verfahren zur Beschreibung von Harnstoff

Die Erfindung betrifft ein vereinfachtes Verfahren zur enzymatisch - kalorimetrischen Bestimmung von Harnstoff, das auf der Verwendung von lediglich zwei Reaktionssystemen beruht.

Bekanntlich hydrolysiert das Enzym Urease Harnstoff unter Bildung von COp und NH, (dies ist der enzymetische Teil der Bestimmung, I).

Es ist weiterhin bekannt, daß Ammoniak mit Phenol und Hypochlorit unter Bildung von Indophenolblau in alkalisohem Medium reagiert; das Indophenolblau kann photometrisch gemessen werden (dies ist der nichtenzymatische Teil der Bestimmung, bekannt als Berthelot - Reaktion; Berthelot hat diese Reaktion 1859 beschrieben - II), III), IV).

Die Abfolge der Reaktion, von denen Gebrauch gemacht wird lautet folgendermaßen:

I) Harnstoff +

II) NH₃ + OCl"

III) NH₂Cl +

IV) 0 =

Urease

Nitroprussidv

CO₂ + 2NH₅

NH₂Cl + OH"

- OH

-NCl +

⁰^

ClN =

=N

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/2

Die Reaktionefolge II, III, IV₁ wurde von Weichselbaum et al (Anal. Chem. 4I_-, 848, 1969) untersucht und beschrieben sowie vor kurzem von Patton et al (Anal. Chem. 49, 464, 1977).

Bei der Reaktion II wirkt die Nitroprussid-Verbindung als Katalysator und kann durch andere Substanzen, beispielsweise Aquopentacyanoferrat ersetzt werden.

Fatton hat in seiner Veröffentlichung auch einige Verbindungen beschrieben, die anstelle von Phenol für die Reaktion III und IV eingesetzt werden können. Hierzu gehört auch das 2-Carboxylderivat, allgemein als Salicylsäure bekannt. Salicylsäure oder besser Natriumsalicylat wird in einigen handelsüblichen Testpackungen oder Testsätzen (Kit) für die quantitative Bestimmung von Harnstoff verwendet (beispielsweise im Rochet Kit).

Alle Veröffentlichungen und handelsüblichen Testsätze, die für die quantitative Bestimmung von Harnstoff bakannt sind, sehen drei voneinander getrennte Reaktionssysteme vor, nämlich:

a) Urease-Puffer

b) Phenol (oder substituiertes Phenol)-Nitroprussid-Verbindung

c) Alkalihypochlorit (oder eine Substanz mit gleichartiger Funktion).

Die Bestimmung des Harnstoffes damit erfolgt ebenfalls in drei Stufen, nämlich:

1) Vermischen der Probe mit Urease-Puffer und Inkubation,

2) Zugabe von Phenol-Nitroprussidkomplex,

3) Zugabe von Hypochlorit, Inkubation und photometrische Ablesung.

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Die Anzahl der Reagentien und damit die Anzahl der Zugabe

und Stufen kann aus folgenden Gründen nicht verringert werden:

A) Phenol und/oder Hypochlorit können nicht mit Urease vermischt werden, weil dieses Enzym durch die beiden Substanzen schnell denatuiert bzw. zerstört wird.

B) Phenol und Hypochlorit können nicht im voraus zusammengemischt werden, weil diese Hisohung rasch ihre Reaktionsfähigkeit verliert; wahrscheinlich aufgrund der Bildung von chlorierten Phenolderivaten, die für die oben genannte Reaktionsabfolge ungeeignet sind.

Diese seit langem tief verwurzelten Vorstellungen wurden bisher als gültig angesehen, auch für Substanzen, die anstelle von Phenol oder Hypochlorit treten können,

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, das dies in einigen Fällen nicht zutrifft. Wird z. B. Salicylat anstelle von Phenol verwendet, so kann die Urease gleichzeitig damit eingesetzt werden und die Reaktionsäbfolge lautet dann folgendermaßen:

1. Vermischen der Probe mit einem Reagens, das Urease - Puffer -Salicylat (oder eine äquivalente Verbindung) - Nitroprussidkomplex enthält und Inkubation;

2. Zugabe des Hypochlorits, Inkubation und photometrische Ablesung.

Die Zahl der Reagentien bzw. Reaktionsstufen verringert sich damit von drei bei den bisher bekannten Systemen auf zwei beim neuen, erfindungsgemäßen Verfahren. In gleicher Weise wird die Anzahl der Zugaben auf zwei verringert; dies bringt eine erhebliche Vereinfachung mit sich, sowohl wenn die Harnstoffbestimmung manuell durchgeführt wird (geringere Anzahl an Pipe.tt ie rangen ) als auch wenn die Bestimmung automatisch vorgenommen wird (vereinfachte Vorrichtung).

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ORIGINAL INSPECTED

U-52 653 -M 5

Die Reaktionen.von denen Gebrauch gemacht wird, sind bekannt und werden seit langem genutzt· Erfindungsgemäß aber ist es möglich geworden, in einem einzigen Reagens die Urease, den Puffer, das Salicylat und die Nitroprussldverbindung miteinander zu kombinieren.

Wie oben bereits gesagt, kann das Salicylat durch eine Verbindung mit äquivalenter Funktion ersetzt werden. Hierzu gehören u. a. folgende Substanzen, die sich als günstig erwiesen haben: 3-Methylsalioysäure, 4-Methylsalicysäure und 3-Hydroxybenzoesäüre, weiterhin kann auch die Nitroprussidverbindung ersetzt werden, beispielsweise durch Aquopentaoyanof errat. Dieses Ergebnis war auf Grund der bekannten Verfahrensweisen nicht vorsehbar.

Das folgende Beispiel dient zur näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel Es wurden folgende Lösungen hergestellt:

A) (mit Salicylat) Komponenten für 100 ml

Phosphat Puffer 2-20 Millimol Natriumsalicylat o,4- 4g Nitroprussidnatrium 50 - 500 mg

Urease 2 000 -20 000 Einheiten pH 7,5- 10,5

B) (mit 3-Methylsalicylsäure) Komponenten für 100 ml Lösung:

K₂HPO₄ 150 - 2 300 mg

3-Methylsalicylsäure 30 - 300 mg

Nitroprussidnatrium 30 - 500 mg

Urease 2 000 - 20 000 Einheiten pH 7,5- 10,5

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1A-52 655

Sie Reagentien A) und B) wurden zusammen mit dem folgenden
Reagens C) verwendet, dessen für sofortige Verwendung geeignete Konzentration lautet:

Natriumhypochlorit 2 - 12 Millimol
HaOH 50 - 250 Hillimol.

2,5 ml Reagens (A+B) und 0,020 ml Probe wurden 5 bis 10 Hinuten inkubiert und darauf 2,5 ml Reagens C) zugegeben; die erhaltene Lösung wurde weitere 5 bis 10 Hinuten inkubiert·
Sie entstandene Farbe bzw. Färbung wurde im Spektrophometer bei 580 bis 700 m um gemessen.

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Claims

LR.-ING. FRANZ TUESTHOPF PATENTANWÄLTE . Λ DR. VHIL. FREDA VUESTHOPF (1917-I956) WUESTHOFF -ν. PECHMANN-BEHRENS-GOET2 d,pl,,ng.g«,hard DI PL-CHE M. DR. E. FREIHERR VON PECHUANN PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE DR.-INC. DIETER BEHRENS MANDATAIRES AGREES PRES l'OFFICE EUROPEEN DES BREVETS DIPL.-ING.; DIFL.-VIRTSCH.-ING. RUPERT COBTZ 1A-52 653 0 0*57^9? D-8000 MÜNCHEN 90 Anm.: Istituto SieroterapicoZ 9 0 / J *· *> schweigerstrasse2 telefon: (089) 66 20 ji TELEGRAMM: PROTECTPATENT TB lex: 514070 Patentansprüche

1. Verfahren zur enzymatisch-kolorimetrischen Bestimmung von Harnstoff durch Spaltung mittels Urease und Umsetzung mit einer Nitroprussidverbindung, Phenolverbindung und Hypochlorit, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Probe mit einem Reagens vermischt, das Urease, einen Puffer, ein Salicylat und eine Nitroprussid-Verbindung enthält, inkubiert, und dann erst das

b) Hypochlorit zugibt, erneut inkubiert und dann photometrisch abliest.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man anstelle von Salicylat 3-Methylsalicylsäure verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle von Salicylat 4-Methylsalicylsäure verwendet.

A. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle von Salicylat 3-Hydroxybenzoesäure verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man anstelle der Nitroprussidverbindung Aquopentacyanoferrat verwendet.

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