JPS60237999A - アルカリホスフアタ−ゼ用乾式分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アルカリホスファターゼ（以下ムＬＰと略記
する）を定量するための改良された乾式分析素子に関す
る。

〔従来技術〕

ＡＬＰは、すん酸モノエステラーゼの１種であシ、シん
酸モノエステルの加水分解を触媒する酵素である。

これは動物の組織に広く分布し、殊に、骨、腸粘膜、腎
皮質、乳腺、乳汁、肝臓、胆汁、血清及び胎盤に存在し
ていることが知られている。

そして、ムＬＰ活性の増加は、例えば、肝、腸又は骨に
関連する病気、あるいは受精の指標とされている。

そこで、１９５０年から、とのムＬＰの検出、更に進ん
で定量分析するための方法の研究が進められている。

従来、ムＬＰの検出又は定量方法としては各種の方法が
開発されている。

それらは大別して、ムＬＰの基質、すなわちりん酸のモ
ジエステル又はその塩にムＬＰを作用させ、直接色素を
放出させて、その色素濃度を測定する方法（例えば、特
公昭４５−５４８７２号、同５２−４２４５８号、特開
昭５４−１０４３　’９０号参会報等参照）と、直接色
素を放出しない基質にムＬＰを作用させ、その生成物を
、酸化又は他の化合物と反応させて色素を生成させ、そ
の濃度を測定する方法（例えば、特公昭４９−４２９４
９号、同４５−２７１９９号、特開昭５５−１０２４０
０号各公報等参照）とがある。

これらは、いずれ本操作が煩雑であるという問題点があ
る。

他方、上述のごとき従来の分析方法に対して操作性の簡
便なドライ・ケミストリイーを用い、その上高い定量性
を有する多層分析素子が知られている。例えば特公昭５
Ｂ−２１６７７号、特開昭５５−１６４５５６号、同５
７−１２５８４７号、同５７−１９７４６６号及び同５
８−９０１６７参照公報等に上記多層分析素子が記載さ
れている。

これら素子は、支持体上に、試薬層及び／又は展開層等
を設けたもので、その定量分析操作が簡便なものである
。しかしながら、既述のムＬＰの定量分析用に、前記の
多層分析素子を使用した公知例はない。

そこで本発明者等は、ムＬＰの定量分析用に、前記の多
層分析素子を使用することについて検討を重ねた結果、
本発明に到達した。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、操作が簡便であり、且つ保存安定性の
優れたＡＬＰ定量用乾式分析素子を提供することにある
。

〔発明の構成〕

本発明を概説すれば、本発明はムＬＰ定量用乾式分析素
子に関する発明であって、支持体上にムＬＰの基質が含
有されている層を有するムＬＰを定量するための乾式分
析素子において、該基質が該層中に微粉末の状態で含有
されていることを特徴とする。

ＡＬＰの基質としては、既述のように各種の物質が知ら
れているが、本発明の分析素子においては、ＡＬＰの作
用によって直接色素を放出する基質が好適である。その
ような基質としては、ｐ−ニトロフェニルジん酸、チモ
ールフタレインシん酸、フェノールフタレイン〕ん酸及
びそれらの塩が知られている。

これらのうち、ムＬＰの作用で生成するチモールフタレ
インは、高アルカリ性（ｐＨ≧１２）でないと発色しな
い点で、またフェノールフタレインは発色が極端に低い
点で、いずれもあまシ適当で力＜、それに対して、ｐ−
ニトロフェニルジん酸（以下、ｐ−ＮＰＰ　と略記する
）又はその塩は、ＡＬＰ活性が最高のｐＨ１０，４前後
で直接発色する色素を放出する点で、本発明の分析素子
用に最適のムＬＰ基質である。

一般に、分析試薬を多層分析素子中に組込むには、その
均一分散を確保するために、通常該試薬を適当な溶媒中
に溶解して溶液を造り、それを試薬層塗布液中に分散溶
解させて使用するか、該溶液をまず粉末ｐ紙に含浸させ
、それを展開層中に分散させる方法が採られている。

本発明者等は、この常法に従って、前記ムＬＰの基質を
多層分析素子に組込んだところ、いずれの場合にも、程
度の差はあるが、５℃における１日の保存で基質の分解
を示すフェノール類の生成が確認され、実用上不適当な
ものであることが判明した。

そこで本発明者等は鋭意検討した結果、本発明における
微粉末分散法を見出した。

本発明の分析素子におけるＡＬＰ基質の粒度は、均一分
散の面から小さい程好ましいが、微粒子化の操作及びコ
スト上からの制限がある。しかして、本発明者等の実験
によれば、平均粒径が５０μｍ以下であれば、大なる影
響はなく、１μｍ程度で、十分定量分析に実用できるこ
とを見出した。

また、これらＡＬＰの基質粉末は、多層分析素子の展開
層中に分散させるのが好適であることも見出した。した
がって、識別能は劣るが、ムＬＰの基質粉末を、試薬層
又は反射層中に分散させてもよい。

それ故、本発明の分析素子の構成は、支持体上に展開層
のみを有する構成、又は支持体上に少なくとも１層の親
水性コロイド層及び展開層を有する構成、あるいはこれ
らに必要に応じて他の試薬層及び／又は反射層を設けた
構成としてよい。

そして、ＡＬＰの基質を糾込む方法としては、基質を混
入させる層の塗布液として、該基質を溶解しない液を用
い、それに基質を添加し、均一に分散させればよく、そ
れには、分散剤、助剤、粉末Ｆ紙等を更に添加してもよ
い。しかして、この基質は、その添加前及び／又は添加
後（すなわち液中）に微粉砕して微粉末の状態とすれば
良い。

定量分析は、本発明の分析素子にムＬＰ含有被検液、例
えば血清を滴下し、インキュベートしながら、生成する
加水分解物、例えばｐ−ＮＰＰの場合はｐ−ニトロフェ
ノールの濃度の経時変化を特定スペクトルで光学測定す
ることによシ行えばよい。

本発明の分析素子は、５℃における保存で３か月以上本
安定である。このことは、基質を組込む場合に、いずれ
かの時点でも、一旦溶解すると、保存安定性が極度に劣
化するものと推定される。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ （１）塗布液調製 （、）試薬層−１ ゼラチン７．５Ｆ、）リイソプロビルナ７タレンスルホ
ン酸ナトリウム１ｆ及び炭酸水素ナトリウム２．５２ｆ
を蒸留水８０−に溶解後、４モル／ｌの水酸化す）　Ｉ
Ｊウム水溶液でｐＨＩＧ、４に調整し、次いで蒸留水を
加えて全量を１００１に調整して、試薬層−１用塗布液
とした。

（ｂ）試薬層−２ ゼラチン１０ｆ！及びトリイソプロピルナフタレンスル
ホン酸ナトリウム１ｆを蒸留水７〇−Ｋ　溶解後、ｃ　
２−ヒス（ビニルスルホニル）エタン［１！５３３ｆを
添加し、蒸留水を加えて全量用塗布液 を１００ｔに調整して、試薬層−２Ａとした。

（ｄ）展開層 キシレン２８０−にスチレン−グリシジルメタクリレー
ト共重合体［共重合比９：１（重量比）］１５ｆ、）ラ
イドン！−１００（０−Ａアンドハース社製）１０ｔを
加え溶解してキシレン溶液とした。硫酸！グネシウム＠
７水和物をふるいにかけ２００メツシュ以上の細かいも
のを４２Ｆ、及び同じく２００メツシュ以上の細かいｐ
−１１ＰＦ・２ナトリウム・６水和物０．５２６Ｖを前
記キシレン溶液に添加後、サンドグラインダーによシ４
時間かくはんした後、ガーゼで炉遇し、ろ液１ｓ５，７
１に粉末Ｆ紙０〔東洋Ｆ紙■製、５００メツシュ以上〕
４５ｔを加え、よくかくはんして展開層用塗布液とした
。

（２）分析素子製造 透明な膜厚的１８０　ｐｍ　の下塗り済ポリエチレンテ
レフタレート支持体上に、試薬層−１用塗布液を２５０
μｍ　の厚さにドクターブレードで塗布し、４２ｆ２℃
で４０分間乾燥して、試薬層−１を得た。

この試薬層−１上に、試薬層−２用塗布液を１２５μｍ
の厚さにドクターブレードで塗布し、４２ｆ２℃で３０
分間乾燥して、試薬層−２を得た。

この試薬層−２上に展開層用塗布液を５７５μｍ　の厚
さにドクターブレードで塗布し、４２ｆ２℃で３０分間
乾燥して、本発明の分析素子を得た。

こうして得た、分析素子の各層の組成を以下に示す。

（１）試薬層−１ ゼラチン　１　＆７５　ｆ／ｗｎ” トリイソプロピルナフタレ２スルホン酸ナトリウム　２
．５　１７ｍ”炭酸水素ナトリウム　４３　ｆ／Ｗｌ”
（１＋）試薬層−２ ゼラチン　１２．５　ｔ／ｗｒ雪 トリイソオクチルナフタレンスルホン酸ナトリウム　１
．２５　１７ｍ”１．２−ビス（ビニルスルホニル）エ
タン　０．４１７Ｐ／ｍ”（ｅ）展開層 粉末Ｆ紙（０）　９１５　ｆ／ｒｎ２ ト　２　イ　ト　ｙ　Ｘ　−１００１ａ４１７ｆ／ｍ”
スチレン−グリシジルメタクリレ−）（９：１）共重合
体１５．６２５１Ｆ、／ｎ” 硫酸マグネシウム・７水和物　４！Ｓ　７５　ｆ／ｍ２
ｐ−ＮＰＰ＊２ナトリウム・６水和物　α５４８１７ｍ
”この分析素子に、種々のムＬＰ活性を有する血清を滴
下し、５７℃で５分間保温した時の反射光学濃度（ＤＲ
）の経時変化をｐ−二）ロフェノールの４１０　ｍｍ　
付近の吸収で測定した。その結果を第１図に示す。すな
わち第１図は、各種のムＬＰ活性をもつ血清滴下時の濃
度の経時変化を、時間（分）（横軸）と反射光学濃度（
ＤＲ）（縦軸）との関係で示したグラフである。

第１図に明らかなように、濃度と経時変化が比例してい
るので、これからムＬＰ活性を定量することができる。

比較試験例１ 以下のようにして、素子の保存安定性を対比試験した。

（１）水溶液 親水性コロイド溶液に、あらかじめ蒸留水中に溶解した
ｐ−ＭＰＰ・２ナトリウム・６水和物を添加して、試薬
層塗布液とした。

この塗布液は黄色を呈していた。これを支持体に塗布し
、乾燥して展開層とし、素子を作成した。乙の素子自体
も黄色を呈しておシ、反射吸収スペクトルを測定する４
　１０　ｎｍ　付近に強△ いピークを示した。また、本素子を５℃で１日保存後、
同様に反射吸収スペクトルを測定すると、４１０ｎｍ　
の反射光学濃度は更に増大しておシ、経時劣化の著しい
ことが判明した。

（２）有機溶液 前記（１）の基質をメタノール中に溶解し、キシレン中
に分散させた後、この液を粉末Ｖ紙に含浸させた。この
粉末Ｆ紙を減圧乾燥し、展開層塗布液中に分散させた。

こうして得た塗布液、及びこれを支持体に塗布し、乾燥
して得た素子も淡黄色を呈した。そして、この素子の反
射吸収スペクトルを測定すると、４１０ｎｍ　付近に弱
いピークしか示さなかった。しかし、この素子を５℃で
１日保存すると黄色を呈し、反射吸収スペクトルは４１
０　ｎｍ　付近に強いピークを示した。

（３）本発明の微粉末 前記（１）の基質を微粉末状に粉砕し、非溶解性の展開
層塗布液中に直接分散した。こうして得た塗布液、及び
これを支持体に塗布し、乾燥して得た素子も、共に白色
を呈した。とれを５℃で１日保存後、その反射吸収スペ
クトルを測定すると、保存前と同様に、４１０ｎｍ　付
近にピークが見られなかった。そこで、４０℃で強制劣
化試験を行ったところ、３８目までスペクトルの変化は
なく、１０日８でようやく弱いピークが確認できる程度
のＤＲ変化を示した。それ故、本発明の素子は保存安定
性に優れていることが判明した。

実施例２ 粒度の差による性質の差を″調べた。

前記実施例１のものを標準としく１）、対照として、実
施例１の基質をふるいにかけ５００メツシュ以上の細か
いものを用い、サンドグラインダー分散を行わない展開
層用塗布液を用いた素子（２）、また、同様に２００メ
ツシュ以上の細かいものを用いるがサンドグラインダー
分散を行わない展開層塗布液を用いた素子（３）につい
て試験した。

まず、各展開層用塗布液中の各基質の平均粒径な光学顕
微鏡で測定した。その結果を下記表１に示す。　− 表　１ 次に、各種のＡＬＰ活性を有する人血清を、これら５つ
の素子に滴下し、３７℃でインキユベートシながら、反
射光学濃度（ＤＲ）を４分間測定した。

第２図に、ムＬＰ活性（Ｋ−Ｕ）（横軸）と、滴下４分
後のＤＲと２分後のＤＲの差（ΔＤＲ）（縦軸）との関
係で表した検量線を示す。

第２図から明らかなように、３本の検量線に有量差は寿
い。

次に、これらの検量線にΔＤＲを代入して、同時再現性
（分析精度）を検討した。その結果を下記表２に相対標
準偏差（チ）として示す。

表　２ 表２から明らかなように、ｐ−ＮＰＰ・２Ｍａ・６Ｅ、
０の粒径が小さくなるほど、相対標準偏差が小さく、且
つ一定であって良好である。これは、基質粒子が小さく
なるほど均一分散が可能となり、且つ分散状態が安定と
なり、単位面積当り　゛の付着量が一定化するためと推
定される。

更に、保存安定性について試験したところ、３つの素子
共、はぼ同じ安定性を示した。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明の分析素子は、ムＬＰ活性
の定量測定を従来の分析技術よりも簡便に行えるもので
あり、また問題となる保存安定性についても常法の溶液
適用よシもはるかに優れており、もちろん分析精度も十
分満足できるという顕著な効果を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の分析素子の１実施例に各種ＡＬＰ活
性をもつ血清を滴下したときの時間と反射光学濃度との
関係を示すグラフ、第２図は、本発明の分析素子におけ
る基質の粒径差に伴うムＬＰ活性と反射光学濃度差との
関係を示すグラフである。 第１図 ＡＬＰ遁姓（Ｋ−Ｕ） 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、支持体上に、アルカリホスファターゼの基質が含有
   されている層を有するアルカリホスファターゼを定量す
   るだめの乾式分析素子において、該基質が該層中に微粉
   末の状態で含有されていることを特徴とするアルカリホ
   スファターゼ定量用乾式分析素子。 ２、該分析素子が、支持体上に少なくと４１１層の親水
   性コルイド層及び展開層を有して構成されておシ、該基
   質が該展開層中に含有されている特許請求の範囲第１項
   記載のアルカリホスファターゼ定量用乾式分析素子。