SE447123B - Komposition for bestemning av fosfatas, sett for stabilisering av kompositionen och anvendning av kompositionen for fosfatasbestemning - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 447 123 2 ducerade genom reaktion med fosfatasenzymer under en given tidsperiod, erbjuder en tämligen noggrann bestämning. Åtskilliga förfaranden för bestämning av alkaliska och sura fosfatasenzymer användes kommersiellt. Vid en reaktion för bestämning fastställes alkalisk fosfatas genom fenolfosfat, varvid fenolfosfatet, i närvaro av magnesiumjoner, inkuberas tillsammans med det alkaliska fosfataset. Den på grund av det alkaliska fosfatasets aktivitet resulterande fria fenolen mätes efter en viss tidsperiod, under vilken reaktionen har ägt rum. På samma sätt kan glycerolfosfat användas. Ett mycket vanligt substrat, som användes för bestämning tillsammans med fosfatasenzymer, är paranítrofenolfosfat. I detta fall är en nitro-grupp bunden till fenoldelen i paraposition och en fosfatgrupp bunden till fenolgruppen genom en svag syrebindning. Under reaktionen med det alkaliska fosfataset spjälkas fosfatgruppen och bildar fri para- nitrofenol. Paranitrofenolfosfatet är ett färglöst material vid alkaliskt pH, medan nitrofenolfosfat är ett gulfärgat ämne vid alkaliskt pH.

De olika substrat, som används vid bestämning av det alkaliska fosfataset och det sura fosfataset, är labila, organiska föreningar såtillvida att de hydroly- serar i vattenlösningar och t o m i alkohollösningar eller andra organiska lösningar och därigenom dissocierar fosfatgruppen. Sålunda anses sustraten labila från den utgångspunkten, att fosfatet hydrolyseras i vattenlösning och substratet sålunda inte bibehåller sina molekylära egenskaper. Av detta skäl användes i den nuvarande mark- nadsföringen av alkaliska fosfatasreagenser och sura fosfatasreagenser en lämplig buffert för att vidmakthålla pH-värdet. Sålunda erhålles de fosfatinnehållande före- ningarna, såsom paranitrofenolfosfat i torrt tillstånd även i närvaro av magnesiumsalt, som lämnar magnesium- joner. När en bestämning utföres, tillsättes en buffert till det torra paranitrofenolfosfatet och skapar en vatten- lösning av bufferten och paranitrofenolfosfatet och den 10 15 20 25 30 35 447 123 3 resulterande lösningen användes för att fastställa akti- viteten hos fosfatasenzymerna.

Enligt uppfinningen har man funnit att det är möjligt att lagra paranitrofenolfosfat och liknande labila substrat i ett flytande medium i närvaro av stabiliserande reagenser, som effektivt stabiliserar paranitrofenolfosfat och liknande labila komponenter och håller fosfatgruppen skyddad från hydrolys i det flytande mediet.

Den nuvarande kommersiella stàndpunkten i den teknik, som användes för att stabilisera reaktionsförmågan hos substraten, ástadkommes genom att låsa dem i en fast matris, antingen genom frystorkning eller torrblandning, så som användes för tablettering av torkade pulver, i första hand inom pharmaceutiska diagnostiska och liknande industrier och immobilisering genom att läsa substratets kemiska struktur i en fast matris. Tvärtemot den sofisti- kering, som dessa termer antyder, är dess försök till lösningar varken praktiska eller önskvärda och är också dyrbara. Tillverkaren tvingas att taga bort vattnet och leverera en delprodukt och sålunda överlåta en del av kvalitetskontrollen till utspädningen och användandet av slutprodukten. Laboratorier tvingas betala den höga kostnaden av förpackning, spill, frystorkning och torr- blandning och produktens användbarhet begränsas vidare genom förpackningssätt och förpackningsstorlekar.

Dessutom är det svårt att uppnå god enhetlighet hos produkten. Detta förhållande exemplifieras av det faktum att de flesta kommersiella frystorkade kontrollsera (referensserum) anger den acceptabla variationen fràn flaska till flaska av enzymbestàndsdelarna till É lO% av medelvärdet.

Uppfinningen är fördelaktig genom att de labila ingredienserna i en flytande reagenslösning är effektivt “stabiliserade" genom att förhindra hydrolysering av de fosfatgrupper, som utgör en del av substratet och därigenom kontrollera de labila beståndsdelarnas aktivi- tet i en flytande lösning. Detta medel för stabilisering tillförsäkrar långvarig stabilitet i flytande media. 10 15 20 25 30 35 447 123 4 Dessutom kan en noggrann toleransstyrning uppnås vid tillverkningen av en högkvalitativ produkt, vilket elimi- nerar olägenheterna hos fasta förpackningsstorlekar och den höga kostnaden för paketering, frystorkning och spill. Ändamålet med uppfinningen är därför i första hand att åstadkomma en flytande diagnostisk reagenskompostition, som innehåller en labil förening med en fosfatgrupp och en cyklisk eller aromatisk grupp och som stabiliserats mot hydrolys i en behållare.

Ett ytterligare ändamål med uppfinningen är att åstadkomma en stabiliserad komposition av den typ, som angivits, i en behållare, och som har utomordentlig livs- längd eller lagringstid och vilken behållare kan öppnas upprepade gånger utan väsentlig försämring av de labila komponenterna däri.

Ett ytterligare ändamål-med uppfinningen är att åstadkomma en flytande stabiliserad komposition av den angivna typen, vid vilken de labila komponenterna är närvarande i ett vatten- eller organiskt lösningsmedel och där de labila komponenternas stabilisering inte på- verkar reaktionsförmàgan ens efter en väsentlig tidsperiod.

Enligt uppfinningen âstadkommes sålunda en komposi- tion som innefattar ett labilt organiskt diagnostiskt fosfatgruppsinnehållande reagens, stabiliserat mot hydrolys i vattenhaltig lösning, varvid kompositionen är kännetecknad av, att den är avsedd för bestämning av fosfatasenzym, att den i det diagnostiska reagenset förekommande fosfat- gruppen är avspjälkbar från reagenset genom inverkan av ett fosfatasenzym, varvid erhålles en cyklisk eller aromatisk återstod, att det organiska diagnostiska reagen- set är stabiliserat genom närvaro av ett stabiliserings- medel, vilket utgöres av fenol, fenolföreningar, imidazol eller en nitroalifatisk förening med l-6 kolatomer, varvid stabiliseringsmedlet har samma eller en näraliggande effekt som ovan nämnda cykliska eller aromatiska återstod utan den vidhängande fosfatgruppen, såsom en reaktions- produkt eller del därav vid en hydrolysreaktion, och/eller effekten av den fosfatgrupp, som skulle bildats vid en 10 15 20 25 30 35 447 123 5 hydrolysreaktion, samt att stabiliseringsmedlet är när- varande i en mängd, som är tillräcklig för att genom jämviktsbildníng hämma en k» finuerlig hydrolysreaktion av nämnda organiska diagnostiska reagens i en vatten- haltig vätska, i vilken reagenset och stabiliserings- medlet blandas och väsentligen upplöses.

Enligt uppfinningen åstadkommes vidare ett sätt för stabilisering av den uppfunna kompositionen mot hydro- lys i en vattenlösning.

Enligt uppfinningen åstadkommes vidare användning av den uppfunna kompositionen vid bestämning av fosfatas- enzym.

Labila organiska substrat, som innehåller en fosfat- radikal och särskilt sådana substrat, som har en aroma- tisk eller cyklisk grupp och en fosfatradikal, behandlas enligt uppfinnigen så att en långtidsstabilitet erhålles utan att reaktionsförmágan eller den fotometriska absorp- tiviteten pâverkas. Reagenser åstadkommes, där en god kvalitetskontroll är tilförsäkrad genom hela tillverkningen, packningen, lagringen och användningen. Nackdelarna med fasta förpackningsstorlekar elimineras liksom de höga kostnaderna för förpackning, frystorkning och spill.

Flytande diagnostiska reagenskompositioner av denna typ erbjuder enzymbestämning med flexibel tillämpning.

Den stabiliserade, flytande diagnostiska kompositionen enligt uppfinningen har vid studier konstaterats vara jämförbar med respektive flytande nyberedda reagenskompo- sitioner. Dessa studier kan visa en 1:1 korrelation mellan åldrade flytande och nyberedda reagenser med jämför- bar känslighet och precision. Att tillhandahålla reagenser av denna typ i en stabil, flytande form förstärker den kolorimetriska tillämpbarheten hos dagens metod likaväl som andra icke-kolorimetriska metoder. Stabila, flytande reagenser är särskilt förmånliga där substratkonsumtion och reaktionshastighet utgör grund för mätningen. Det flytande systemet enligt uppfinningen erbjuder också en bättre reagenshomogenitet och förpackning liksom flexi- 10 15 20 25 30 35 447 123 6 bilitet vid användningen i motsats till frystorkade eller torra mediapreparat.

Enzymer, och i vissa fall koenzymer och/eller substrat, kan var närvarande vid bestämningsreaktionen. Typiska substrat, som kan användas vid uppfinningen, är t ex glycerolfosfat, fenolfosfat och paranitrofenolfosfat, tymolftalinfosfat och vanligen dess mononatriumfosfat och liknande.

Reagenserna enligt uppfinningen användes för att bestämma dessa enzymer såsom sur fosfatas och alkalisk fosfatas, som reagerar med ett substrat, stabiliserat enligt uppfinningen. Som tidigare angivits, innehåller de substrat, som stabiliserats i det flytande mediet, en fosfatgrupp, hydrolyserbar från en organisk grupp, företrädesvis en aromatisk eller cyklisk grupp. Sålunda är, när det är fråga om paranitrofenolfosfat, som är en enkel organisk molekyl, nitrogruppen bunden till fenol- gruppen i paraposition och en fosfatgrupp är bunden till fenolgruppen genom svag syrebindning. Under reaktions- förloppet med enzymet kommer fosfatgruppen att spjälkas från molekylen och bilda fri fosfat och fri paranitro- fenol. Det alkaliska fosfatasenzymet spjälkar fosfat- gruppen från substratet vid ett alkaliskt pH och pâ samma sätt spjälkar det sura fosfataset fosfatgruppen från 4 substratet vid ett surt pH.

Substrat av denna typ, exempelvis paranitrofenol- fosfat, är mycket labila organiska föreningar genom att fosfatgruppen hydrolyseras i vatten- eller t o m i alkohol- lösning, och därigenom blir substratet oanvändbart för enzymbestämning. Av detta skäl blandas i nuvarande kommer- siella alkaliska fosfatasreagenser en alkalisk buffert, vanligen en AMP-buffert (2-ammo-2-metyl-l-propanol) och paranitrofenolfosfat. Bufferten är normalt flytande och vid användningen blandas PNPP, som är ett torrt material, in i lösningen, vanligen i ett vattenhaltigt media och lösningen användes för att prova enzymaktiviteten. Enligt uppfinningen tillsättes en buffert till en sådan mängd 10 15 20 25 30 35 447 123 7 att den justerar pH-värdet till en riktig nivå. Exempelvis i det fall, då substratet stabiliseras för användning vid alkalisk fosfatasbestämning, skyddas substratet från hydrolys genom att stabiliserande ämne såsom fenol, som skyddar fosfatgruppen från hydrolys t o m vid förhöjda temperaturer.

Sedan den flytande, stabiliserade lösningen har beretts, dispenseras den pá mörka glasflaskor, vilka förseglas lufttätt. I typiska fall lagras dessa flaskor nedkylda. Den beräknade livslängden hos de stabiliserade enzymerna och koenzymerna är upp till ett eller två år under sådana förhållanden utan att något nämnvärt sönder- fall sker.

Inom det klinsikt diagnostiska området representeras den kommersiella tillämpningen av uppfinningen av - men är icke begränsad till - diagnostiska reagenser, som används för att bestämma enzymkoncentration, som t ex alkaliska fosfataskoncentrationer i biologiska vätskor och liknande. Inte desto mindre kän kompositioner, som beretts enligt uppfinningen, användas för att bestämma och kvantifiera andra biologiska beståndsdelar som t ex surt fosfatas (ACP) eller alkalisk fosfokinas (ALP) och liknande hos biologiska vätskor.

De ovan angivna enzymerna reagerar ofta på samma sätt med avseende på substraten enligt uppfinningen och nägra av de aktuella kemiska reaktionerna är gemensamma.

De ovannämnda enzymerna är endast exempel och det är underförstått att andra enzymer kan bestämmas enligt uppfinningen. Följande kemiska reaktionsformler lämnas som en modell för att illustrera den allmänna naturen hos de aktuella reaktionerna.

Reaktionsschema 1 - allmän modell Enzym (1) SUBSTRAT + Mg ie PRODUKT + Pi pH 15 20 25 30 35 447 123 8 Reaktionsschema 2 - speciell modell (2) PNPP + (mgA + AMF) ---_--> PNP + Pi ps 10 - 10,5 Reaktionsschema 3 - speciell modell (3) PP + (MgA) *mb fenol + Pi pH 4 - 4,5 I ovanstående reaktionsschema har för enkelhets skull symboler använts, vilka har följande betydelse: PNPP paranitrofenolfosfat MgA magnesiumaspertat AMP 2-amino-2-metyl-1-propanol PNP paranitrofenol Pi en fosfatgrupp, vanligen P04 PP fenolfosfat .v I ovanstående reaktionsschema visar den allmänna modellen, att substratet vanligen kombineras med en buffert vid reaktionsbestämningen för ett särskilt enzym och åstadkommer en produkt liksom en fosfatgrupp. Såsom angivits är fosfatgruppen normalt P04, vilket beror på mängden av den buffert, som användes och de särskilda reaktionskomponenterna. Fosfatgruppen kan vara närvarande som en jon i lösningen eller på annat sätt bunden till bufferten, vilken i detta senare fall tjänar som en receptor för fosfatgruppen.

Reaktionsschema 2 visar en speciell modell för be- stämning av alkalisk fosfatas. I detta fall bör obser- veras att ett magnesiumsalt, såsom magnesiumaspertat, är närvarande för att aktivera enzymet. Det tredje reak- tionsschemat visar en speciell modell för bestämning av sur fosfatas.

Enligt uppfinningen skiljes substratkompositionen från buffertkompositionen och förvaras i en annan behållare, 10 15 20 25 30 35 447 123 9 varvid kompositionen blandas vid en tidpunkt då bestäm- ningen sker. Sålunda förvaras substratet och en stabili- sator i ett flytande medium i en behållare och bufferten och magnesiumföreningen i ett flytande media förvaras i en annan behållare.

Buffertkompositionen innehåller en lämplig buffert- agent, som t ex AMF. AMP-bufferten användes företrädesvis i samband med bestämning av alkalisk fosfatasenzym.

Emellertid kan andra buffertagenter användas, företrädes- vis aminoorganiska buffertagenter, innefattande dietylamin och trietylamin, en tríbuffert (tri(hydroxymetyl)amino- metan), såsom exempel. Icke-organiska buffertagenter kan också användas och innefattar exempelvis natrium- karbonat och natriumbikarbonat. Det är viktigt att buffert- agenten ger det önskade pH-området vid den stabiliserade kompositionen. I några fall kan det vara önskvärt att tillsätta en syra som t ex saltsyra, ättiksyra, bärn- stensyra etc för att justera pH-värdet till önskad nivå.

Buffertagenten för den sura fosfatasreagenskomposi- tionen kan innefatta olika salter och syror, som åstad- kommer ett surt pH i den stabiliserade kompositionen.

Sålunda kan t ex natriumacetat, ättiksyra, natriumklorid- saltsyra, buffertlösningar och "PIPES"-buffert användas.

Magnesiumsaltet är avsett att aktivera det lösta enzymet, och innefattas också i buffertkompositionen.

Det magnesiumsalt, som ingår i buffertkompositionen, är företrädesvis magnesiumaspertat, eftersom det inte tycks bli någon utfällning av magnesium. Emellertid kan andra magnesiumsalter användas, innefattande t ex magnesium- klorid, magnesiumacetat, magnesiumfluorid och möjligen magnesiumcitrat. Andra buffertar, som kan användas vid uppfinningen, åtminstone vid bestämningar av det alkaliska fosfatasenzymet, innefattar dietanolamin och natrium- karbonat.

Den buffert, som åstadkommer de riktiga pH-områdena, bör i stort sett inte störa fosfatasaktiviteten. När det gäller en reagenskomposition för bestämning av alkalisk 10 15 20 25 30 35 447 123 10 fosfatas bör bufferten företrädesvis ge ett pH på ca 10,0 till 10,5, ehuru pH kan variera från ca 9,5 till 10,7. I själva verket kan pH-området sträcka sig från ca 9 till ca 12, ehuru vid pH-nivåer under 10,0 och över 10,7 buffertkapaciteten minskas. När det är fråga om reagenskompositioner för sur fosfatas bör pH-värdet företrädesvis ligga inom området från 4,0 till 4,5 ehuru pH-värdet bör ligga i området från 3,5 till 4,8. Medan pH-värdet kan vara mindre än 3,6 och något högre än 4,8, kommer emellertid åter buffertaktiviteten att minska.

Magnesiumföreningar ingår i buffertkompositionen i en koncentration av ca 10 millimol, ehuru koncentra- tionen kan variera från 5,5 millimol till ca 50 millimol, om så erfordras. Bufferten, och särskilt AMP-bufferten, ingår med ca 0,8 mol, ehuru bufferten kan variera från 0,05 mol till ca 2 mol.

Substratet förekommer i substratkompositionen till- sammans med en stabiliserande agent av den typ, som nedan beskrivas mera i detalj. En av de föredragna stabilise- rande agenterna är fenol, ehuru andra stabiliserade agenter, som beskrivs nedan, också kan användas. I denna substrat- komposition förekommer substratet, exempelvis PNPP, i ca 100 millimol i lösning upp till mättningspunkten på ca 1 mol. Företrädesvis ingår PNPP till en mängd av ca 2 millimol till ca 0,8 mol i substratkompositionen.

Fenolen ingår med ungefär samma mängd ehuru fenolen kan ingå i substratkompositionen med åtminstone dubbla mängden av substratet. Vatten utgör sedan vanligen återstoden av den stabiliserade substratkompositionen.

En lämplig buffertagent kan också ingå i substrat- kompositionen som t ex trietanolamin, trihydroxiamin etc för att justera substratkompositionens pH-värde från ca 8,0 till ca 9,5 och företrädesvis från ca 8,5 till ca 9,0. Substratkompositionen tillsättes buffertkompo- sitionen vid det tillfälle då en bestämning skall ske, i relativt små mängder så att pH-värdet av den slutliga blandningen av de två kompositionerna antager buffert- 10 15 20 25 30 35 447 123' ll kompositionens värde. Buffertagenten, såsom trietanolamin, tjänar också som solubiliseringsagent för fenolen eller annan stabilisator i substratkompositionen, som är effektiv vid solubilisering av fenol vid högre koncentrationer.

Vid frånvaro av denna buffertagent vid högre koncentrationer, kan fenolen tendera att bilda ett vattenskikt och ett fenolskikt såsom en tvàfasig lösning.

Ett antal andra substrat, som kan stabiliseras enligt uppfinningen, innefattar t ex salt av PNPP t ex natriumsalt eller dicyklohexylaminsalt. Dessutom kan man använda di-(trís-hydroxymetol)aminometan)salt, P-nitrofenolfosfat, dicyklohexylammoniumsalt, P-nitrofenolfosfat-di(2-amino- 2-etyl-l,3-propandiol)salt och P-nitrofenol-fosfat-dinatrium- salt-hexahydrat.

Förutom fenol kan stabilisatorn också innefatta olika fenolämnen, som också är effektiva som stabilisa- torer, exempelvis fenolämne, som innefattar sulfatgrupper, t ex parasulfofenyl och parasulfonsyrefenyl etc. Man har också funnit att enligt uppfinningen andra stabili- serande agenter än fenol kan användas och t ex innefattar imidazol, som ofta betecknas som "g1yoxalin", nämligen C H N 3 4 2 ningar med en till sex kolatomer, såsom nitrometan, nitro- . Man har funnit att olika nitroalifatiska före- etan etc, också har en viss effekt som stabilisatorer, ehuru de nitroalifatiska föreningarna är mindre effektiva än fenol och fenolföreningar. Fosfatföreningar är vanligen inte nödvändigtvis effektiva stabilisatorer, eftersom de utfaller tillsammans med ett magnesiumsalt.

När bufferten löses i vatten kan en lämplig bakteri- ostat tillsättas sàsom en azidförening, t ex natriumazid, företrädesvis till en mängd av ca 0,1 vikt%. Emellertid kan mängden tillförd azidförening eller annan bakteri- ostat variera mellan 0,01% - 0,5%. Man har funnit att enligt uppfinningen azidföreningen uppvisar en förmåga att bidraga till kompositionens stabilitet. Dessutom kan man använda andra baktericida eller fungicida agenter, som inte reagerar kemiskt med bufferten eller förhindrar 10 15 20 25 30 35 447 123 12 den enzymatiska reaktionen. Några sådana agenter, som kan användas förutom natriumazid, är t ex bensoesyra, tymol eller pentaklorofenol. I många fall, särskilt vid buffertar med högt pH är bakteriostaten inte nödvändig och kan uteslutas.

Den verkliga stabiliseringsmekanismen är inte helt förklarad ehuru man har funnit att hydrolyseringen av fosfatet i vattenmedia inträffar tills dess ett jämvikts- tillstånd har uppnåtts. Det är klart att hydrolysreaktionen påverkas av reaktionskonstanten K för hydrolysen. Sålunda kan hydrolysreaktionen representeras genom: (R-P04) + ffí-í-y- R+ + P04 där R-P04 representerar den organiska förening, som har en fosfatgrupp och R+ representerar en förening efter hydrolysering av fosfatgruppen därifrån.

Reaktionskonstanten K representeras av och bestämmes ,i_enlighet med: _'V + _.

(R ) (P04 ) ~_""'"""_ï (R-P04) (H ) Enligt ovanstående kän reaktionen retarderas genom att överlagra reaktionsprodukterna med R+ eller P04 eller bådadera. Att överlagra reaktionsmediet med P04- kan påverka enzymernas reaktion vid en bestämningsreaktion.

Hydrolysreaktionen tycks äga rum till ett mättat jämvikts- tillstànd såvida den inte stabiliseras på annat sätt, och man har vidare funnit att stabilisatorn medför samma effekter som reaktionsprodukterna så att fenolen och de andra stabilisatorerna effektivt förhindrar hydroly- sering av ämnen som PNPP.

Sålunda är den stabilisator, som används vid uppfin- ningen sådan, att den medför samma effekt i reaktionsmediet som P04- eller R+. Pà detta sätt fungerar stabilisatorn som ett överskott på P04- eller R+ och förhindrar däri- 10 15 20 25 30 35 447 123 13 genom hydrolyseringsreaktionen_ Sålunda bör, i hydroly- zeringstermer, stabilisatorn vara tillräckligt nära det aktuella R+, t ex åtminstone beträffande effekten i lösning.

Vid den verkliga enzymbestämningen är emellertid enzymet mycket speciellt och påverkas endast av substratet och den speciella slutprodukten och påverkas inte av stabilisa- torn. _ Man har funnit att substratet, när det stabiliseras i enlighet med uppfinninen, har en förvánansvärd stabi- litet på upp till 18 månader eller 2 år vid ca 4°C eller "id kylskápstemperaturer. Dessutom är substratkomposi- tionen nästan helt stabil upp till 2 eller 3 månader vid rumstemperaturer.

Vid användning tillsättes substratkompositionen till buffertkompositionen antingen med en känd kvantitet eller droppvis beroende pá vilket som föredrages. Den erhållna lösningen blandas sedan och används vid rums- temperatur för bestämning av fosfatasenzymaktivitet genom tillsättning av fosfatasenzym till den blandade kompo- sitionen. Den slutliga lösningen av de två kompositio- nerna före analysen innehåller den alkaliska bufferten inom det önskade pH-omrâdet som beskrivts ovan, magnesium- saltet och substratet tillsammans med den stabiliserande agenten. I I den slutliga kompositionen är magnesiumsalt när- varande inom området fràn ca 0,5 millimol upp till ca 50 millimol och substratet är närvarande vid en koncent- ration, som inte understiger 0,5 millimol upp till en koncentration av ca 30 millimol. Man har funnit att fenol eller annan stabiliseringsagent tillsammans med solu- biliseringsagenter såsom trietanolamin, som fungerar effektivt som en solubiliseringsagent, inte påverkar bestämningen av fosfatasenzym. Man har också funnit att fenol vid mycket höga koncentrationer hämmar reaktionen något men endast i försumbar omfattning. Solubiliserings- agenten ingår i den flytande substratkompositionen för att förhindra fasseparation av stabiliseringsagenten. 10 15 20 25 30 35 447 123 14 När substratkompositionen och buffertkompositionen har blandats, tillsättes därefter det flytande provet, som innehåller fosfatasenzym, till den färdigblandade lösningen. Den alkaliska fosfatasaktiviteten bestämmes vid ca 405 nanometer vid konstant temperatur. Den kon- stanta temperaturen kan ligga var som helst från ca rums- temperatur på 25°C eller t o m lägre såsom 20°C, upp till 40°C eller t o m 50°C. Ovanför 50°C synes de alkaliska fosfatasenzymerna denaturera och medför att bestämningen blir oanvändbar.

När substratlösningen har beretts i sin stabiliserade form är den känslig för ljus och förvaras därför normalt i mörka eller gulfärgade flaskor och dessa flaskor kan utgöras av godtyckligt material, som inte reagerar med substratkompositionen såsom t ex plast eller glas.

Uppfinningen beskrives genom följande, icke begrän- sande exempel.

Exempel l: 0,8 mol AMP-buffert sättes till magnesiumaspertat ii ett vattenmedium och justeras till ett pH på ca 10,2 med en liten mängd saltsyra för att bilda en buffertkompo- sition.

Paranitrofenolfosfat blandas sedan med fenol i torr form och tillsättes en vattenlösning så att paranitro- fenolfosfat ingår till ca l mol och fenol i en mängd av ca 1,5 mol. Trietanolamin tillsättes också för att justera pH till ca 8,6 och för att vidare hämma hydrolysen av paranitrofenolfosfat. Den återstående lösningen utgöres av destillerat vatten för att forma en substratkomposition.

Sedan en fullständig lösning har uppnåtts, fylles buffertlösningen på en plast- eller glasbehàllare, som sedan förslutes. Pâ samma sätt fylles sedan substratlös- ningen på en plast- eller glasbehàllare med gul eller mörk färg, som förslutes. Behàllarna förseglas sedan och lagras under kylning- Man har funnit att en stabili- serad komposition på detta sätt ernár en lagringsstabilitet på upp till 2 år utan signifikant nedbrytning. 10 15 20 25 30 35 447 123 15 Exempel 2: Den substratkomposition och den buffertkomposition, som framställts enligt exempel l, blandas och en vätske- mängd, innehållande alkaliskt fosfatas, tillsättes denna komposition. Fenolstabilisatorn synes inte påverka reak- tionen med hänsyn till det alkaliska fosfataset. Para- nitrofenolens fosfatgrupp spjälkas fràn paranitrofenol- fosfat och utgör en bas för bestämning av alkaliskt fosfatas.

Exempel 3: Magnesiumacetat ersätter magnesiumaspertat enligt exempel l och är närvarande i väsentligen samma mängd som magnesiumaspertat. På samma sätt som tidigare upp- visar kompositionen samma långa lagringsstabilitet utan väsentlig nedbrytning.

Exempel 4: Magnesiumklorid ersätter magnesiumaspertat enligt exempel l och är närvarande i väsentligen samma mängd som magnesiumaspertat. Man erhåller ånyo en komposition, som uppvisar samma långa lagringsstabilitet utan väsentlig nedbrytning.

Exempel 5: Trietynolamin ersätter AMP i exempel l och är också närvarande i väsentligen samma mängd som AMP i exempel 1. I detta fall uppvisar substratkompositionen samma långa livslängd utan väsentlig nedbrytning.

Exempel 6: Parasulfofenyl ersätter fenolen i exempel l och är likaså närvarande i väsentligen samma mängd som fenolen.

Pà nytt uppvisar kompositionen samma långa livslängd utan väsentlig nedbrytning.

Exempel 7: Imidazol ersätter fenolen i exempel 1 och är också närvarande i väsentligen samma mängd som fenolen i exempel l. I detta fall uppvisar den erhållna substratkomposi- tionen samma långa livslängd utan väsentlig nedbrytning.

Claims (9)

10 l5 20 25 30 447 123 16 PATENTKRAV

1. l. Komposition, innefattande ett labilt organiskt diagnostiskt fosfatgruppsinnehâllande reagens, stabili- serat mot hydrolys i vattenhaltig lösning, k ä n n e - t e c k n a d därav, att kompositionen är avsedd för bestämning av fosfatasenzym, att den i det diagnostiska reagenset förekommande fosfatgruppen är avspjälkbar från reagenset genom inverkan av ett fosfatasenzym, varvid erhålles en cyklisk eller aromatisk återstod, att det organiska diagnostiska reagenset är stabi- liserat genom närvaro av ett stabiliseringsmedel, vilket utgöres av fenol, fenolföreningar, imidazol eller en nitroalifatisk förening med l-6 kolatomer, varvid stabili- seringsmedlet har samma eller en näraliggande effekt som ovan nämnda cykliska eller aromatiska återstod utan den vidhängande fosfatgruppen, såsom en reaktionsprodukt eller del därav vid en hydrolysreaktion, och/eller effekten av den fosfatgrupp, som skulle bildats vid en hydrolysreaktion, att stabiliseringsmedlet är närvarande i en mängd, som är tillräcklig för att genom järnviktsbildning hämma en kontinuerlig hydrolysreaktion av nämnda organiska diagnostiska reagens i en vattenhaltig vätska, i vilken reagenset och stabiliseringsmedlet blandas och väsent- ligen upplöses.

2. Komposition enligt krav l, n a d därav, att det organiska reagenset är parani- k ä n n e t e c k - trofenolfosfat.

3. Komposition enligt krav 1 eller 2, e t e c k n a d därav, att den vattenhaltiga kompositionen k ä n n innehåller ett solubiliseringsmedel för att förhindra fasseparation av stabiliseringsmedlet. 10 l5 20 25 30 35 447 123 17

4. Sätt för stabilisering av en komposition enligt krav l, 2 eller 3 mot hydrolys i en vattenlösning, inne- fattande ett labilt, organiskt diagnostiskt reagens, varvid reagenset innehåller en fosfatgrupp, k ä n n e - t e c k n a t därav, att nämnda reagens blandas med ett stabiliserande medel, som utgöres av fenol och/eller en feñblförening, imidazol eller en nitroalifatisk förening innehållande l-6 kolatomer, varvid nämnda stabi- liserande medel har näraliggande effekt som ifrågavarande cykliska eller aromatiska återstod utan fosfatgrupp har, såsom en reaktionsprodukt eller del därav i en hydrolysreaktion, eller såsom den fosfatgrupp som skulle bildats vid en hydrolysreaktion, och därigenom förhindra blandningens hydrolysreaktion, och vilken tillsättes i en mängd som är tillräcklig för att genom jämvikts- bildning hämma kontinuerlig hydrolysering av reagenset, att det med stabiliseringsmedlet blandade reagenset införes i en vattenhaltig vätska för att bilda en vatten- haltig lösning därav samt att lösningen lagras.

5. Sätt enligt krav 4, därav, att det labila organiska diagnostiska reagenset k ä n n e t e c k n a t stabiliseras mot hydrolys i en hydrolysreaktion av följande typ R-Po +H+_"_> 4 C___R++Po 4, varvid R ~ P04 representerar en cyklisk eller aro- matisk grupp med en fosfatgrupp medan P04 representerar en därifrån hydrolyserad fosfatgrupp och R+ represen- terar en reaktionsprodukt, baserad på R med fosfatgruppen borthydrolyserad därifrån, varvid nämnda reaktion normalt fortgår till mättnad i frånvaro av stabilisering mot hydrolys.

6. Sätt enligt krav 4 eller 5, n a t därav, att substratet är paranitrofenolfosfat k ä n n e t e c k - eller salter därav och att stabiliseringsmedlet är fenol eller en fenolförening. 10 15 20 447 123 18

7. Sätt enligt krav 4, 5 eller 6, t e c k n a t därav, att substratet är närvarande i k ä n n e - en mängd från 100 millimol till ett värde ungefär vid mättningsniván och att nämnda stabiliseringsmedel är närvarande i en mängd från ca 100 millimol till åtmin- stone dubbla mängden substrat.

8. Användning av en komposition enligt krav 1, 2 eller 3, framställd enligt något av kraven 4 - 7, k ä n n e t e c k n a d därav, att reagenset användes vid bestämning av fosfatasenzym och att nämnda blandning är ett substrat, som är specifikt med avseende på ett fosfatasenzym på sådant sätt att enzymet påverkas av substratet eller av slutprodukten vid en bestämnings- reaktion eller bàdadera och påverkas inte av stabilise- ringmedlet. U

9. Användning enligt krav 8, k ä n n e t e c k - n a d därav, att användningen sker inom ett pH-område mellan 9,5 - 10,7 för bestämning av alkaliskt fosfatas resp inom ett pH-område mellan 3,5 - 4,8 för bestämning av surt fosfatas.