DE3905861C2 - - Google Patents

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Cholinderivate der allgemeinen Formel (I)
gemäß Anspruch 1 und deren Verwendung zur Bestimmung der Cholinesterase-Wirksamkeit im Serum.
Die Verwendung der genannten Verbindungen erlaubt die leichte und einfache Bestimmung der Cholinesterase- Wirksamkeit und ist sehr nützlich für klinische Untersuchungen der Cholinesterase-Wirksamkeit im Serum.
Im allgemeinen wird die Konzentration von Cholinesterase (nachfolgend bezeichnet als ChE) im Serum bekanntlich herabgesetzt bei einem Patienten mit beispielsweise einer Lebererkrankung, während sie bekanntlich heraufgesetzt wird bei einem Patienten mit beispielsweise einer Nierenerkrankung. Deshalb können diese Erkrankungen diagnostiziert werden, indem man die Cholinesterase-Wirksamkeit im Serum dieser Patienten bestimmt, und die Bestimmungsmethode, die die genaue Bestimmung der Cholinesterase-Wirksamkeit im Serum erlaubt, kann für klinische Untersuchungen verwendet werden.
Hinsichtlich der Bestimmung der Cholinesterase-Wirksamkeit im Serum ist bisher von verschiedenen Verfahren unter Verwendung eines synthetischen Substrates berichtet worden, und einige von ihnen sind für tägliche klinische Untersuchungen anwendungsreif gemacht worden. Beispiele von bisher wohlbekannten Bestimmungsmethoden schließen (a) ein Gasanalyseverfahren, (b) ein pH-Meter-Verfahren, (c) ein pH-Indikator-Kolorimetrieverfahren, (d) Thiocholin-Farbbildungsverfahren, (e) ein enzymatisches Verfahren, (f) und ein UV-Verfahren ein.
(a) Das Gasanalyseverfahren (R. Ammon: Pflügers Arch. Ges. Physiol., 233, 487 (1933)) umfaßt die Verwendung von Acetylcholin als synthetisches Substrat, wobei man durch die enzymatische Wirkung von ChE erzeugte Essigsäure in Kontakt mit Natriumhydrogencarbonat bringt und erzeugtes Kohlendioxidgas quantitativ bestimmt.
(b) Das pH-Meter-Verfahren (H. O. Michel: J. Lab. & Clin. Med., 34, 1564, (1949)) umfaßt, wie das Gasanalyseverfahren, die Verwendung von Acetylcholin als synthetisches Substrat und die Messung eines pH-Wechsels wegen der durch die enzymatische Wirkung von ChE erzeugten Essigsäure mit einem pH-Meter.
(c) Das pH-Indikator-Kolorimetrieverfahren, ungleich dem pH-Meter-Verfahren, umfaßt die Verwendung von Acetylcholin als synthetisches Substrat und die Messung eines pH-Wechsel wegen der durch ChE erzeugten Essigsäure auf der Grundlage der molekularen Absorption des Indikators. Als Indikatoren werden Phenolrot (Hiroshi Takahashi und Susumu Shibata, Igaku-to-Seibutsugaku (Medicine and Biology), 20, 96 (1959)), Bromthymolblau (H. G. Biggs et al, Amer. J. Clin. Path., 30, 181 (1958)), oder m-Nitrophenol (Tadahide Sasaki, Rinsho-Byori (Chemical Pathology), 12, 555 (1964)) verwendet.
(d) Das Thiocholin-Verfahren (P. Garry, J. Clin. Chem., 11 (2), 91 (1965)) verwendet Acetylthiocholin, oder Butylthiocholin als Substrat. Diese Substrate ergeben Thiocholin durch die enzymatische Reaktion von ChE, und dann wird dieses Thiocholin mit 5,5′-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure (DTNB) zur Reaktion gebracht, um eine gelbe Farbe zu erzeugen. Das Thiocholin-Verfahren umfaßt die Messung dieser gelben Farbe mittels eines Kolorimeters.
(e) Das enzymatische Verfahren umfaßt die Verwendung von Benzoylcholin (Hirosaki Okabe et al, Rinsho-Byori (Clinical Pathology), 25, 751 (1977)), oder von o-Toluoylcholin (JP-OS 138 533/79) als Substrat, wobei man durch die enzymatische Wirkung von ChE erzeugtes Cholin durch Cholinoxidase zu Betain umsetzt und 4-Aminoantipyrin einer oxidativen Kondensationsreaktion mit Phenol, durch in Anwesenheit von Peroxidase so erzeugtes Wasserstoffperoxid unterwirft, um Farbbildung zu verursachen.
(f) Das UV-Verfahren schließt zwei Arten von Verfahren ein, und zwar ist das eine ein Verfahren von W. Kalow, wobei Benzoylcholin als Substrat verwendet wird (W. Kalow und K. Genet, Can. J. Biochem. & Physiol., 35, 339 (1975)), das andere ist ein Verfahren unter Verwendung von p-Hydroxybenzoylcholin als Substrat (JP-OS 110 198/82 und 129 999/83). Ersteres umfaßt die Ermittlung der Mengenabnahme des Substrates, hervorgerufen durch seine Hydrolyse infolge der enzymatischen Wirkung von ChE, bei einer Bestimmungswellenlänge von 240 nm. Letzteres umfaßt die Reaktion von p-Hydroxybenzoat-Hydroxylase mit durch die enzymatische Wirkung von ChE erzeugter p-Hydroxybenzoesäure in Gegenwart des Coenzyms NADPH und die Ermittlung der Abnahme der Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm durch die Oxidation von NADPH in NADP durch diese Reaktion.
Diese Bestimmungsmethoden beinhalten jedoch verschiedene Mängel und Probleme, welche für die Ungenauigkeit der ermittelten Werte verantwortlich sind. Diese Verfahren, z. B. das Gasanalyseverfahren (a) und das pH-Meter-Verfahren (b), sind insofern nachteilig, als ihre Durchführung aufwendig ist und praktische Probleme mit sich bringt, wie die Unmöglichkeit, viele Proben zu handhaben. Das pH-Indikator-Kolorimetrieverfahren (c) beinhaltet einfache Arbeitsabläufe, und es kann mit vielen Proben gearbeitet werden, aber dieses Verfahren ist insofern nachteilig, als beispielsweise die Reaktionszeit lange ist und der pH während der Reaktion nicht konstant gehalten wird und die ermittelten Werte bei niedrigen und hohen Werten nicht hinreichend reproduzierbar sind.
Jedes der vorgenannten Verfahren (a) bis (c) verwendet Acetylcholin als Substrat, und im Falle dieser Verfahren verursacht das Substrat selbst ebenfalls Nachteile, weil Acetylcholin dazu neigt, nicht-enzymatische Hydrolysereaktionen einzugehen, und keine hohe Substratspezifizität aufweist.
Das Thiocholin-Verfahren (d) ist insofern vorteilhaft, als es z. B. eine ausgezeichnete Reaktivität und eine hohe Empfindlichkeit aufweist, einfache Arbeitsabläufe beinhaltet, viele Proben gehandhabt werden können und es ermöglicht, Bestimmungen auch bei einem Verfahren mit einer Anfangsgeschwindigkeit durchzuführen. Es wird jedoch wegen der Gelbfärbung ernsthaft durch Bilirubin im Serum beeinträchtigt und unvermeidbar beeinträchtigt durch Verbindungen mit einer Thiolgruppe, wie Glutathion. Weiterhin ist es insofern nachteilig, als das Substrat selbst instabil ist. Diese Nachteile sind verantwortlich für die Fehlerhaftigkeit der erhaltenen Werte.
Im enzymatischen Verfahren (e) gibt es, da die Färbung rot ist, keine Interferenz durch Bilirubin im Serum, und es können viele Proben gehandhabt werden. Da Phenol oder 4-Aminoantipyrin als Reagenzien für das Farbgebungssystem verwendet werden, wird ChE jedoch kompetitiv inhibiert und die Menge dieser verwendeten Ragenzien ist stark eingeschränkt, so daß eine hinreichende Farbbildung schwierig ist. Außerdem wird in diesem enzymatischen Verfahren Wasserstoffperoxid verwendet. Im allgemeinen wird eine Bestimmungsmethode unter Verwendung von Wasserstoffperoxid nicht nur durch Bilirubin im Serum, reduzierende Substanzen, wie Ascorbinsäure, sondern auch durch Cholin, das durch Zersetzung von Phospholipiden gebildet wird, unvermeidbar beeinträchtigt. Insbesondere schließt die Verwendung von Benzoylcholin als ein Substrat verschiedene Probleme ein, z. B. dessen nicht-enzymatische Hydrolyse, die Probleme verursacht.
Im UV-Verfahren (f), einer Methode nach W. Kalow, wird Benzoylcholin als Substrat eingesetzt, und es wird die Mengenabnahme des Substrates direkt gemessen. Demzufolge ist das Prinzip dieser Bestimmungsmethode einfach. Dieses Verfahren ist jedoch insofern nachteilig, als beispielsweise, da die Bestimmungswellenlänge 240 nm ist, eine Neigung besteht, daß Interferenz durch Serumkomponenten auftritt. Auch kann die Reaktion nicht im optimalen pH-Bereich von ChE durchgeführt werden, da eine Neigung besteht, daß nicht-enzymatische Hydrolyse von Benzylcholin eintritt. Ebenso ist es insofern nachteilig, als z. B. bezüglich der Bestimmungswellenlänge eine Wellenlänge im Steigungsbereich des Absorptionsspektrums des Substrates verwendet wird, was zu einer großen Abweichung des Absorptionskoeffizienten wegen der Wellenlängenabweichung führt.
Das UV-Verfahren, das p-Hydroxybenzoylcholin als Substrat verwendet, ist ein ausgezeichnetes Verfahren zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit, welches es ermöglicht, die Reaktion im optimalen pH-Bereich durchzuführen, und es erlaubt, die Mängel des Wasserstoffperoxid-Färbungssystems zu beseitigen, namentlich die Beseitigung des Einflusses von Bilirubin, reduzierender Substanzen, wie Ascorbinsäure als auch der Interferenz durch Cholin, das durch Zersetzung von Phospholipiden gebildet wird, welches frei ist von den Mängeln des Thiocholin-Verfahrens und in einem Autoanalyzer, in dem viele Proben gehandhabt werden können, anwendbar ist. Da jedoch NADPH, das verwendete Koenzym, ein teures Reagens und nur wenig stabil ist, ist es schwierig, das Koenzym unter einer definierten Qualität zu halten. Ferner werden bei dieser Bestimmungsmethode p-Hydroxybenzoat-Hydroxylase oder Proto-catechuat-3,4-Dioxygenase als Enzymreagens verwendet, deshalb treten viele Faktoren ein, die Fehler der ermittelten Werte erzeugen.
Wie vorstehend dargelegt, beinhalten die herkömmlichen Verfahren zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit verschiedene Probleme und verursachen Fehler der ermittelten Werte.
Wir haben Forschungen unternommen, um die Mängel der herkömmlichen Bestimmungsmethoden der ChE-Wirksamkeit zu beseitigen. Erfindungsgemäß wurde 6-Acetoxymethyl-2-naphthoylcholinjodid (nachfolgend bezeichnet als AMNCI) synthetisiert, welches eine neue chemische Verbindung ist, und als ein Ergebnis von Forschungen auf dem Gebiet der Bestimmung der ChE-Wirkksamkeit durch ein UV-Verfahren, das diese Verbindung als Substrat verwendet, wurden die folgenden Tatsachen herausgefunden. Es kann eine Wellenlänge von ungefähr 335 bis ungefähr 355 nm als die Bestimmungswellenlänge verwendet werden, außerdem ist das Verfahren sehr stabil gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse und reagiert spezifisch mit ChE im Serum, insbesondere mit pseudo-Cholinesterase. Deshalb erlaubt die Verwendung von AMNCI die sehr genaue und in hohem Maße reproduzierbare Bestimmung der ChE-Wirksamkeit im Serum, was auch noch verschiedene andere Vorteile mit sich bringt.
Die Erfindung ist auf ein neues Cholinderivat der allgemeinen Formel (I)
in der X Jod, Chlor, Brom oder Fluor bedeutet, und auf dessen Verwendung zur Bestimmung der Cholinesterase-Wirksamkeit in einer Probe, die Cholinesterase und das Cholinderivat mit der allgemeinen Formel (I) enthält, gerichtet.
Fig. 1 zeigt UV-Spektren von AMNCI (a) (Konzentration: 10 µM) und von 6-Acetoxymethyl-2-naphthoesäure (b) (Konzentration: 10 µM), gemessen in einem 250 mM Tris-Maleinsäure-Puffer (pH 8,0, 25°C).
Fig. 2 zeigt ein IR-Spektrum von AMNCI.
Fig. 3 zeigt den Zeitverlauf der ChE-Wirksamkeit im Serum durch die Verwendung von AMNCI als Substrat.
Fig. 4 ist ein Diagramm, das den optimalen pH von ChE zeigt.
Fig. 5 ist ein Diagrann, daß die Wirkung der Pufferkonzentration auf die ChE-Wirksamkeit zeigt.
Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Stabilität von AMNCI gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse zeigt.
Fig. 7 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Serumverdünnung und der ChE-Wirksamkeit zeigt.
Fig. 8 zeigt eine S-V-Kurve und eine Lineweaver-Burk- Auftragung.
Das neue Cholinderivat kann hergestellt werden, indem man 2,6-Dimethylnaphthoylcarboxylat reduziert, um 6-Hydroxymethylnaphthoesäure zu erhalten, die Hydroxygruppe der 6-Hydroxymethylgruppe der so erhaltenen Verbindung acetyliert, die acethylierte Verbindung mit 2-Dimethylaminoethanol umsetzt und dann die sich ergebende Verbindung mit Methylhalogenid, wie Methyljodid, zur Reaktion bringt.
Die Bestimmungsmethode der ChE-Wirksamkeit unter Verwendung des neuen Cholinderivates (AMNCI) wird nachfolgend erläutert.
Die UV-Spektren von AMNCI (a) und 6-Acetoxymethyl-2- naphthoesäure (b) sind in Fig. 1 gezeigt. Durch Hydrolyse durch die Wirkung von ChE ergibt AMNCI Cholin und 6-Acetoxymethyl-2-naphtoesäure. Cholin weist keine UV-Absorption bei einer Wellenlänge länger als 300 nm auf. 6-Acetoxymethyl-2-naphtoesäure weist fast keine UV-Absorption bei einer Wellenlänge länger als 335 nm auf. Andererseits weist AMNCI eine UV-Absorption bei einer Wellenlänge kürzer als 355 nm auf. Deshalb tritt, wenn AMNCI als Substrat zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit verwendet und die Reaktion bei einer Wellenlänge von 335 bis 355 nm verfolgt werden, keine ernsthafte Interferenz durch Serumkomponenten auf. Deshalb kann eine Mengenabnahme des Substrates AMNCI genau bestimmt werden, so daß die ChE-Wirksamkeit genau ermittelt werden kann. AMNCI weist auch noch viele andere Vorteile auf, wie nachfolgend beschrieben wird.
Das Cholinderviat der allgemeinen Formel (I) wird zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit verwendet, wobei eine Probe, enthaltend ChE, mit dem durch die allgemeine Formel (I) dargestellten neuen Cholinderivat gemischt und dann die optische Absorption, insbesondere bei einer Wellenlänge von ungefähr 335 bis ungefähr 355 nm, gemessen werden.
In dem UV-Verfahren nach W. Kalow ist, wie bereits vorstehend erwähnt, die Bestimmungswellenlänge 240 nm, deshalbt tritt ernsthafte Interferenz durch Blutkomponenten bei den anfänglichen Absorptionen auf. Andererseits tritt bei der Bestimmungswellenlänge von ungefähr 335 bis ungefähr 355 nm für das erfindungsgemäß verwendete Substrat keine bedeutende Interferenz auf, so daß die ChE-Wirksamkeit unter optimalen Bestimmungsbedingungen ermittelt werden kann. In dem UV-Verfahren nach W. Kalow hat das als Substrat verwendete Benzoylcholin in 1/15 M Phosphatpuffer (pH 7,40) ein Absorptionsmaximum nahe 230 nm, und die Absorptionskurve weist einen Steigungsbereich bei der Bestimmungswellenlänge von 240 nm auf. Deshalb ist die Abweichung des Absorptionskoeffizienten wegen der Abweichung der Wellenlänge groß. Das neue Substrat AMNCI hat ein Absorptionsmaximum nahe 335 nm, wobei diese Tatsache es ermöglicht, die Bestimmungswellenlänge bei einem Absorptionspeak festzulegen. Dies legt nahe, daß die Differenz beim Absorptionskoeffizienten, die durch das Problem geringerer Genauigkeit der Bestimmungswellenlänge des Analyzers hervorgerufen wird, sehr klein und die Differenz bei den gemessenen Werten in unterschiedlichen Geräten ebenfalls klein werden.
Darüber hinaus kann die Enzymreaktion, da Benzoylcholin bei Konzentrationen von 50 µM oder mehr Substratinhibierung erfährt, nicht bei hohen Substratkonzentrationen durchgeführt werden, was zu einem engen Bereich der Linearität des Zeitverlaufs in den Absorptionskurven führt, so daß die Bestimmung nicht bis zu hohen Einheiten der ChE-Wirksamkeit durchgeführt werden kann. Im Gegensatz dazu erfährt das neue Substrat der vorliegenden Erfindung bis zu Substratkonzentrationen von 300 µM keine Substratinhibierung, und deshalb kann die Reaktion bei hohen Substratkonzentrationen im Reaktionssystem ausgeführt werden (siehe Fig. 8).
Ferner ist das neue Substrat AMNCI sehr stabil gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse. Beispielsweise trat in einem 250 mM Tris-Maleinsäure-Puffer, pH 8,0, bei 37°C 60 Minuten lang kaum Hydrolyse ein (siehe Fig. 6). Dieses Ergebnis zeigt, daß nicht-enzymatische Hydrolyse bei der Bestimmung vernachlässigbar ist und die ChE-Wirksamkeit sehr genau bestimmt werden kann.
Als Puffer, um den pH des Reaktionssystems konstant zu halten, können Barbiturate, Phosphate, Pyrophosphate, Glycin, Glycylglycin oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan verwendet werden. Jeder andere Puffer kann auch verwendet werden, so lange er seine Pufferkapazität im pH-Bereich von 7,5 bis 10,0 aufrecht erhalten kann.
Die Michaelis-Konstante (Km-Wert) von AMNCI für ChE ist im wesentlichen dieselbe wie die von Benzoylcholin und beträgt ungefähr 5×10-5 (1/20×10-3) Mol/l in einem 250 mM Tris-Maleinsäure-Puffer (pH 8,0) (siehe Fig. 8). Der Km-Wert von AMNCI ist klein genug, um die Reaktion bei einer hohen Substratkonzentration im Reaktionssystem der Bestimmungsmethode der vorliegenden Erfindung durchzuführen, und der Bereich der Linearität von Absorption und Zeit wird vergrößert, so daß die Bestimmung für hohe Einheiten der ChE-Wirksamkeit in hinreichendem Maße durchgeführt werden kann.
Wenn AMNCI als Substrat verwendet wird, liegt der optimale pH von ChE in einem 250 mM Tris-Maleinsäure-Puffer nahe 8,0 (siehe Fig. 4). Wie bereits vorstehend ausgeführt, ist AMNCI bei pH 8,0 stabil gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse, deshalb macht es die Bestimmungsmethode unter Verwendung des Cholinderivates mit der allgemeinen Formel (I) möglich, die Enzymreaktion am pH-Optimum von ChE durchzuführen.
Als Cholinesterasen sind zwei Arten bekannt, nämlich pseudo-ChE, das in Serum vorkommt, und echtes ChE, das in Erythrocyten vorkommt. Die Cholinesterase, deren Wirksamkeit üblicherweise in einer klinischer Untersuchung bestimmt wird, ist pseudo-ChE in Serum. Da aber Serum mit echtem ChE in einigen Fällen kontaminiert ist, wird ein Substrat bevorzugt, das selektiv mit pseudo-ChE alleine reagiert. Das zur Bestimmung der Cholinesterase-Wirksamkeit verwendete AMNCI ist ein Substrat mit sehr hoher Spezifität, das gut mit pseudo-ChE, jedoch kaum mit echtem ChE reagiert.
Ausgestaltungen der Verwendung des Cholinderivates zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit werden im einzelnen in den nachfolgend beschriebenen Beispielen gezeigt und die Maßnahmen, die in einem herkömmlichen UV-Verfahren angewandt werden, können auch in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen.
Durch die Verwendung des neuen Cholinderivates mit der allgemeinen Formel (I) zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit treten die bisherigen Probleme bei der Bestimmung der ChE-Wirksamkeit nicht mehr auf. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend beschrieben.
  • (1) Der Reaktionsmechanismus des Bestimmungssystems ist einfach und klar, und es treten nur sehr wenige Fehlerquellen bei den erhaltenen Werten auf.
  • (2) Die Bestimmung kann bei der Wellenlänge einer Spitze der Absorptionskurve (335 nm) durchgeführt werden.
  • (3) Da das in der Erfindung als Substrat verwendete AMNCI stabil gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse ist, ist die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Werte sehr hoch.
  • (4) AMNCI hat eine hohe Substratspezifität für peudo-ChE.
  • (5) Da es unnötig ist, eine Blindprobe für jede Probe einzusetzen, kann die Bestimmung einfach und schnell durchgeführt werden, so daß viele Proben auf einmal gehandhabt werden können.
  • (6) Da AMNCI stabil ist, kann die Enzymreaktion am pH-Optimum (8,0 bis 8,2) für ChE durchgeführt werden.
  • (7) Da AMNCI keine Substratinhibierung erfährt, kann die Reaktion bei hohen Substratkonzentrationen durchgeführt werden.
  • (8) Die Bestimmung ist möglich bis zu hohen Einheiten der ChE-Wirksamkeit.
Wie bereits festgestellt, ist die Bestimmung der ChE-Wirksamkeit unter Verwendung des neuen Cholinderivates frei von den Mängeln der herkömmlichen Verfahren, weist viele Vorteile und Charakteristika auf. Eine genaue und einfache Bestimmung der ChE-Wirksamkeit ist somit möglich und die Bestimmung der ChE-Wirksamkeit in täglichen klinischen Untersuchungen kann bedeutend erleichtert werden. Die Verwendung des Cholinderivates mit der Formel (I) zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit ist eine nützliche Bestimmungsmethode der ChE-Wirksamkeit im Serum von normalen Personen, von Patienten mit Lebererkrankung usw., von Patienten mit Nierenerkrankung.
Beispiel 1 Synthese von 6-Acetoxymethyl-2-naphthoyl-cholinjodid (AMNCI)
Eine Lösung von 21,6 g 2,6-Naphthalindicarbonsäure und 28,5 g Thionylchlorid in 200 ml trockenem Benzol, enthaltend einen Tropfen Pyridin, wurde 2 Stunden lang am Rückfluß gehalten, wonach das Lösungsmittel eingeengt wurde, um 23 g 2,6-Naphthoyldichlorid zu erhalten. Diese Substanz wurde in 500 ml trockenem Methanol 2 Stunden lang am Rückfluß gehalten, die entstehenden Fällungen wurden durch Filtration gesammelt, um 19 g 2,6-Dimethylnaphthalindicarboxylat zu erhalten. Dieses Produkt wurde in 500 ml 50%igem Ethanol suspendiert, worauf 30 g NaBH₄ zugegeben wurden, und es wurde die Reduktion durchgeführt, um 12 g 6-Hydroxymethyl-2-naphthoesäure zu erhalten. Zu dieser Substanz wurden 11,9 ml Essigsäureanhydrid und 1 Tropfen konz. Schwefelsäure zugegeben. Die entstehende Mischung wurde 30 Minuten lang am Rückfluß gehalten, um 10 g 6-Acetoxymethyl-2-naphthoesäure zu erhalten, Schmelzpunkt: 180 bis 190°C.
Elementaranalyse für C₁₄H₁₂O₄ (M. W. 244,250)
Gefunden (%):
C 69,03; H 4,83.
Berechnet (%):
C 68,85; H 4,95.
Eine Lösung von 8,4 g 6-Acetoxymethyl-2-naphthoesäure in 150 ml trockenem Toluol, enthaltend 5,4 ml Thionylchlorid und 1 Tropfen Pyridin, wurde 30 Minuten lang am Rückfluß gehalten, abgekühlt und dann die sich ergebende Mischung filtriert. Das Lösungsmittel des Filtrates wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, um 8,5 g 6-Acetoxymethyl-2-naphthoylchlorid zu erhalten. Diese Substanz wurde in 50 ml trockenem Toluol gelöst und die sich ergebende Lösung wurde tropfenweise zu einer Lösung von 7 ml 2-Dimethylaminoethanol in 150 ml trockenem Toluol unter Kühlung auf 5 bis 10°C gegeben. Danach wurde die entstandene Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Wasser und dann mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Die Toluolphase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert, um 8,5 g einer öligen Substanz zu erhalten. Diese Substanz wurde in 200 ml Aceton gelöst, worauf eine Lösung von 3,7 g Methyljodid in 50 ml Ethylacetat zugefügt wurde. Die Lösung wurde unter Kühlen stehen gelassen, wonach die ausgefällten Kristalle durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und dann im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet wurden, um 10,2 g 6-Acetoxymethyl-2-naphthoylcholin­ jodid (AMNCI) zu erhalten, Schmelzpunkt: 182 bis 184°C. Diese Kristalle ergaben einen einzigen Fleck (Rf=0,36) in einer Silicagel-Dünnschichtchromatografie (n-Butanol: Essigsäure : Wasser=4 : 1 : 2).
Elementaranalyse für C₁₉H₂₄NO₄I (M. W. 457,312)
Gefunden (%):
C 49,72; H 5,36; N 3,06.
Berechnet (%):
C 49,90; H 5,29; N 3,06.
UV-Spektrum und IR-Spektrum des synthetisierten Produktes sind in Fig. 1 bzw. 2 gezeigt.
Beispiel 2 Bestimmung der ChE-Wirksamkeit im Serum unter Verwendung des Cholinderivates mit der Formel (I):
  • (1) ein 250 mM Tris-Maleinsäure-Puffer, pH 8,0 (25°C).
  • (2) eine Probe
  • (3) eine 1,3 mM wäßrige Substratlösung (AMNCI)
Zu 2,0 ml des Puffers (1) wurden 0,10 ml der Probe gegeben, und es wurde eine Vorerwärmung bei 37°C ungefähr 2 bis 10 Minuten lang durchgeführt. Es wurden 0,5 ml der Substratlösung (3) zugefügt, und dann wurde nach genau 20 und 80 Sekunden die optische Absorption bei einer Wellenlänge von 335 nm bestimmt, um die Veränderung der optischen Absorption pro Minute zu ermitteln. Fig. 3 zeigt den Zeitverlauf.
Als die Probe (Serum) wurde Consera I (hergestellt von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) verwendet. Der Wert der ChE-Wirksamkeit wird aus der folgenden Gleichung berechnet:
  • (1) Δ O. D. ist die Änderung der optischen Absorption pro Minute bei einer Wellenlänge von 335 nm.
  • (2) Der molekulare Absorptionskoeffizient bei 335 nm beträgt 1195.
Aus der obigen Gleichung wurde das verwendete Serum mit 461 (IE/l) Einheiten ermittelt. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde Linearität ohne Zeitverschiebung beim Zeitverlauf bis zu 7 Minuten bei 690 (IE/l) ChE-Einheiten beobachtet. Diese Tatsache zeigt an, daß Autoanalyzer eingesetzt werden können.
Beispiel 3
Der pH des Puffers (1) in Beispiel 2 wurde von 7,6 bis 8,4 verändert, und das pH-Optimum für ChE wurde im genannten Verfahren bestimmt. Diese Bestimmung wurde in vollem Umfang gemäß Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme des pH′s des Puffers. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Unter diesen Bedingungen betrug der optimale pH 8,0.
Beispiel 4
Die Konzentration des Puffers (1) in Beispiel 2 wurde von 50 bis 300 mM variiert, und die optimale Konzentration des Puffers wurde im genannten Verfahren bestimmt. Die Bestimmung wurde in vollem Umfang gemäß Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme der Konzentration des Puffers. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Unter diesen Bedingungen betrug die optimale Konzentration des Puffers 200 bis 300 mM.
Beispiel 5
Zu den 2,0 ml Puffer (2) in Beispiel 2 wurden 0,5 ml Substratlösung (3) zugefügt und die entstehende Lösung wurde in eine wärmeisolierende Küvette mit einer Temperatur von 37°C gegeben. Die Änderung der optischen Absorption bei einer Wellenlänge von 335 nm wurde in Abhängigkeit der Zeit verfolgt, wobei die Stabilität des Substrates gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse untersucht wurde. Als Ergebnis war das Substrat bis zu 60 Minuten nahezu stabil, wie in Fig. 6 gezeigt. Da das Substrat AMNCI stabil beim pH-Optimum von 8,0 ist, ist es unnötig, einen Reagens-Blindwert für jede Probe zu ermitteln.
Beispiel 6
Die Substratspezifität wurde gemäß dem Bestimmungsverfahren in Beispiel 2 untersucht. Als Probe wurden pseudo-ChE (hergestellt von Sigma), 10 E/ml, und echtes ChE (hergestellt von Sigma), 10 E/ml, eingesetzt. Die Abnahmegeschwindigkeit der optischen Absorption (Detla E/Min.) betrug 0,0470 für pseudo-ChE bzw. 0,0005 für echtes ChE. Das Reaktivitätsverhältnis von pseudo-ChE zu echtem ChE, erhalten aus der Abnahmegeschwindigkeit der optischen Absorption, war ungefähr 1 : 0,01. Diese Tatsache zeigt, daß die Substratspezifität von AMNCI sehr hoch ist.
Beispiel 7
Die Beziehung zwischen der Verdünnung des Serums und der ChE-Wirksamkeit wurde gemäß Beispiel 2 untersucht. Das Serum wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung, enthaltend 5% Albumin, verdünnt. Wie in Fig. 7 gezeigt, sind Serum-Verdünnung und ChE-Wirksamkeit proportional, und zwar gemäß einer Geraden, die durch den Null-Punkt geht. Diese Tatsache macht deutlich, daß die ChE-Wirksamkeit in weitem Maße von niedrigen bis zu hohen Einheiten bestimmt werden kann.
Beispiel 8
Die Substratlösungen (3) in Beispiel 2 wurden in geeigneter Weise als verdünnte Lösungen verwendet, aus diesen Lösungen wurde eine Lineweaver-Burk-Auftragung erhalten. Der Km-Wert für das Substrat der vorliegenden Erfindung wurde mit 5×10-5 Mol/l aus dieser Auftragung berechnet (siehe Fig. 8). Aus dieser Tatsache geht deutlich hervor, daß das Substrat der vorliegenden Erfindung hohe Affinität zu ChE aufweist und eine hinreichende Anwendbarkeit für dieses Reaktionssystem besitzt.

Claims (3)

1. 6-Acetoxymethyl-2-naphthoylcholinhalogenide der allgemeinen Formel (I) in der X Fluor, Chlor, Brom oder Jod bedeutet.
2. Verwendung eines 6-Acetoxymethyl-2-naphthoylcholinhalogenids der allgemeinen Formel (I) des Anspruchs 1 zur Bestimmung der Cholinesterase-Wirksamkeit.
3. Verwendung von 6-Acetoxymethyl-2-naphthoylcholinjodid gemäß Anspruch 2.
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