CH642456A5 - Composition diagnostique liquide stabilisee contenant un phosphate et procede de preparation de celle-ci. - Google Patents
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Description
La présente invention se rapporte, en général, à des améliorations, nouvelles et utiles, dans la stabilisation de compositions de réactifs diagnostiques et au procédé de cette stabilisation et, plus particulièrement, à des substrats, liquides et stabilisés, contenant du phosphate, dans des compositions de réactifs diagnostiques et au procédé de leur stabilisation.
Divers réactifs diagnostiques contenant des groupes organiques et, en particulier, des réactifs diagnostiques contenant des groupes organiques, cycliques ou aromatiques, par exemple le paranitrophénolphosphate, sont utilisés pour le dosage ou détermination de divers enzymes, notamment ceux connus sous les termes de phosphatase acide et de phosphatase alcaline. Ces enzymes, en particulier l'enzyme phosphatase alcaline, sont présents dans le sérum sanguin et sont utilisés pour déterminer la présence de conditions anormales lorsqu'on les trouve en quantités élevées. L'enzyme phosphatase alcaline est essentiellement un enzyme de la fonction hépatique, mais on le trouve également dans les os et parties osseuses du corps, ainsi que dans les intestins des organismes humains et animaux. Un niveau élevé de l'enzyme phosphatase alcaline est en général une indication d'un malfonctionnement hépatique. Le dosage ou détermination de l'enzyme phosphatase acide est également hautement utile, puisqu'il dérive de la glande prostatique et est utilisé pour le diagnostic des cancers de la prostate.
Les enzyme phosphatases sont particulièrement efficaces pour le dosage du fait qu'ils ont une haute affinité pour les groupes phosphatiques qui sont rattachés à des groupes organiques, particulièrement aux groupes organiques aromatiques ou cycliques, et qu'ils détachent le groupement phos-phatique du radical restant. De cette façon on peut mesurer le taux de phosphatase alcaline ou acide, par exemple, en présence d'un composé organo-phosphatique et aussi en présence d'ions magnésium. En mesurant les ions phosphate produits par réaction avec les enzymes phosphatases dans un laps de temps donné on obtient une détermination assez précise.
Dans le commerce on procède de différentes manières dans le dosage des enzymes phosphatases alcalines et acides. Dans une réaction de dosage, on détermine la phosphatase alcaline au moyen de phénolphosphate, réaction dans laquelle le phénolphosphate, en présence d'ions magnésium, est incubé avec la phosphatase alcaline. Le phénol libre qui en résulte, dû à l'activité de la phosphatase alcaline, est mesuré après un certain laps de temps durant lequel la réaction s'est faite. De façon analogue, on peut utiliser du glycé-rolphosphate. Un substrat très connu utilisé pour la mesure de l'activité des enzymes phosphatase est la paranitrophénolphosphate. Dans ce cas, un groupe nitro est rattaché à la. partie phénolique en position para et un groupement phosphate est rattaché au groupe phénol par une liaison oxygène labile. Pendant la réaction avec la phosphatase alcaline, le groupement phosphate est scindé, faisant apparaître du para-nitrophénol libre. Le paranitrophénolphosphate est une substance incolore dans un pH alcalin, alors que le nitrophénol-phosphate est une substance de couleur jaune dans un pH alcalin.
Ces divers substrats utilisés dans la mesure du taux de phosphatase alcaline et de phosphatase acide sont des composés organiques labiles en ce sens qu'ils s'hydrolysent en solutions aqueuses et même en solutions alcooliques, dissociant ainsi le groupement phosphate. On peut donc considérer comme labiles des substrats dont le phosphate est hydrolysé en solution aqueuse, de sorte que le substrat ne conserve pas ses propriétés moléculaires. Pour cette raison, dans la commercialisation actuelle de réactifs pour phosphatases alcalines et acides, on utilise un tampon approprié pour maintenir le pH. Ainsi les composés contenant du phosphate,
tel le paranitrophénolphosphate, sont fournis sous forme sèche, même en présence du sel de magnésium fournissant les ions magnésium. Lorsqu'on effectue un dosage, une solution tampon est rajoutée au paranitrophénolphosphate sec, créant une solution aqueuse du tampon et du paranitrophénolphosphate, solution qu'on utilise pour mesurer l'activité de l'enzyme phosphatase.
Selon la présente invention, on a trouvé qu'il est possible de maintenir le paranitrophénolphosphate et autres substrats labiles semblables en milieu liquide en présence de réactifs stabilisants qui stabilisent efficacement ce paranitrophénolphosphate et autres composés labiles semblables et protègent le groupement phosphate d'une hydrolyse en milieu liquide.
Selon l'état actuel de la technique utilisée dans le commerce pour stabiliser la capacité réactive des substrats, on enferme ceux-ci dans une matrice solide, soit par lyophilisation, soit par mélangeage à sec tel qu'utilisé pour la mise en tablettes de poudres sèches, en premier lieu dans l'industrie pharmaceutique, dans l'industrie des produits diagnostiques et autres industries similaires, immobilisant ainsi leur structure chimique. Contrairement à la sophistication que sous-entendent ces termes, ces façons de procéder ne sont ni pratiques ni désirables et sont de plus chères. Le fabricant est obligé d'enlever l'eau et de fournir un produit partiel, abandonnant ainsi une partie du cycle de contrôle de la qualité lors de la dilution et l'utilisation du produit final. Les laboratoires sont obligés de payer le coût élevé de l'empaquetage, de la perte de réactif, de la lyophilisation et du mélangeage à sec, tandis que l'utilité du produit est de plus limité par le type et la taille de l'emballage.
En outre une bonne uniformité du produit est difficile à obtenir. Ceci ressort du fait que la plupart des sérums de contrôle lyophilisés commerciaux (sérum de référence) fixent à ± 10% de la moyenne la variation acceptable de flacon à flacon des constituants enzymatiques.
La présente invention permet à des ingrédients labiles dans une solution liquide d'un réactif d'être efficacement «stabilisés» en inhibant l'hydrolyse du groupement phosphate faisant partie du substrat, contrôlant ainsi, au point de vue de la réactivité, l'activité des ingrédients labiles dans une solution liquide. Ce moyen de stabilisation assure une stabilité à long terme dans un milieu liquide. De plus, un contrôle étroit de tolérance peut être atteint dans la fabrication d'un produit de haute qualité ce qui élimine l'inconvénient de la taille rigide de l'emballage et le coût élevé d'empaquetage, de la lyophilisation et de la perte de réactif.
Le but principal de l'invention est de fournir une composition de réactif diagnostique, organique et liquide, contenant un composé labile qui possède un groupement phosphate et un groupe cyclique ou aromatique et qui est stabilisé contre l'hydrolyse dans un récipient.
D'autre part l'invention vise à fournir, dans un récipient, une composition stabilisée du type cité qui possède une excellente vie en rayon, récipient pouvant être ouvert de façon répétée sans dégradation substantielle des composants labiles qui y sont contenus.
L'invention vise aussi à fournir une composition liquide stabilisée, du type cité, dans laquelle les composants labiles sont présents dans un milieu solvant aqueux ou organique et où la stabilisation des composés labiles n'affecte pas la réactivité après un laps de temps prolongé.
Des substrats organiques labiles contenant un radical phosphate, en particulier un substrat possédant un groupe cyclique ou aromatique et un radical phosphate, sont traités selon l'invention, résultant en une stabilité à long terme sans influencer la réactivité ou l'absorptivité photométrique. L'invention fournit des réactifs ou des compositions de réactifs dans lesquels le contrôle de qualité est assuré tout au long de
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la fabrication, de l'empaquetage, du stockage et de l'utilisation. L'inconvénient de la grandeur fixe de l'emballage est éliminé de même que le coût élevé de l'empaquetage, de la lyophilisation et des pertes de réactif. Les compositions liquides de réactifs diagnostiques de ce type fournissent des déterminations d'enzyme avec une grande flexibilité d'emploi.
Les compositions de diagnostic, liquides et stabilisées selon l'invention, lorsqu'on les évalue par des essais, sont comparables à des compositions liquides de réactif fraîchement préparées. Ces essais permettent de constater une corrélation de 1 à 1 entre réactifs liquides âgés et réactifs frais avec une précision et une sensibilité équivalentes. La fourniture de réactifs de ce type sous une forme liquide stable améliore l'application colorimétrique des méthodologies actuelles, aussi bien que d'autres méthodologies non colorimétriques. Des réactifs liquides, stables, sont particulièrement avantageux lorsque la consommation et les taux de réactivité d'un substrat sont les bases de mesures. Le système liquide de la présente invention offre aussi une meilleure homogénéité des réactifs et permet un meilleur empaquetage, tout en assurant une bonne flexibilité d'emploi, par contraste avec les préparations en milieu solide ou lyophilisées.
Des enzymes et dans certains cas des coenzymes et/ou des substrats peuvent être présents dans la réaction de mesure. Des substrats typiques, susceptibles d'être utilisés dans la présente invention, peuvent, par exemple, être le glycérolphos-phate, le phénolphosphate et le paranitrophénolphosphate, le thymolphtalinephosphate et, ordinairement, le sel mono-sodique de ce phosphate et autres composés analogues.
Les réactifs de la présente invention sont utilisables pour déterminer les enzymes, tels que les phosphatases acide et alcaline, susceptibles de réagir avec un substrat stabilisé selon l'invention. Comme indiqué précédemment, ces substrats qui sont stabilisés en milieu liquide comprennent un groupement phosphate hydrolysable à partir d'un groupe organique et, de préférence, un groupe aromatique ou cyclique. Ainsi, dans le cas du paranitrophénolphosphate, qui est une molécule organique simple, le groupe nitro est fixé au groupe phénol en position para et un groupement phosphate est rattaché au groupe phénol par une liaison oxygène faible. Au cours de la réaction avec l'enzyme, le groupement phosphate est clivé de la molécule, formant un radical phosphate et un radical para-nitrophénol libres. La phosphatase alcaline clive le groupement phosphate du substrat dans un pH alcalin et, de la même manière, la phosphatase acide clive le groupement phosphate du substrat dans un pH acide.
Des substrats de ce type, par exemple le paranitrophénolphosphate (PNPP), sont des composés organiques très labiles, en ce sens que le groupement phosphate s'hydrolyse en solution aqueuse ou même alcoolique rendant ainsi le substrat inefficace pour la détermination d'un enzyme. Pour cette raison, dans la commercialisation actuelle des réactifs pour la phosphatase alcaline, un tampon alcalin, d'habitude un tampon àl'AMP (2-amino-2-méthyl-l-propanol), et le PNPP sont mélangés. Le tampon est normalement liquide et, lors de l'utilisation, le PNPP, qui est une substance sèche, est mélangé en solution, d'habitude dans un milieu aqueux, et la solution est alors utilisée pour tester l'activité enzymatique. Selon la présente invention, on rajoute un tampon en quantité suffisante pour ajuster le pH à un niveau approprié.
Ainsi, par exemple, dans le cas de la stabilisation du substrat pour être utilisé dans la mesure de l'activité de la phosphatase alcaline, on protège le substrat de l'hydrolyse au moyen d'un composé stabilisant, par exemple le phénol, qui protège le groupement phosphate de l'hydrolyse, même à température élevée.
Une fois préparée, la solution liquide est répartie dans des flacons en verre ambré qui sont scellés de manière hermétique. De plus ces flacons sont généralement stockés sous réfrigération. La durée de vie projetée en rayon de ces enzymes et coenzymes est de un à deux ans dans ces conditions sans dégradation appréciable.
Dans le domaine du diagnostic clinique, l'application commerciale de la présente invention est représentée par des, mais pas limitée aux réactifs diagnostiques utilisés pour détermination de concentrations en enzymes, telles que, par exemple, des concentrations de phosphatase alcaline dans des liquides biologiques et autres liquides analogues. Toutefois des compositions préparées selon la présente invention peuvent être employées pour mesurer et quantifier d'autres constituants biologiques, par exemple la phosphatase acide (ACP) ou la phosphokinase alcaline (ALP) et leurs analogues, dans des liquides biologiques.
Les enzymes sus-énoncés réagissent souvent de manière semblable par rapport aux substrats de la présente invention et certaines des réactions chimiques sont communes. Les enzymes ci-dessus sont seulement des exemples et il est clair que d'autres enzymes peuvent être déterminés selon la présente invention. Les schémas de réaction chimique suivants sont présentés comme modèles pour illustrer la nature générale des réactions impliquées.
Schéma de réaction 1. - Modèle général Enzyme
(1) Substrat + MG ~~ Produit + P,
pH
Schéma de réaction 2. - Modèle spécifique
(2) PNPP + (MgA + AMP) PNP + Pi pH 10 à 10,5
Schéma de réaction 3. - Modèle spécifique
(3) PP + (MgA) ^ ' phénol 4- Pi pH 4 à 4,5
Dans les schémas de réaction ci-dessus on a utilisé par besoin de clarté des symboles qui s'identifient comme suit:
PNPP = paranitrophénolphosphate
MgA = aspartate de magnésium
AMP = 2-amino-2-méthyl-l-propanol PNP = paranitrophénol
Pi = un groupement phosphate, en général du PO4
PP = phénolphosphate
Dans les schémas de réaction ci-dessus, le modèle général montre que le substrat est d'habitude combiné avec un tampon dans la réaction de mesure pour un enzyme particulier et produit une substance en même temps qu'un groupement phosphate. Comme indiqué, ce groupement phosphate est d'habitude du PÛ4 ce qui dépend de la quantité de tampon utilisé et des composants particuliers de la réaction. Le groupement phosphate peut être présent en tant qu'ion en solution ou autrement fixé au tampon, lequel, dans ce dernier cas, jouerait le rôle de récepteur pour le groupement phosphate.
Le schéma de réaction (2) illustre un modèle spécifique pour la mesure de la phosphatase alcaline. Dans ce cas, on remarquera qu'un sel de magnésium, par exemple l'aspartate de magnésium, est présent pour activer l'enzyme. Le troisième schéma de réaction illustre un modèle spécifique pour la mesure de l'activité de la phosphatase acide.
Selon la présente invention, la composition contenant le substrat est séparée de la composition tamponnée et est s
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contenue dans un récipient différent, cette composition étant mélangée lors de la mesure. Ainsi le substrat et un stabilisateur en un milieu liquide sont contenus dans un récipient et la substance tampon et le sel de magnésium sont introduits dans un autre récipient.
La composition tampon contient un agent de tamponnement approprié, tel que par exemple de l'AMP. Le tampon à l'AMP est utilisé, de préférence, en rapport avec la mesure de l'enzyme phosphatase alcaline. Toutefois d'autres agents tampons peuvent être utilisés, de préférence des substances amino-organiques, comprenant la diéthylamine et la triéthyl-amine, un tampon tris, [tris(hydroxyméthyl)aminométhane], par exemple. Des substances tampon non organiques peuvent aussi être employées et comprennent, par exemple, le carbonate de sodium et le bicarbonate de sodium. Il importe que la substance tampon fournisse la gamme de pH désirée dans la composition tampon stabilisée. Dans certains cas, il peut être souhaitable de rajouter un acide, par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide acétique et l'acide succinique, pour adapter le pH au niveau désiré.
L'agent tampon pour la composition de réactif pour mesurer l'activité de la phosphatase acide peut comprendre divers sels et acides donnant un pH acide dans la composition stabilisée. Ainsi, par exemple, des solutions tampons à l'acétate de sodium et à l'acide acétique, au chlorure de sodium et à l'acide chlorhydrique, et des tampons «PIPES» peuvent être utilisés.
Le sel de magnésium sert à activer l'enzyme lorsqu'il est en solution et fait aussi partie de la composition tampon. Le sel de magnésium compris dans la composition tampon est de préférence l'aspartate de magnésium puisqu'il ne semble pas se produire de précipitation du magnésium. Toutefois, d'autres sels de magnésium peuvent être utilisés, par exemple le chlorure, l'acétate et le fluorure de magnésium et éventuellement le citrate de magnésium. Parmi les autres tampons pouvant être utilisés dans la présente invention, du moins pour la détermination de l'activité de l'enzyme phosphatase alcaline, figurent la diéthanolamine et le carbonate de sodium.
La solution tampon fournissant les gammes de pH appropriées ne devrait pas matériellement interférer avec l'activité de la phosphatase. Dans le cas de la composition de réactif pour la détermination de la phosphatase alcaline, la solution tampon devrait, de préférence, fournir un pH dans la gamme de 10,0 à 10,5, quoique ce pH peut se trouver dans une gamme allant d'environ 9,5 à 10,7. En fait, la gamme de pH peut aller d'environ 9 à environ 12, bien que, à des niveaux de pH inférieurs à 10 et supérieurs à 10,7, la capacité du pouvoir tampon diminue. Dans le cas des compositions de réactif pour mesurer l'activité de la phosphatase acide, le pH devrait de préférence se trouver dans la gamme d'environ 4,0 à 4,5, et, de préférence, dans la gamme d'environ 3,5 à 4,8. Ce pH peut être inférieur à 3,6 et quelque peu supérieur à 4,8 mais là encore la capacité du pouvoir tampon diminue.
Le composé de magnésium est présent dans la solution tampon en une concentration d'environ 10 millimoles, quoiqu'elle peut varier le cas échéant entre environ 0,5 millimoles et environ 50 millimoles. Le tampon, et en particulier le tampon à l'AMP, est présent à environ 0,8 moles, quoique le tampon peut varier entre environ 0,05 moles et environ 2 moles.
Le substrat est présent dans la composition de substrat en même temps qu'un agent de stabilisation d'un type qui sera ci-après décrit avec plus de détail. Un des agents de stabilisation préféré est le phénol, mais d'autres agents de stabilisation, comme décrits ci-après, peuvent aussi être utilisés. Dans cette composition de substrat, celui-ci, par exemple le PNPP, peut être présent à environ 100 millimoles en solution jusqu'à un point de saturation d'environ 1 mole. De préférence, le
PNPP devrait être présent dans la gamme d'environ 2 millimoles à environ 0,8 mole dans cette composition de substrat. Le phénol sera présent environ dans la même gamme, quoique ce phénol peut être présent à environ le double de la quantité de substrat dans cette composition de substrat. De l'eau généralement complète le reste de la composition de substrat stabilisée.
Un agent tampon approprié peut aussi être compris dans la composition de substrat, par exemple la triéthanolaminè et la trihydroxyamine, pour régler le pH de cette composition de substrat entre environ 8 à environ 9,5 et de préférence entre environ 8,5 et environ 9,0. La composition de substrat est rajoutée à la composition tampon au moment de la mesure, en quantités relativement faibles afin que le pH du mélange final, à partir des deux compositions, adopte celui de la solution tampon. La substance tampon, telle que la triéthanolaminè, sert également d'agent de solubilisation pour le phénol ou tout autre stabilisant présent dans la composition de substrat, ce qui est efficace pour solubiliser le phénol à des concentrations plus fortes. En l'absence de cette substance tampon à plus forte concentration, le phénol peut tendre à former une couche aqueuse et une couche phénolique en tant que solution bi-phasique.
Un certain nombre d'autres substrats peuvent être stabilisés selon la présente invention, notamment des sels de PNPP, comme le sel de sodium et le sel de dicyclohexyl-amine. En outre le sel de di- [(trishydroxyméthol)amino-méthane, le sel de P-nitrophénolphosphate dicyclohexylam-monium, le sel de P-nitrophénolphosphate di-(2-amino-2-éthyl-l,3-propanédiol), et le sel de P-nitrophénolphosphate disodique, hexahydrate, peuvent également être utilisés.
En plus du phénol, le stabilisateur peut encore comprendre divers composés phénoliques qui sont aussi efficaces comme stabilisateurs, tels que les composés phénoliques possédant le groupe sulfate, par exemple le parasulfophényle et l'acide parasulfonique phényle. Il a également été reconnu selon la présente invention que des agents de stabilisation autres que le phénol peuvent être utilisés et comprennent par exemple l'imidazole, qui est souvent dénommé «glyoxaline», à savoir le C3H4N2. Il a été reconnu que divers composés nitroliphati-ques ayant de un à six atomes de carbone, tels que le nitromé-thane et le nitroéthane, sont aussi quelque peu efficaces en tant que stabilisateurs, quoique les composés nitroaliphatiques sont moins efficaces que le phénol et les composés phénoliques. Les composés phosphatiques en général ne sont pas forcément efficaces en tant que stabilisateurs à cause du fait qu'il peuvent précipiter en même temps qu'un sel de magnésium.
Lorsque le tampon est dissous dans l'eau, un agent bacté-riostatique approprié, par exemple l'azide de sodium, peut être rajouté, de préférence en une quantité d'environ 0,1% poids/poids. Toutefois la quantité du composé azide ou d'autre composé bactériostatique qui est rajouté peut varier entre 0,01% et environ 0,5%. On a constaté, selon la présente invention, que le composé azide a l'effet d'aider à la stabilisation de la composition. En outre, d'autres agents bactéricides ou fongicides ne réagissant pas chimiquement avec le tampon ou n'inhibant pas la réaction enzymatique, peuvent être utilisés: par exemple, parmi ces agents pouvant être utilisés, en plus de l'azide de sodium, figurent l'acide benzoïque, le thymol ou le pentachlorophénol. Dans bien des cas, spécialement avec des tampons à pH élevé, la substance bactériostatique n'est pas nécessaire et peut être éliminée.
Le véritable mécanisme de la stabilisation n'est pas complètement compris. Cependant on a constaté que l'hydrolyse du phosphate en milieu aqueux ne se produit que jusqu'à obtention d'un équilibre. Il est entendu que la réaction d'hydrolyse est influencée par la constante de réaction
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d'hydrolyse K. Ainsi cette réaction d'hydrolyse peut être représentée par:
(R-P04) + H+ -> R+ + P04
où R-PO4 représente le composé organique ayant un groupement phosphate et R+ représente le même composé après hydrolyse de celui-ci:
La constante de réaction K est représentée par et déterminée en accord avec:
[R+][PQ4]
[R-P04][H+
Conformément avec l'équation ci-dessus, la réaction peut être retardée en surchargeant les produits de réaction avec R+ ou PO4- ou les deux. Si on surcharge le milieu de la réaction avec PO4-, cela peut affecter la réaction des enzymes dans une réaction de mesure. La réaction d'hydrolyse semble s'effectuer jusqu'à une saturation d'équilibre, à moins d'être autrement stabilisée et on a, d'autre part, pu constater que l'agent stabilisateur a le même effet que les produits de réaction, de sorte que le phénol et les autres agents de stabilisation inhibent efficacement l'hydrolyse de composés tel que le PNPP.
Ainsi, l'agent stabilisateur qui est utilisé dans la présente invention est un agent qui fournit le même effet dans le milieu de réaction que le PO4" ou le R+. De cette manière, l'agent stabilisateur agit comme un excès de PO4- ou de R+ et inhibe ainsi la réaction d'hydrolyse. Donc, en termes d'hydrolyse, le stabilisateur devrait être suffisamment proche du R+ par exemple, au moins par ses effets en solution. Toutefois, dans la détermination normale de l'enzyme, celle-ci est très spécifique et ne sera influencée que par le substrat et le produit final spécifique et ne sera pas influencé par l'agent stabilisateur.
On a trouvé que le substrat, lorsqu'il est stabilisé selon la présente invention, a une stabilité surprenante pendant une durée pouvant atteindre 18 mois à deux ans à environ 4°C ou à la température du réfrigérateur. Encore plus, la composition de substrat est presque totalement stabilisée pendant une durée pouvant atteindre deux à trois mois à température ambiante.
A l'usage, la composition de substrat est rajoutée à la solution tampon soit en une quantité déterminée ou goutte à goutte, à choix selon les circonstances. La solution qui en résulte est alors mélangée et utilisée à température ambiante pour la mesure de l'activité de l'enzyme phosphatase par addition de cet enzyme phosphatase aux compositions mélangées. La solution finale des deux compositions, juste avant l'analyse, comprend le tampon alcalin dans la gamme de pH désiré comme spécifié ci-dessus, le sel de magnésium et le substrat, en même temps que l'agent de stabilisation.
Dans la composition finale, le sel de magnésium est présent dans la gamme d'environ 0,5 millimoles jusqu'à environ 50 millimoles et le substrat est présent à une concentration de pas moins de 0,5 millimoles et pouvant atteindre environ 30 millimoles. On a constaté que le phénol ou autre agent de stabilisation, en même temps que les agents de solubilisation, tel que la triéthanolamine, qui agit efficacement comme agent de solubilisation, n'interfère pas du tout avec la mesure de l'enzyme phosphatase. On a également constaté que le phénol à très hautes concentrations peut quelque peu inhiber la réaction mais seulement de manière négligeable. L'agent de solubilisation est inclus dans la composition liquide de substrat pour éviter une séparation de phases de l'agent stabilisateur.
Lorsque la composition de substrat et la composition tampon ont été mélangées, l'échantillon de fluide d'un organisme qui contient l'enzyme phosphatase est alors rajouté au mélange de solution résultant. L'activité de la phosphatase alcaline est déterminée à environ 405 nanomètres à température constante. Cette température constante peut se situer n'importe où depuis la température ambiante, 25°C, ou même plus bas, par exemple 20°C, jusqu'à 40°C ou même 50°C. Au-dessus de 50°C, les enzymes phosphatases alcalines semblent se dénaturer, rendant ainsi la détermination impraticable.
La solution de substrat telle que préparée dans sa forme stabilisée est sensible à la lumière et est donc normalement présentée dans des flacons foncés ou ambrés et ces dits flacons peuvent être réalisés à partir de n'importe quel matériau ne réagissant pas avec la composition de substrat, par exemple du plastique ou du verre.
Les exemples suivants permettront de mieux illustrer l'invention.
Exemple 1
On ajoute 0,8 moles d'un tampon à l'AMP à de l'aspartate de magnésium en milieux aqueux et on ajuste son pH à environ 10,2 avec une petite quantité d'acide chlorhydrique pour former une composition tampon.
On combine alors du paranitrophénolphosphate avec du phénol sous forme sèche et on ajoute le tout à une solution aqueuse de manière que le paranitrophénolphosphate soit présent à environ 1 mole et le phénol soit présent en une quantité d'environ 1,5 moles. On ajoute aussi de la triéthanolamine pour ajuster le pH à environ 8,6 et pour en outre retarder l'hydrolyse du paranitrophénolphosphate. On complète la solution avec de l'eau distillée pour former la composition de substrat.
Après la dissolution complète, on met la solution tampon dans un récipient en plastique ou en verre qu'on ferme. De la même manière, on met la solution de substrat dans un récipient en plastique ou en verre ambré qu'on ferme. Les récipients sont alors scellés et stockés sous réfrigération. On a trouvé qu'une composition ainsi stabilisée fournit une stabilité de stockage pouvant atteindre deux ans sans subir de dégradation appréciable.
Exemple 2
On mélange la composition de substrat et la composition tampon obtenues selon l'exemple 1 et on ajoute au mélange un fluide d'un organisme contenant de la phosphatase alcaline. Le stabilisateur phénolique ne paraît pas affecter la réaction par rapport à la phosphatase alcaline. Le groupement phosphate du paranitrophénolphosphate est clivé de ce dernier et forme une base de mesure de l'activité de la phosphatase alcaline.
Exemple 3
On remplace l'aspartate de magnésium dans l'exemple 1 par une quantité à peu près égale d'acétate de magnésium. Ici aussi, la composition présente la même longue vie en rayon sans dégradation appréciable.
Exemple 4
On remplace l'aspartate de magnésium dans l'exemple 1 par une quantité à peu près égale de chlorure de magnésium. Ici encore la composition présente la même longue vie en rayon sans dégradation appréciable.
Exemple 5
On remplace l'AMP dans l'exemple 1 par une quantité à peu près égale de triéthynolamine. Ici aussi, la composition de substrat présente la même longue vie en rayon sans dégradation appréciable.
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Exemple 6 Exemple 7 On remplace le phénol dans l'exemple 1 par une quantité à On remplace le phénol dans l'exemple 1 par une quantité à peu près égale de parasulfophényle. Ici aussi, la composition peu près égale d'imidazole. De nouveau, la composition préprésente la même longue vie en rayon sans dégradation sente la même longue vie en rayon sans dégradation appré-appréciable. s ciable.
B
Claims (3)
1. Composition diagnostique liquide stabilisée, comprenant, en tant que substrat, un composé réactif, organique et labile, de diagnostic, présentant un groupement phosphate y fixé et stabilisé contre l'hydrolyse en solution aqueuse, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un agent de stabilisation choisi parmi (1) le phénol et les composés phénoliques, (2) l'imidazole et (3) des groupes nitroaliphatiques ayant de 1 à 6 atomes de carbone, cet agent de stabilisation approchant l'effet du composé sans le groupement phosphate comme produit de réaction, ou portion de celui-ci, lors d'une réaction d'hydrolyse, ou l'effet du groupement phosphate qui serait produit au cours d'une réaction d'hydrolyse, inhibant ainsi une réaction d'hydrolyse du composé, le mélange du substrat et de l'agent de stabilisation se trôuvant substantiellement dissous dans un liquide contenant de l'eau pour fournir une solution aqueuse sous une forme susceptible d'être conservée et utilisée.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent de stabilisation est le phénol ou un composé phé-nolique.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le substrat est un composé réactif utilisable dans la détermination d'un enzyme phosphatase.
4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la solution aqueuse présente un pH dans la gamme de 9,5 à 10,7 pour la détermination d'un enzyme phosphatase alcalin.
5. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la solution aqueuse présente un pH dans la gamme de 10,0 à 10,5 pour la détermination d'un enzyme phosphatase alcalin.
6. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la solution aqueuse présente un pH dans la gamme de 3,5 à 4,8 pour la détermination d'un enzyme phosphatase acide.
7. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la solution aqueuse présente un pH dans la gamme de 4,0 à 4,5 pour la détermination d'un enzyme phosphatase acide.
8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le substrat est le paranitrophénolphosphate.
9. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le composé réactif comprend un groupe cyclique ou aromatique avec le groupement phosphate y fixé.
10. Composition selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le substrat est présent en une quantité allant d'environ 100 millimoles jusqu'à environ un niveau de saturation et que l'agent de stabilisation est présent en une quantité allant d'environ 100 millimoles jusqu'à environ au moins le double de la quantité du substrat.
11. Procédé de préparation d'une composition diagnostique liquide stabilisée selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on mélange le composé avec un agent de stabilisation choisi parmi (1) le phénol et les composés phénoliques, (2) l'imidazole et (3) des groupes nitroaliphatiques ayant de 1 à 6 atomes de carbone, cet agent de stabilisation approchant l'effet du composé sans le groupement phosphate comme produit de réaction, ou portion de celui-ci, lors d'une réaction d'hydrolyse, ou l'effet du groupement phosphate qui serait produit au cours d'une réaction d'hydrolyse, inhibant ainsi une réaction d'hydrolyse du composé, l'on introduit le mélange du composé et de l'agent de stabilisation dans un liquide contenant de l'eau pour former la composition liquide stabilisée et l'on stocke cette composition.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le liquide contenant de l'eau présente un pH alcalin dans la gamme de 9,5 à 10,7.
13. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le liquide contenant de l'eau présente un pH alcalin dans la gamme de 10,0 à 10,5.
14. Procédé selon la revèndication 11, caractérisé en ce que le liquide contenant de l'eau présente un pH acide dans la gamme de 3,5 à 4,8.
15. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le liquide contenant de l'eau présente un pH acide dans la gamme de 4,0 à 4,5.
16. Procédé selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que l'agent de stabilisation choisi est le phénol ou un composé phénolique.
17. Procédé selon l'une des revendications 11 à 16, caractérisé en ce que le substrat est un composé réactif susceptible d'être employé pour la détermination d'un enzyme phosphatase.
18. Procédé selon l'une des revendications 11 à 17, caractérisé en ce que la solution aqueuse comprend un agent de solubilisation afin d'éviter une séparation de phases de l'agent de stabilisation.
19. Procédé selon l'une des revendications 11 à 18, caractérisé en ce que le substrat est le paranitrophénolphosphate.
20. Procédé selon l'une des revendications 11 à 18, caractérisé en ce que le substrat est un composé réactif comprenant un groupe cyclique ou aromatique avec le groupement phosphate y fixé.
21. Procédé selon l'une des revendications 11 à 20, caractérisé en ce que le substrat est un composé réactif apte à la détermination d'un enzyme phosphatase, le composé étant spécifique par rapport à celui-ci de telle sorte que l'enzyme sera influencé par ce composé ou le produit final d'une réaction de détermination ou les deux et ne sera pas influencé par l'agent de stabilisation.
22. Procédé selon l'une des revendications 11 à 21, caractérisé en ce que l'on stabilise le substrat contre une hydrolyse par une réaction d'hydrolyse représentée par:
(R-PO4) + H+ ^ "» R+ + PO4-
où (R-PO4) représente un groupe cyclique ou aromatique avec un groupement phosphate y fixé, PC>4~ représente le groupement phosphate clivé par hydrolyse de ce dernier et R+ représente un produit de réaction basé sur R dont le groupement phosphate a été clivé par hydrolyse, la réaction se poursuivant normalement jusqu'à saturation en l'absence de toute stabilisation contre l'hydrolyse.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que le substrat est présent en une quantité allant d'environ 100 millimoles jusqu'à un niveau de saturation et que l'agent de stabilisation est présent en une quantité allant d'environ 100 millimoles jusqu'à environ au moins le double de la quantité de substrat.
24. Utilisation de la composition selon la revendication 1 pour la détermination d'un enzyme.
25. Utilisation selon la revendication 24 de la composition selon la revendication 3 pour la détermination d'un enzyme phosphatase.
26. Utilisation selon la revendication 24 ou 25 de la composition selon la revendication 2,8,9 ou 10.
27. Utilisation selon l'une des revendications 24 à 26 de la composition selon la revendication 4 ou 5 pour la détermination d'un enzyme phosphatase alcalin.
28. Utilisation selon l'une des revendications 24 à 26 de la composition selon la revendication 6 ou 7 pour la détermination d'un enzyme phosphatase acide.
5
10
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20
25
30
35
40
45
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2
REVENDICATIONS
3
642456
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