DE2823824A1

DE2823824A1 - Stabilisierte, fluessige, phosphat enthaltende masse fuer diagnosezwecke und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2823824A1
Application number: DE19782823824
Authority: DE
Inventors: Ivan E Modrovich
Original assignee: MODROVICH IVAN ENDRE
Current assignee: MODROVICH IVAN ENDRE
Priority date: 1977-06-03
Filing date: 1978-05-31
Publication date: 1978-12-07
Also published as: FR2393310B1; GB1593949A; SE7805887L; JPS5412796A; CA1110527A; CH642456A5; FR2393310A1; US4132598A; SE447123B; JPS5618199B2; DE2823824C2

Description

- 9 Ivan Endre MODROVICH, 1O45 Mes Drive, Camarillo, Calif., V.St.A.

Stabilisierte, flüssige, Phosphat enthaltende Masse für Diagnosezwecke und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft allgemein neue und wertvolle Verbesserungen bei der Stabilisierung von Reagenzien für Diagnosezwecke und das Stabilisierungsverfahren sowie insbesondere flüssige, stabilisierte phosphathaltige Substrate für Reagenzien für Diagnosezwecke und das Stabilisierungsverfahren.

Eine Anzahl organische Gruppen enthaltender Diagnosereagenzien und insbesondere Diagnosereagenzien, die außer hydrolysierbaren Phosphatgruppen organische aromatische oder cyclische Gruppen enthalten, wie beispielsweise p-Nitrophenolphosphat, werden zur Bestimmung von verschiedenen Enzymen, wie sauren und alkalischen Phosphatasen, verwendet. Diese Enzyme, insbesondere die alkalische Phosphatase, finden sich im Blutserum, und ihre Anwesenheit in erhöhter Menge deutet auf anomale Zustände hin. Die alkalische Phosphatase ist im wesentlichen ein Leberfunktionsenzym, findet sich aber auch in Knochen und Knochenteilen des Körpers und in den Därmen von Mensch und Tier. Ein erhöhter Gehalt an alkalischer Phosphatase weist im allgemeinen auf eine Punktionsstörung der Leber hin. Aber auch die Bestimmung der sauren Phosphatase ist von großem Nutzen, da sie aus der Prostata stammt und für die Diagnose des Prostatakarzinoms verwendet wird.

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Die Phosphatasen sind besonders wirksam für bestimmte Diagnosen, weil sie eine hohe Affinität zu Phosphatgruppen, die an organische Gruppen, insbesondere an cyclische oder aromatische Gruppen, gebunden sind, haben und die Phosphatgruppe von dem Rest abspalten. Die Bestimmung beispielsweise der alkalischen und der sauren Phosphatase erfolgt daher in Gegenwart einer phospho-organischen Verbindung sowie in Gegenwart von Magnesiumionen. Die Messung der durch Umsetzung mit den Phosphatasen in einer bestimmten Zeit gebildeten Phosphationen ergibt eine ziemlich genaue Bestimmung.

Einige Methoden der Bestimmung alkalischer und saurer Phosphatasen werden technisch angewandt. Bei einer solchen Methode erfolgt die Bestimmung alkalischer Phosphatase mittels Phenolphosphat, wobei das Phenolphosphat in Gegenwart von Magnesiumionen zusammen mit der alkalischen Phosphatase inkubiert wird. Das zufolge der Aktivität der alkalischen Phosphatase gebildete freie Phenol wird nach einer Zeit, in der die Umsetzung erfolgt ist, gemessen. In gleicher Weise kann Glycerinphosphat verwendet werden. Ein sehr übliches Substrat für solche Phosphatasebestimmuagen ist p-Nitrophenolphosphat, in dem eine Nitrogruppe in p-Stellung in dem Phenol steht und eine Phosphatgruppe durch eine schwache Sauerstoffbindung an die Phenolgruppe gebunden ist. Bei der Umsetzung mit der alkalischen Phosphatase wird die Phosphatgruppe abgespalten, so daß freies p-Nitrophenol entsteht. Das p-Nitrophenolphosphat ist ein bei alkalischem pH farbloses Material, während das Nitrophenolphosphat bei alkalischem pH eine gelb gefärbte Substanz ist.

Diese verschiedenen Substrate, die für die Bestimmung der alkalischen Phosphatase und der sauren Phosphatase verwendet werden, sind labile organische Verbindungen insofern, als sie in wäßrigen Lösungen und auch in alkalischen Lösungen und anderen organischen

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Lösungen unter Abspalten der Phosphatgruppe hydrolysiert werden. D.h. Substrate sind als labil anzusehen, wenn das Phosphat in wäßriger Lösung hydrolysiert wird und damit die Moleküleigenschaften des Substrats nicht erhalten bleiben. Aus diesem Grund wird bei der derzeitigen Kommerzialisierung von Reagenzien für die Bestimmung alkalischer Phosphatase und saurer Phosphatase ein geeigneter Puffer zur Einstellung des pH verwendet. Beispielsweise werden die phosphathaltigen Verbindungen, wie das p-Nitropheno1phosphat, in trockenem Zustand geliefert, auch wenn das die Magnesiumionen liefernde Magnesiumsalz anwesend ist. Pur die Durchführung einer Bestimmung wird dem trockenen p-Nitrophenolphosphat ein Puffer zugesetzt, so daß eine wäßrige Lösung des Puffers und des p-Nitrophenolphosphats gebildet wird, die dann zur Bestimmung der Aktivität der Phosphatase verwendet wird.

Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, das p-Nitrophenolphosphat und ähnliche labile Substrate in Gegenwart von stabilisierenden Reagenzien, die das p-Nitrophenolphosphat und ähnliche labile Komponenten stabilisieren und die Phosphatgruppe gegen eine Hydrolyse in einem flüssigen Medium abschirmen, in dem flüssigen Medium zu lagern.

Beim derzeitigen Stand der Technik wird das Reaktionsvermögen der Substrate dadurch stabilisiert, daß man sie in einem festen Zustand hält, was entweder durch Gefriertrocknen oder durch Trockenmischen, wie es zum Tablettieren getrockneter Pulver hauptsächlich in der pharmazeutischen diagnostischen Industrie und ähnlichen Industriezweigen angewandt wird, erfolgen kann, wobei das Substrat in einem Feststoff immobilisiert wird. Obwohl die genannten Begriffe vielversprechend erscheinen, sind solche Verfahren weder leicht durchführbar noch erwünscht und zudem aufwendig. Der

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Hersteller muß das Wasser entfernen und ein Teilprodukt liefern, wobei er auf einen Teil des Qualitätskontrollzyklus bei der Verdünnung und der Verwendung des Endprodukts verzichten muß. Die Laboratorien müssen die hohen Kosten der Verpackung, des Abfalls an Reagenzien, des Gefriertrocknens und Trockenmischens tragen, und die Verwendbarkeit des Produkts wird außerdem durch Art und Größe der Verpackungen beschränkt.

Weiterhin ist es schwierig, ein Produkt guter Einheitlichkeit zu erhalten. Das ergibt sich bereits daraus, daß für die meisten gefriergetrockneten Kontrollseren (Bezugsseren) die zulässige Flasche-zu-Flasche Variation an Enzymgehalt mit -10$ vom Mittel angegeben ist.

Gemäß der Erfindung werden die labilen Bestandteile einer flüssigen Lösung von Reagenzien wirksam stabilisiert, indem man die Abspaltung der einen Teil des Substrats bildenden Phosphatgruppe durch Hydrolyse verhindert, so daß die Aktivität der labilen Bestandteile nicht zum Tragen kommt. Dadurch wird eine Stabilisierung in einem flüssigen Medium über lange Dauer gewährleistet. Außerdem kann der Toleranzwert niedrig gehalten werden, d.h. die Nachteile der Feststoffpackungen und die hohen Kosten des Abpackens und des Gefriertroeknens sowie des Abfalls an Reagenz entfallen.

Hauptaufgabe der Erfindung ist daher ein flüssiges organisches Reagenz für Diagnosezwecke, das eine labile Verbindung mit einer Phosphatgruppe und einer cyclischen oder aromatischen Gruppe enthält und in einem Behälter gegen Hydrolyse stabilisiert ist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein stabilisiertes Reagenz der angegebenen Art von ausgezeichneter Lagerfähigkeit

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in einem Behälter, der wiederholt geöffnet werden kann, ohne daß es zu einem wesentlichen Abbau der labilen Bestanteile des Reagenzes kommt.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein stabilisiertes Reagenz der angegebenen Art, bei dem die labilen Komponenten in einem wäßrigen oder organischen Lösungsmittel anwesend sind und die Stabilisierung dieser labilen Komponenten ihre Reaktivität auch nach beträchtlicher Zeit nicht beeinträchtigt.

Labile organische Substrate, die einen Phosphatrest enthalten und insbesondere solche Substrate, die eine aromatische oder cyclische Gruppe und einen Phosphatrest enthalten, werden gemäß der Erfindung für lange Zeit stabilisiert, ohne daß ihre Reaktivität oder ihr photometrisches Absorptionsvermögen beeinträchtigt wird. Während der Herstellung, Verpackung, Lagerung und Verwendung dieser Reagenzien ist eine Qualitätskontrolle möglich. Die Nachteile der Abpackung in Packungen bestimmter Größe sowie die hohen Kosten des Verpackens, des Gefriertrocknens und des Anfalls von Abfall werden vermieden; und schließlich ist die Verwendbarkeit des Reagenzes für Enzymbestimmungen flexibel.

Die stabilisierten flüssigen Diagnosemittel gemäß der Erfindung erweisen sich bei Untersuchungen als mit frisch hergestellten entsprechenden flüssigen Reagenzien vergleichbar. Diese Untersuchungen können eine Beziehung von 1:1 zwischen dem gealterten Reagenz und einem frischen flüssigen Reagenz vergleichbarer Sensitivität und Präzision ergeben. Die Schaffung von Reagenzien dieser Art in der Form einer stabilen Flüssigkeit erhöht die Anwendbarkeit nach derzeit üblichen kolorimetrischen sowie nach anderen Methoden. Stabile flüssige Reagenzien sind insbesondere dort

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-U-

von Vorteil, wo Substratverbrauch und Reaktivitäten die Grundlage einer Messung bilden. Das flüssige Reagenz gemäß der Erfindung empfiehlt sich aber außerdem durch eine bessere Homogenität und Abfüllbarkeit und die Flexibilität der Anwendung gegenüber Trocken- oder gefriergetrockneten Präparaten.

Bei der Bestimmungsreaktion können Enzyme und in manchen Fällen Coenzyme und/oder Substrate anwesend sein. Typische Substrate, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise Glycerinphosphat, Phenolphosphat und p-Nitrophenolphosphat, Thymolphthalinphosphat und gewöhnlich das Mononatriumphosphat davon und dergleichen.

Die Reagenzien gemäß der Erfindung werden zur Bestimmung solcher Enzyme, wie saurer Phosphatase und alkalischer Phosphatase, die mit einem gemäß der Erfindung stabilisierten Substrat reagieren, verwendet. Wie erwähnt, enthalten diese in dem flüssigen Medium stabilisierten Substrate eine Phosphatgruppe, die von einer organischen Gruppe, vorzugsweise einer aromatischen oder cyclischen Gruppe, hydrolysierbar ist. Beim p-Nitrophenolphosphat beispielsweise, das ein einfaches organisches Molekül ist, ist die Nitrogruppe in p-Stellung zu der Phenolgruppe gebunden, und eine Phosphatgruppe ist über eine schwache Sauerstoffbindung an die Phenolgruppe gebunden. Im Verlaufe der Reaktion mit dem Enzym wird die Phosphatgruppe von dem Molekül abgespalten, so daß freies Phosphat und freies p-Nitrophenol gebildet wird. Die alkalische Phosphatase spaltet bei alkalischem pH die Phosphatgruppe von dem Substrat ab, und in gleicher Weise spaltet die saure Phosphatase die Phosphatgruppe bei saurem pH von dem Substrat ab.

Substrate dieser Art, wie beispielsweise das p-Nitrophenolphosphat, sind sehr labile organische Verbindungen, insofern, als

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die Phosphatgruppe in wäßriger oder auch alkoholischer Lösung abhydrolysiert wird, so daß das Substrat für eine EnzymbeStimmung unwirksam wird. Aus diesem Grund wird gemäß der Erfindung bei der Herstellung eines Reagenzes für die Bestimmung der alkalischen Phosphatase ein alkalischer Puffer, gewöhnlich 2-Amino-2-me thyI-1-propanol oder AMP mit dem p-Nitrophenolphosphat vermischt. Der Puffer ist normalerweise flüssig, und bei der Verwendung wird das p-Nitrophenolphosphat oder PNPP, das ein trockenes Material ist, in Lösung, gewöhnlich in einem wäßrigen Medium, eingemischt, und die Lösung wird zum Testen der Enzymaktivität verwendet. Gemäß der Erfindung wird ein Puffer in solcher Menge zugesetzt, daß das pH auf einen geeigneten Wert eingestellt wird. Beispielsweise wird im Falle der Stabilisierung des Substrats für die Bestimmung der alkalischen Phosphatase das Substrat durch eine stabilisierende Verbindung, beispielsweise Phenol, das die Phosphatgruppe auch bei erhöhten Temperaturen gegen eine Hydrolyse schützt, stabilisiert.

Nachdem die flüssige stabilisierte Lösung hergestellt ist, wird sie in bernsteinfarbene Glasflaschen abgefüllt und diese werden luftdicht verschlossen. Außerdem werden die Flaschen gewöhnlich unter Kühlen gelagert. Unter diesen Bedingungen sind die stabilisierten Enzyme und Coenzyme bis zu ein bis zwei Jahren lagerfähig, ohne daß ein beträchtlicher Abbau erfolgt.

Auf dem Gebiet der klinischen Diagnostik werden die Reagenzien gemäß der Erfindung gewöhnlich zur Bestimmung einer Enzymkonzentration, beispielsweise der Konzentration an alkalischer Phosphatase in biologischen Fluids und dergleichen, verwendet, können aber auch zur Auffindung und quantitativen Bestimmung anderer biologischer Bestandteile, beispielsweise saurer Phosphatase (ACP) oder

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alkalischer Phosphokinase (ALP) und dergleichen in biologischen Fluids verwendet werden.

Die oben genannten Enzyme reagieren oft in gleicher Weise mit den Substraten gemäß der Erfindung, und einige der ablaufenden chemischen Reaktionen sind gleich. Diese Enzyme sind auch nur als Beispiele genannt, d.h. auch andere Enzyme können gemäß der Erfindung bestimmt werden. Das folgende Reaktionsschema soll allgemein die Reaktionen veranschaulichen:

Reaktionsschema 1 — Allgemeines Modell

Enzym > (1) Substrat + Mg ^ * Produkt + P

Reaktionsschema 2 — Spezifisches Modell

(2) PNPP + (MgA + AMP) ^ PNP + P,

pH 10-10,5

Reaktionssehema 3 — Spezifisches Modell

O) PP + (MgA) > Phenol + P.

pH 4 - 4,5

Die in diesen Reaktionsgleichungen verwendeten Symbole haben die folgende Bedeutung:

PNPP p-Nitrophenolsphosphat MgA Magnesiumaspartat AMP 2-Amino-2-methyl-1-propanol PNP p-Nitrophenol P eine Phosphatgruppe, gewöhnlich PO^ PP Phenolphosphat

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Das allgemeine Modell zeigt, daß das Substrat gewöhnlich für ein bestimmtes Enzym mit einem Puffer vereinigt wird und die Bildung eines Produktes sowie einer Phosphatgruppe bewirkt. Die Phosphatgruppe ist normalerweise K)^* dessen Menge von der verwendeten Menge an dem Puffer und den jeweiligen Reaktionskomponenten abhängt. Die Phosphatgruppe kann als ein Ion in Lösung anwesend sein oder sonst an den Puffer gebunden sein, der im letzteren Fall als Rezeptor für die Phosphatgruppe dient.

Das Reaktionsschema 2 veranschaulicht ein spezifisches Modell für die Bestimmung alkalischer Phosphatase. In diesem Fall kann festgestellt werden, daß ein Magnesiumsalz, wie Magnesiumaspartat, zur Aktivierung des Enzyms anwesend ist. Das dritte Reaktionsschema ist ein spezifisches Modell für die Bestimmung saurer Phosphatase.

Gemäß der Erfindung wird das Substrat getrennt von dem Puffer in einen eigenen Behälter eingebracht und zur Zeit der Bestimmung mit dem Puffer vermischt. D.h. das Substrat und ein Stabilisator in einem flüssigen Medium sind in einem Behälter enthalten, und der Puffer und die Magnesiumverbindung in einem flüssigen Medium werden in einen anderen Behälter eingebracht.

Der Puffer enthält ein geeignetes Puffermittel, beispielsweise AMP. AMP wird vorzugsweise zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase als Puffer verwendet. Jedoch können auch andere Puffer verwendet werden, wie vorzugsweise aminoorganische Puffer, einschließlich Diäthylamin und Triäthylamin, ein Tris-puffer [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan]. Auch nicht-organische Puffer können verwendet werden. Zu diesen gehören beispielsweise Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat. Wesentlich für die Wahl des Puffers ist, daß er

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in der stabilisierten Masse den gewünschten pH-Bereich einzustellen vermag. In einigen Fällen kann es erwünscht sein, eine Säure, wie Salzsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure usw., zuzusetzen, um das pH auf den gewünschten-Wert einzustellen.

Der Puffer für das Reagenz zur Bestimmung der sauren Phosphatase kann verschiedene Salze und Säuren, die ein gewünschtes saures pH in der stabilisierten Masse einzustellen vermögen, enthalten. Beispielsweise können Natriumacetat/Essigsäure-, Natriumchlorid/Salzsäure -Puffer und "PIPES"-Puffer verwendet werden.

Das Magnesiumsalz dient der Aktivierung des Enzyms in Lösung und wird ebenfalls in den Puffer eingebracht. Das in der Puffermasse anwesende Magnesiumsalz ist vorzugsweise Magnesiumaspartat, da bei dessen Verwendung keine Ausfällung von Magnesium erfolgt. Jedoch können auch andere Magnesiumsalze, beispielsweise Magnesiumchlorid, Magnesiumacetat, Magnesiumfluorid und möglicherweise Magnesiumeitrat, verwendet werden. Weitere Puffer, die gemäß der Erfindung, zumindest für Bestimmungen der alkalischen Phosphatase, verwendet werden können, sind Diäthanolamin und Natriumcarbonat.

Der Puffer, der zur Einstellung des geeigneten pH-Bereiches verwendet wird, soll die Phosphataseaktivität nicht wesentlich stören. Für das Reagenz zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase soll der Puffer vorzugsweise ein pH von etwa 10,0 bis 10,5 ergeben, jedoch kann das pH auch in dem Bereich von etwa 9*5 bis 10,7 oder auch etwa 9 bis etwa 12 liegen, obwohl bei pH-Werten unter 10,0 und über 10,7 die Pufferkapazität sinkt. Im Falle des Reagenz für die Bestimmung der sauren Phosphatase soll der pH-Wert vorzugsweise in dem Bereich von etwa 4,0 bis 4,5 liegen, kann aber auch in dem Bereich von etwa 3,5 bis 4,8 liegen. Bei einem Wert unter

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j5,6 und etwas über 4,8 sinkt jedoch wiederum die Pufferkapazität.

Die Magnesiumverbindung ist in dem Puffer in einer Menge von etwa 10 mMol/Liter Lösung (a 10 millimolar concentration) anwesend, kann jedoch erforderlichenfalls auch in einer Menge in dem Bereich von etwa 0,5 bis 50 mMol/Liter Lösung (0.5 millimoler to about 50 millimoler) anwesend sein. Der Puffer, insbesondere der AMP-Puffer, ist in einer Menge von etwa 0,8 Mol/Liter Lösung (about 0.8 moles) anwesend, kann jedoch auch in einer Menge in dem Bereich von etwa 0,05 bis etwa 2 Mol (0.05 moles to about 2 moles) anwesend sein.

Das Substrat ist in dem Reagenz zusammen mit einem Stabilisierungsmittel, wie es im folgenden näher beschrieben ist, anwesend. Eines der bevorzugten Stabilisierungsmittel ist Phenol; jedoch können auch andere, im folgenden beschriebene Stabilisierungsmittel verwendet werden. In diesem Reagenz ist das Substrat, beispielsweise das PNPP, in einer Menge von etwa 100 mMol in Lösung bis zu einem Sättigungspunkt von etwa 1 Mol anwesend (100 millimoles in solution up to a saturation point of about 1 mole). Vorzugsweise ist das PNPP in einer Menge in dem Bereich von etwa 2 mMol bis etwa 0,8 Mol (about 2 millimoles to about .8 moles) in dem Reagenz anwesend. Die Menge an Phenol liegt etwa in dem gleichen Bereich; jedoch kann das Phenol in wenigstens dem Zweifachen der Menge an dem Substrat anwesend sein. Den Rest des stabilisierten Substrats bildet im allgemeinen Wasser.

Auch ein geeigneter Puffer, beispielsweise Triäthanolamin, Trihydroxyamin usw., kann zur Einstellung des pH auf etwa 8,0 bis etwa 9,5 und vorzugsweise etwa 8,5 bis etwa 9,0 in die Substratmasse eingebracht werden. Diese wird dem Puffer zur Zeit der Be-

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Stimmung in verhältnismäßig kleinen Mengen zugesetzt, so daß das pH des Gemisches aus beiden Massen dasjenige des Puffers ist. Der Puffer, beispielsweise das Triäthanolamin, dient auch als Löslichmacher für das Phenol oder einen anderen Stabilisator in dem Reagenz, der das Phenol bei höheren Konzentrationen löslich macht. Bei Abwesenheit dieses Puffers kann das Phenol bei höheren Konzentrationen zu einer Auftrennung in zwei Phasen, eine wäßrige Schicht und eine Phenolschicht, führen.

Andere Substrate, die gemäß der Erfindung stabilisiert werden können, sind beispielsweise Salze von PNPP, beispielsweise das Natriumsalz oder das Dicyclohexylaminsalz; außerdem das Di-[trishydroxymethol)-aminomethan]-salz; das p-Nitrophenolphosphatdicyclohexylammoniumsalz, das p-Nitrophenolphosphat-di-[2-amino-2-äthyl-1,3-propandiol]-salz und das p-Nitrophenolphosphat-dinatriumsalz-hexahydrat.

Außer Phenol kann der Stabilisator auch verschiedene Phenolverbindungen, die ebenfalls als Stabilisatoren wirksam sind, beispielsweise Phenolverbindungen mit der Sulfatgruppe, wie Parasulf ophenyl und Parasulfonsäurephenyl usw., enthalten. Es wurde auch gefunden, daß andere Stabilisierungsmittel als Phenol verwendet werden können. Zu diesen gehört beispielsweise Imidazol, das oft als "Glyoxalin" bezeichnet wird, nämlich C-H^Np. Auch verschiedene nitroaliphatische Verbindungen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Nitromethan, Nitroäthan usw., haben eine stabilisierende Wirkung; jedoch sind diese nitroaliphatischen Verbindungen weniger wirksam als Phenol und Phenolverbindungen. Phosphate sind allgemein nicht notwendig wirksame Stabilisatoren, da sie zusammen mit einem Magnesiumsalz ausfallen.

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Wenn der Puffer in Wasser gelöst wird, kann ein geeignetes bakteriostatisches Mittel, wie ein Azid, beispielsweise Natriumazid, vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,1 Gew.-$6 (about 0.1$ w/w) zugesetzt werden. Die Menge an Azid oder einem anderen bakteriostatischen Mittel kann in dem Bereich von 0,01 bis etwa 0,556 liegen. Es wurde gefunden, daß das Azid auch die Wirkung hat, die Stabilität der Masse weiter zu erhöhen. Außerdem können noch andere bakterizide oder fungizide Mittel, die nicht mit dem Puffer reagieren oder die enzymatische Umsetzung hindern, verwendet werden. Beispiele für solche Mittel, die zusätzlich zu Natriumazid verwendet werden können, sind Benzoesäure, Thymol und Pentachlorphenol. In vielen Fällen, insbesondere bei Verwendung von Puffern mit hohem pH, ist das bakteriostatische Mittel nicht notwendig und kann fortgelassen werden.

Der Mechanismus der Stabilisierung gemäß der Erfindung ist nicht vollständig geklärt. Jedoch wurde festgestellt, daß solange Phosphat in dem wäßrigen Medium durch Hydrolyse abgespalten wird, bis ein Gleichgewicht erreicht ist. Wesentlich ist natürlich die Reaktionskonstante K der Hydrolyse. Die Hydrolyse erfolgt nach der Gleichung:

(R-PO₄) + H⁺ ^⁺ R⁺ + PO₂

in der R-PO₂, die organische Verbindung mit einer Phosphatgruppe und R die Verbindung nach Abspaltung der Phosphatgruppe bedeuten.

Demnach ist die Reaktionskonstante

K =

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Die Reaktion kann also durch Überladen der Reaktionsprodukte rait R oder PO κ oder beiden verzögert werden. Eine Überladung des Reaktionsmediums mit PO₂^" kann die Umsetzung der Enzyme in einer Bestimmungsreaktion beeinträchtigen. Die Hydrolyse erfolgt bis zu einer Gleichgewichtssättigung, sofern keine Stabilisierung erfolgt, und es wurde weiterhin festgestellt, daß der Stabilisator die gleiche Wirkung wie die Reaktionsprodukte hat, so daß das Phenol und die anderen Stabilisatoren die Hydrolyse von Verbindungen, wie p-Nitrophenolphosphat, wirksam behindern.

Gemäß der Erfindung wird also ein Stabilisator verwendet, der in dem Reaktionsmedium die gleiche Wirkung hat wie das PO₂," oder das R⁺. Auf diese Weise wirkt der Stabilisator wie ein Überschuß an POj₊" oder R⁺ und inhibiert dadurch die Hydrolyse. Der Stabilisator soll also, wenigstens hinsichtlich seiner Wirkung in der Lösung, dem tatsächlich vorhandenen R⁺, beispielsweise, ausreichend nahekommen. Bei der tatsächlichen Enzymbestimmung dagegen ist das Enzym sehr spezifisch und wird nur durch das Substrat und das spezielle Endprodukt, nicht aber von dem Stabilisator angegriffen.

Es wurde gefunden, daß das Substrat, wenn es gemäß der Erfindung stabilisiert ist, eine überraschend hohe Stabilität von bis zu 18 Monaten bis 2 Jahren bei etwa 4⁰C oder Kühlschranktemperaturen hat. Bei Raumtemperaturen wird das Substrat für bis zu 2 oder 3 Monate fast vollständig stabilisiert.

Bei der Verwendung wird das stabilisierte Substrat dem Puffer entweder in bekannter Menge oder tropfenweise, je nachdem, was bevorzugt ist, zugesetzt. Die so erhaltene Lösung wird dann durchmischt und bei Raumtemperatur zur Bestimmung der Phosphatasewirkung verwendet, indem man dem Gemisch die Phosphatase zusetzt. Die

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Lösung aus stabilisiertem Substrat und Puffer enthält vor der Analyse den alkalischen Puffer mit dem gewünschten pH-Bereich, wie oben angegeben, das Magnesiumsalz und das Substrat sowie das Stabilisierungsmittel.

In diesem Gemisch ist das Magnesiumsalz in einer Menge von etwa 0,5 bis etwa 50 mMol/Liter (about 0.5 millimolers up to about 50 millimolers) und das Substrat in einer Konzentration von nicht unter 0,5 mMol/Liter bis zu etwa 30 mMol/Liter (0.5 millimolers up to about a concentration of about 30 millimolers) anwesend. Es wurde gefunden, daß das Phenol oder sonstige Stabilisierungsmittel ebenso wenig wie die Löslichmacher, beispielsweise das Triäthanolamin, die Phosphatasebestimmung stören. Es wurde weiterhin gefunden, daß das Phenol bei sehr hohen Konzentrationen die Umsetzung zwar etwas, jedoch nur in vernachlässigbarem Ausmaß behindert. Der Löslichmacher wird in das flüssige Substrat eingebracht, um eine Phasentrennung des Stabilisierungsmittels zu verhindern.

Nachdem das stabilisierte Substrat und der Puffer miteinander vermischt sind, wird die Probe der Körperflüssigkeit, die die Phosphatase enthält, dem Gemisch zugesetzt. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wird bei konstanter Temperatur und etwa 405 nm bestimmt. Die konstante Temperatur kann irgendwo zwischen etwa Raumtemperatur, 25⁰C, oder darunter, beispielsweise 20⁰C, bis zu 4o°C oder sogar 50⁰C betragen. Bei über 50⁰C denaturieren offensichtlich die alkalischen Phosphatasen, so daß die Bestimmung praktisch nicht mehr möglich ist.

Die Substratlösung ist in ihrer stabilisierten Form lichtempfindlich und wird daher normalerweise in dunklen oder bernstein-

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farbenen Flaschen, die aus irgendeinem Material, das nicht mit dem stabilisierten Substrat reagiert, beispielsweise Plastik oder Glas, bestehen können, abgefüllt.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1

0,8 Mol AMP werden zu Magnesiumaspartat in einem wäßrigen Medium zugesetzt, und die Lösung wird mit einer geringen Menge Salzsäure versetzt, um einen Puffer vom pH etwa 10,2 herzustellen.

Dann wird p-Nitrophenolphosphat mit Phenol in trockener Form vermischt und einer wäßrigen Lösung in solcher Menge zugesetzt, daß das p-Nitrophenol in einer Menge von etwa 1 Mol und das Phenol in einer Menge von etwa 1,5 Mol anwesend ist. Außerdem wird Triäthanolamin zur Einstellung des pH auf etwa 8,6 und zur weiteren Verzögerung der Hydrolyse des p-Nitrophenylphosphats zugesetzt. Die Lösung wird mit destilliertem Wasser zu einer Substratmasse aufgefüllt.

Nachdem eine vollständige Lösung erzielt ist, wird die Pufferlösung in einen Plastik- oder Glasbehälter eingebracht, der dann verschlossen wird. In gleicher Weise wird die Substratlösung in einen bernsteinfarbenen Plastik- oder Glasbehälter eingebracht, der dann verschlossen wird. Die Behälter werden abgedichtet und unter Kühlen gelagert. Es wurde gefunden, daß eine in dieser Weise stabilisierte Masse eine Lagerstabilität von bis zu 2 Jahren ohne merklichen Abbau hat.

Beispiel 2

Substrat und Puffer, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben,

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werden miteinander gemischt, und dem Gemisch wird eine alkalische Phosphatase enthaltende Körperflüssigkeit zugesetzt. Das als Stabilisator anwesende Phenol beeinträchtigt die Umsetzung mit der alkalischen Phosphatase offensichtlich nicht. Die Phosphatgruppe des p-Nitrophenols wird von dem p-Nitrophenolphosphat abgespalten und ergibt eine Grundlage für die Bestimmung der alkalisehen Phosphatase.

Beispiel 3

Magnesiumacetat wird anstelle des Magnesiumaspartats in Beispiel 1 in praktisch der gleichen Menge wie das Magnesiumaspartat verwendet. Auch dieses Substrat zeigte die gleiche Lagerungsbeständigkeit ohne wesentlichen Abbau.

Beispiel 4

Magnesiumchlorid wird anstelle des Magnesiumaspartats von Beispiel 1 in praktisch der gleichen Menge wie das Magnesiumaspartat verwendet. Auch dieses Substrat zeigte die gleiche Lagerungsbeständigkeit ohne beträchtlichen Abbau.

Beispiel 5

Triäthynolamin wird anstelle des AMP von Beispiel 1 in praktisch der gleichen Menge wie das AMP in Beispiel 1 verwendet. Auch dieses Substrat zeigte die gleiche Lagerungsbeständigkeit ohne beträchtlichen Abbau.

Beispiel 6

Parasulfophenyl wird anstelle des Phenols von Beispiel 1 in praktisch der gleichen Menge wie das Phenol verwendet. Auch dieses Substrat zeigte die gleiche Lagerungsbeständigkeit ohne beträchtlichen Abbau.

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Beispiel 7

Imidazol wurde anstelle des Phenols von Beispiel 1 in praktisch der gleichen Menge wie das Phenol in Beispiel 1 verwendet. Auch dieses Substrat zeigte die gleiche Lagerungsbeständigkeit ohne wesentlichen Abbau.

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Claims

Licht - Dr. '2-':!mldt Hansrnir.nri ■ J !arrnn Postfech 7012 03 0000 München 7Q US 803,036 3 t MAI 1S?Ö R/S ch Ivan Endre MODROVICH, 10^-3 Mesa.Drive, Camarillo, Calif., V.St.A. Stabilisierte, flüssige, Phosphat enthaltende Masse für Diagnose· zwecke und Verfahren zu ihrer Herstellung Patentansprüche

1.) Verfahren zum Stabilisieren einer für Diagnose zwecke zu verwendenden organischen Verbindung, die einen Phosphatanteil enthält, gegen Hydrolyse in einer wäßrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Verbindung mit (1) Phenol oder einer Phenolverbindung oder (2) Imidazol oder (3) einer nitroaliphatischen Verbindung mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen als Stabilisierungsmittel vermischt, wobei das Stabilisierungsmittel etwa die Wirkung der cyclischen oder aromatischen Gruppe ohne den Phosphatanteil, die bei einer Hydrolyse gebildet werden würde, oder die Wirkung des Phosphatanteils, der bei der Hydrolyse gebildet würde, hat und dadurch eine Hydrolyse der Verbindung inhibiert, das Gemisch aus der Verbindung und dem Stabilisierungsmittel in eine Wasser enthaltende Flüssigkeit einbringt, um eine wäßrige Lösung davon zu bilden, und diese Lösung lagert.

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ORIGINAL INSPECTED

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferverbindung mit einer Magnesiumverbindung vermischt
und dieses Gemisch in eine Wasser enthaltende Flüssigkeit einbringt, um einen wäßrigen Puffer herzustellen, derart, daß die Pufferverbindung in dem wäßrigen Puffer in solcher Menge anwesend ist, daß ein pH in den für eine Phosphatasebestimmung
gev/ünschten Bereich eingestellt wird.

j5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferverbindung mit einer Magnesiumverbindung vermischt
und dieses Gemisch in eine Wasser enthaltende Flüssigkeit einbringt, um einen wäßrigen Puffer herzustellen, derart, daß die Pufferverbindung in dem wäßrigen Puffer in solcher Menge anwesend ist, daß ein alkalisches pH in dem Bereich von 9*5 bis
10,7 für die Bestimmung alkalischer Phosphatase eingestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferverbindung mit einer Magnesiumverbindung vermischt
und das Gemisch in eine Wasser enthaltende Flüssigkeit einbringt, um einen wäßrigen Puffer herzustellen, derart, daß die Pufferverbindung in dem wäßrigen Puffer in solcher Menge anwesend ist, daß ein pH in dem Bereich von 10,0 bis 10,5 für die Bestimmung alkalischer Phosphatase eingestellt wird.

5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferverbindung mit einer Magnesiumverbindung vermischt
und das Gemisch in eine Wasser enthaltende Flüssigkeit einbringt, um einen wäßrigen Puffer zu bilden, derart, daß die Pufferverbindung in dem wäßrigen Puffer in solcher Menge anwesend ist, daß ein saures pH in dem Bereich von 3*5 bis 4,8 für die Bestimmung saurer Phosphatase eingestellt wird.

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6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferverbindung mit einer Magnesiumverbindung vermischt und das Gemisch in eine Wasser enthaltende Flüssigkeit einbringt, um einen wäßrigen Puffer herzustellen, derart, daß die Pufferverbindung in dem wäßrigen Puffer in solcher Menge anwesend ist, daß ein saures pH in dem Bereich von 4,0 bis 4,5 für die Bestimmung saurer Phosphatase eingestellt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stabilisierungsmittel Phenol oder eine Phenolverbindung ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für Diagnosezwecke zu verwendende Verbindung ein labiles Substrat, wie es für die Bestimmung einer Phosphatase verwendet wird, ist.

9. Verfahren nach Anspruch J, dadurch gekennzeichnet, daß der flüssigen Lösung ein Löslichmacher zugesetzt wird, um eine Phasentrennung des Stabilisierungsmittels zu verhindern.

10. Verfahren nach Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat p-Nitrophenolphosphat ist.

11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Magnesiumverbindung Magnesiumaspartat ist.

12. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die als Reagenz verwendete Verbindung eine cyclische oder aromatische Gruppe, an die der Phosphatanteil gebunden ist, enthält.

13· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die als Reagenz verwendete Verbindung für eine Phosphatasebestimmung verwendet wird und ein Substrat ist, das hinsichtlich einer

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Phosphatase spezifisch ist, derart, daß das Enzym in einer Bestimmungsreaktion von dem Substrat oder dem Endprodukt oder beiden, nicht aber von dem Stabilisierungsmittel angegriffen wird, wobei in dem Verfahren weiterhin ein wäßriger Puffer hergestellt wird, indem man eine Pufferverbindung mit einer Magnesiumverbindung vermischt und das Gemisch von Pufferverbindung und Magnesiumverbindung in eine Wasser enthaltende Flüssigkeit einbringt, um einen wäßrigen Puffer herzustellen, in dem die Pufferverbindung in solcher Menge anwesend ist, daß das pH in einen für eine Phosphatasebestimmung geeigneten Bereich eingestellt wird, und der wäßrige Puffer in einem anderen Behälter aufbewahrt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13.. dadurch gekennzeichnet, daß das Stabilisierungsmittel Phenol oder eine Phenolverbindung ist.

15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der wäßrigen Lösung von Substrat und Stabilisierungsmittel ein Löslichmacher zur Verhinderung einer Phasentrennung des Stabilisierungsmittels zugesetzt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 13* dadurch gekennzeichnet, daß bei diesem Verfahren das labile, als Reagenz für Diagnosezwecke zu verwendende Substrat gegen eine normalerweise in Abwesenheit eines Stabilisators nach der Reaktionsgleichung'·

R - PO₄ + H⁺ R⁺ + PO₄

erfolgende Hydrolyse stabilisiert wird, wobei in der obigen Reaktionsgleichung R - PO₄ eine cyclische oder aromatische Gruppe mit einem darin gebundenen Phosphatanteil und PO₄ eine davon abhydrolysierte Phosphatgruppe bedeutet und R ein Reaktionsprodukt

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von R mit von diesem abhydrolysiertem Phosphatanteil bedeutet.

17· Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat p-Nitrophenolphosphat oder ein Salz davon und das Stabilisierungsmittel Phenol oder eine Phenolverbindung ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat in einer Menge von etwa 100 mMol bis zu etwa Sättigungskonzentration und das Stabilisierungsmittel in einer Menge von etwa 100 mMol bis etwa dem Zweifachen der Menge an Substrat anwesend ist.

19. Mittel, das eine labile, als Reagenz für Diagnosezwecke dienende und gegen eine Hydrolyse in einer wäßrigen Lösung stabilisierte organische Verbindung enthält, wobei diese Verbindung einen Phosphatanteil enthält und durch die Anwesenheit von (1) Phenol oder einer Phenolverbindung oder (2) Imidazol oder (3) einer nitroaliphatischen Verbindung mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen als Stabilisierungsmittel stabilisiert ist und das Stabilisierungsmittel etwa die Wirkung der cyclischen oder aromatischen Gruppe ohne den davon in einer Hydrolyse abgespaltenen Phosphatanteil oder die Wirkung des Phosphatanteils, der bei einer Hydrolyse gebildet werden würde, hat und dadurch eine Hydrolyse der Verbindung inhibiert, und außerdem eine Wasser enthaltende Flüssigkeit, in der das Gemisch von als Reagenz dienender Verbindung und Stabilisierungsmittel praktisch unter Bildung eines wäßrigen Mittels gelöst sind, enthält.

20. Mittel nach Anspruch 19* dadurch gekennzeichnet, daß es zusammen mit einem Puffer, der aus einem Gemisch einer Pufferverbindung und einer Magnesiumverbindung, die in einer Wasser ent-

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haltenden Flüssigkeit als wäßriger Puffer anwesend sind, derart, daß in dem Puffer ein pH in einem für eine Phosphatasebestimmung geeigneten Bereich eingestellt wird, verwendet wird.

21. Mittel nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Stabilisierungsmittel Phenol oder eine Phenolverbindung ist.

22. Mittel nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das für Diagnosezwecke anwesende Reagenz ein labiles Substrat, wie es für die Bestimmung einer Phosphatase verwendet wird, ist.

23. Puffer nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Bereich für die Bestimmung alkalischer Phosphatase 9,5 bis 10,7
ist.

24. Puffer nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Bereich für die Bestimmung alkalischer Phosphatase 10,0 bis 10,5 ist.

25. Puffer nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Bereich für die Bestimmung saurer Phosphatase 3,5 bis 4,8 ist.

26. Puffer nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Bereich für die Bestimmung saurer Phosphatase 4,0 bis 4,5 ist.

27. Mittel nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das
Substrat p-Nitrophenolphosphat ist.

28. Puffer nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die
Magnesiumverbindung Magnesiumaspartat ist.

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29. Mittel nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung eine cyclische oder aromatische Gruppe mit daran gebundenem Phosphatanteil enthält.

30. Stabilisiertes flüssiges Mittel nach Anspruch 19* dadurch gekennzeichnet, daß es für eine PhosphatasebeStimmung bestimmt ist und die Verbindung ein labiles organisches als Diagnosereagenz dienendes Substrat, das gegen eine Hydrolyse in wäßriger Lösung stabilisiert ist, ist und eine cyclische oder aromatische Gruppe, an die der Phosphatanteil gebunden ist, enthält, wobei das Substrat insofern spezifisch mit einer Phosphatase reagiert, als dieses Enzym in einer Bestimmungsreaktion von dem Substrat oder dem Endprodukt, nicht aber von dem Stabilisierungsmittel angegriffen wird, sowie dadurch, daß ein wäßriger Puffer aus einem Gemisch einer Pufferverbindung und einer Magnesiumverbindung in einer Wasser enthaltenden Flüssigkeit, in der die Pufferverbindung in solcher Menge anwesend ist, daß ein für eine Phosphatasebe-Stimmung geeigneter pH-Bereich eingestellt wird, in einem anderen Behälter gelagert wird.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Stabilisierungsmittel Phenol oder eine Phenolverbindung ist.

32. Stabilisiertes, ein Substrat enthaltendes Mittel nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat die allgemeine Formel R - POh hat und in einer wäßrigen Lösung gegen eine Hydrolyse nach der Reaktionsgleichung:

R - PO₄ + H⁺ R⁺ + PO₄

die normalerweise bei Abwesenheit eines Stabilisierungsmittels

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vollständig ablaufen würde, stabilisiert ist, wobei in dieser Reaktionsgleichung R - PO₂^ eine cyclische oder aromatische Gruppe mit daran gebundenem Phosphatanteil und PO₁, eine Phosphatgruppe, die davon abhydrolysleren würde, bedeutet und R⁺ ein Reaktionsprodukt von R nach Abhydrolysleren des Phosphatanteils bedeutet.

~55. Mittel nach Anspruch ^2, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat p-Nitrophenolphosphat oder ein Salz davon und das Stabilisierungsmittel Phenol oder eine Phenolverbindung ist.

y\. Mittel nach Anspruch 33* dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat in einer Menge von etwa 100 mMol bis zu etwa Sättigung und das Stabilisierungsmittel in einer Menge von etwa 100 mMol bis zu wenigstens der doppelten Menge des Substrats anwesend ist.

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