DE3905861A1 - Neues cholinderivat und verfahren zur bestimmung von serum-cholinesterase-wirksamkeit unter verwendung desselben - Google Patents

Neues cholinderivat und verfahren zur bestimmung von serum-cholinesterase-wirksamkeit unter verwendung desselben

Info

Publication number
DE3905861A1
DE3905861A1 DE3905861A DE3905861A DE3905861A1 DE 3905861 A1 DE3905861 A1 DE 3905861A1 DE 3905861 A DE3905861 A DE 3905861A DE 3905861 A DE3905861 A DE 3905861A DE 3905861 A1 DE3905861 A1 DE 3905861A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
che
substrate
effectiveness
determination
amnci
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE3905861A
Other languages
English (en)
Other versions
DE3905861C2 (de
Inventor
Katsumasa Kuroiwa
Katsuhiro Katayama
Takeshi Nagasawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nitto Boseki Co Ltd
Original Assignee
Nitto Boseki Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nitto Boseki Co Ltd filed Critical Nitto Boseki Co Ltd
Publication of DE3905861A1 publication Critical patent/DE3905861A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3905861C2 publication Critical patent/DE3905861C2/de
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C219/02—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C219/04—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C219/14—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having at least one of the hydroxy groups esterified by a carboxylic acid having the esterifying carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/30—Naphthol derivatives, e.g. alpha-naphthyl-esters, i.e. alpha-NE, beta-naphthyl-esters, i.e. beta-NE
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Cholinderivat, dargestellt durch die allgemeine Formel (I)
worin X ein Halogenatom ist, sowie ein Verfahren zur Bestimmung der Cholinesterase-Wirksamkeit im Serum, gekennzeichnet durch die Verwendung desselben als ein Substrat.
Das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die leichte und einfache Bestimmung der Cholinesterase- Wirksamkeit und ist sehr nützlich für klinische Untersuchungen der Cholinesterase-Wirksamkeit im Serum.
Im allgemeinen wird die Konzentration von Cholinesterase (nachfolgend bezeichnet als ChE) im Serum bekanntlich herabgesetzt bei einem Patienten mit beispielsweise einer Lebererkrankung, während sie bekanntlich heraufgesetzt wird bei einem Patienten mit beispielsweise einer Nierenerkrankung. Deshalb können diese Erkrankungen diagnostiziert werden, indem man die Cholinesterase-Wirksamkeit im Serum dieser Patienten bestimmt, und die Bestimmungsmethode, die die genaue Bestimmung der Cholinesterase-Wirksamkeit im Serum erlaubt, kann für klinische Untersuchungen verwendet werden.
Hinsichtlich der Verfahren zur Bestimmung der Cholinesterase-Wirksamkeit im Serum ist bisher von verschiedenen Verfahren unter Verwendung eines synthetischen Substrates berichtet worden, und einige von ihnen sind für tägliche klinische Untersuchungen anwendungsreif gemacht worden. Beispiele von bisher wohlbekannten Bestimmungsmethoden schließen (a) ein Gasanalyseverfahren, (b) ein pH-Meter-Verfahren, (c) ein pH-Indikator-Kolorimetrieverfahren, (d) Thiocholin-Farbbildungsverfahren, (e) ein enzymatisches Verfahren, (f) ein UV-Verfahren usw. ein.
(a) Das Gasanalyseverfahren (R. Ammon: Pflügers Arch. Ges. Physiol., 233, 487 (1933)) umfaßt die Verwendung von Acetylcholin als ein synthetisches Substrat, wobei man durch die enzymatische Wirkung von ChE erzeugte Essigsäure in Kontakt mit Natriumhydrogencarbonat bringt und erzeugtes Kohlendioxidgas quantitativ bestimmt.
(b) Das pH-Meter-Verfahren (H. O. Michel: J. Lab. & Clin. Med., 34, 1564, (1949)) umfaßt, wie das Gasanalyseverfahren, die Verwendung von Acetylcholin als ein synthetisches Substrat und die Messung eines pH-Wechsels wegen der durch die enzymatische Wirkung von ChE erzeugten Essigsäure mit einem pH-Meter.
(c) Das pH-Indikator-Kolorimetrieverfahren, ungleich dem pH-Meter-Verfahren, umfaßt die Verwendung von Acetylcholin als ein synthetisches Substrat und die Messung eines pH-Wechsel wegen der durch ChE erzeugten Essigsäure auf der Grundlage der molekularen Absorption des Indikators. Als Indikatoren werden Phenolrot (Hiroshi Takahashi und Susumu Shibata, Igaku-to-Seibutsugaku (Medicine and Biology), 20, 96 (1959)), Bromthymolblau (H. G. Biggs et al, Amer. J. Clin. Path., 30, 181 (1958)), m-Nitrophenol (Tadahide Sasaki, Rinsho-Byori (Chemical Pathology), 12, 555 (1964)) usw. verwendet.
(d) Das Thiocholin-Verfahren (P. Garry, J. Clin. Chem., 11 (2), 91 (1965)) verwendet Acetylthiocholin, Butylthiocholin oder dergleichen als ein Substrat. Diese Substrate ergeben Thiocholin durch die enzymatische Reaktion von ChE, und dann wird dieses Thiocholin mit 5,5′-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure (DTNB) zur Reaktion gebracht, um eine gelbe Farbe zu erzeugen. Das Thiocholin-Verfahren umfaßt die Messung dieser gelben Farbe mittels eines Kolorimeters.
(e) Das enzymatische Verfahren umfaßt die Verwendung von Benzoylcholin (Hirosaki Okabe et al, Rinsho-Byori (Clinical Pathology), 25, 751 (1977)), von o-Toluoylcholin (JP-OS 138 533/79) oder dergleichen als ein Substrat, wobei man durch die enzymatische Wirkung von ChE erzeugtes Cholin durch Cholinoxidase zu Betain umsetzt und 4-Aminoantipyrin einer oxidativen Kondensationsreaktion mit Phenol oder dergleichen, durch in Anwesenheit von Peroxidase so erzeugtes Wasserstoffperoxid unterwirft, um Farbbildung zu verursachen.
(f) Das UV-Verfahren schließt zwei Arten von Verfahren ein, und zwar ist das eine ein Verfahren von W. Kalow, wobei Benzoylcholin als ein Substrat verwendet wird (W. Kalow und K. Genet, Can. J. Biochem. & Physiol., 35, 339 (1975)), das andere ist ein Verfahren unter Verwendung von p-Hydroxybenzoylcholin als ein Substrat (JP-OS 110 198/82 und 129 999/83). Ersteres umfaßt die Ermittlung der Mengenabnahme des Substrates, hervorgerufen durch seine Hydrolyse infolge der enzymatischen Wirkung von ChE, bei einer Bestimmungswellenlänge von 240 nm. Letzteres umfaßt die Reaktion von p-Hydroxybenzoat-Hydroxylase mit durch die enzymatische Wirkung von ChE erzeugter p-Hydroxybenzoesäure in Gegenwart des Coenzyms NADPH und die Ermittlung der Abnahme der Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm durch die Oxidation von NADPH in NADP durch diese Reaktion.
Diese Bestimmungsmethoden beinhalten jedoch verschiedene Mängel und Probleme, welche für die Ungenauigkeit der ermittelten Werte verantwortlich sind. Diese Verfahren, z. B. das Gasanalyseverfahren (a) und das pH-Meter-Verfahren (b), sind insofern nachteilig, als ihre Durchführung aufwendig ist und praktische Probleme mit sich bringt, wie die Unmöglichkeit, viele Proben zu handhaben, und dergleichen. Das pH-Indikator-Kolorimetrieverfahren (c) beinhaltet einfache Arbeitsabläufe, und es kann mit vielen Proben gearbeitet werden, aber es sollte herausgestellt werden, daß dieses Verfahren insofern nachteilig ist, als beispielsweise die Reaktionszeit lange ist und der pH während der Reaktion nicht konstant gehalten wird und die ermittelten Werte bei niedrigen und hohen Werten nicht hinreichend reproduzierbar sind.
Jedes der vorgenannten Verfahren (a) bis (c) verwendet Acetylcholin als ein Substrat, und im Falle dieser Verfahren verursacht das Substrat selbst ebenfalls Nachteile, weil Acetylcholin dazu neigt, nicht-enzymatische Hydrolysereaktionen einzugehen, und keine hohe Substratspezifizität aufweist.
Das Thiocholin-Verfahren (d) ist insofern vorteilhaft, als es z. B. eine ausgezeichnete Reaktivität und eine hohe Empfindlichkeit aufweist, einfache Arbeitsabläufe beinhaltet, viele Proben gehandhabt werden können und es ermöglicht, Bestimmungen auch bei einer Anfangsgeschwindigkeit durchzuführen. Es wird jedoch wegen der Gelbfärbung ernsthaft durch Bilirubin im Serum beeinträchtigt und unvermeidbar beeinträchtigt durch Verbindungen mit einer Thiolgruppe, wie Glutathion. Weiterhin ist es insofern nachteilig, als das Substrat selbst instabil ist. Diese Nachteile sind verantwortlich für die Fehlerhaftigkeit der erhaltenen Werte.
Im enzymatischen Verfahren (e) gibt es, da die Färbung rot ist, keine Interferenz durch Bilirubin im Serum, und es können viele Proben gehandhabt werden. Da Phenol oder 4-Aminoantipyrin als Reagenzien für das Farbgebungssystem verwendet werden, wird ChE jedoch kompetitiv inhibiert und die Menge dieser verwendeten Ragenzien ist stark eingeschränkt, so daß eine hinreichende Farbbildung schwierig ist. Außerdem wird in diesem enzymatischen Verfahren Wasserstoffperoxid verwendet. Im allgemeinen wird eine Bestimmungsmethode unter Verwendung von Wasserstoffperoxid nicht nur durch Bilirubin im Serum, reduzierende Substanzen, wie Ascorbinsäure und dergleichen, sondern auch durch Cholin, das durch Zersetzung von Phospholipiden oder dergleichen gebildet wird, unvermeidbar beeinträchtigt. Insbesondere schließt die Verwendung von Benzoylcholin als ein Substrat verschiedene Probleme ein, z. B. dessen nicht-enzymatische Hydrolyse, die Probleme verursacht.
Im UV-Verfahren (f), einer Methode nach W. Kalow, wird Benzoylcholin als Substrat eingesetzt, und es wird die Mengenabnahme des Substrates direkt gemessen. Demzufolge ist das Prinzip dieser Bestimmungsmethode einfach. Dieses Verfahren ist jedoch insofern nachteilig, als beispielsweise, da die Bestimmungswellenlänge 240 nm ist, eine Neigung besteht, daß Interferenz durch Serumkomponenten auftritt. Auch kann die Reaktion nicht im optimalen pH-Bereich von ChE durchgeführt werden, da eine Neigung besteht, daß nicht-enzymatische Hydrolyse von Benzylcholin eintritt. Ebenso ist es insofern nachteilig, als z. B. bezüglich der Bestimmungswellenlänge eine Wellenlänge im Steigungsbereich des Absorptionsspektrums des Substrates verwendet wird, was zu einer großen Abweichung des Absorptionskoeffizienten wegen der Wellenlängenabweichung führt.
Das UV-Verfahren, das p-Hydroxybenzoylcholin als Substrat verwendet, ist ein ausgezeichnetes Verfahren zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit, welches es ermöglicht, die Reaktion im optimalen pH-Bereich durchzuführen, es erlaubt, die Mängel des Wasserstoffperoxid-Färbungssystems zu beseitigen, namentlich die Beseitigung des Einflusses von Bilirubin, reduzierender Substanzen, wie Ascorbinsäure und dergleichen, als auch der Interferenz durch Cholin, das durch Zersetzung von Phospholipiden gebildet wird, welches frei ist von den Mängeln des Thiocholin-Verfahrens und in einem Autoanalyzer, in dem viele Proben gehandhabt werden können, anwendbar ist. Da jedoch NADPH, das verwendete Koenzym, ein teures Reagens und nur wenig stabil ist, ist es schwierig, das Koenzym unter einer definierten Qualität zu halten. Ferner werden bei dieser Bestimmungsmethode p-Hydroxybenzoat-Hydroxylase, Proto-catechuat-3,4-Dioxygenase oder dergleichen als Enzymreagens verwendet, deshalb treten viele Faktoren ein, die Fehler der ermittelten Werte erzeugen.
Wie vorstehend dargelegt, beinhalten die herkömmlichen Verfahren zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit verschiedene Probleme und verursachen Fehler der ermittelten Werte.
Wir haben Forschungen unternommen, um die Mängel der herkömmlichen Bestimmungsmethoden der ChE-Wirksamkeit zu beseitigen und haben die vorliegende Erfindung vollendet. Anders ausgedrückt, haben die hier auftretenden Erfinder 6-Acetoxymethyl-2-naphthoylcholinjodid (nachfolgend bezeichnet als AMNCI) synthetisiert, welches eine neue chemische Verbindung ist, und als ein Ergebnis von Forschungen auf dem Gebiet der Bestimmung der ChE-Wirkksamkeit durch ein UV-Verfahren, das diese Verbindung als Substrat verwendet, wurden die folgenden Tatsachen herausgefunden. Es kann eine Wellenlänge von ungefähr 335 bis ungefähr 355 nm als die Bestimmungswellenlänge verwendet werden, außerdem ist das Verfahren sehr stabil gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse und reagiert spezifisch mit ChE im Serum, insbesondere mit pseudo-Cholinesterase. Deshalb erlaubt die Verwendung von AMNCI die sehr genaue und in hohem Maße reproduzierbare Bestimmung der ChE-Wirksamkeit im Serum, was auch noch verschiedene andere Vorteile mit sich bringt. Auf der Grundlage der vorgenannten Erkenntnisse ist die vorliegende Erfindung vollendet worden.
Die Erfindung ist auf ein neues Cholinderivat, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), und auf ein Verfahren zur Bestimmung der Cholinesterase-Wirksamkeit gerichtet, dadurch gekennzeichnet, daß man das genannte neue Cholinderivat der allgemeinen Formel (I) als Substrat verwendet,
worin X ein Halogenatom ist.
X in der allgemeinen Formel (I) ist ein Halogenatom, wie Jod, Chlor, Brom oder Fluor.
Fig. 1 zeigt UV-Spektren von AMNCI (a) (Konzentration: 10 µM) und von 6-Acetoxymethyl-2-naphthoesäure (b) (Konzentration: 10 µM), gemessen in einem 250 mM Tris-Maleinsäure-Puffer (pH 8,0, 25°C).
Fig. 2 zeigt ein IR-Spektrum von AMNCI.
Fig. 3 zeigt den Zeitverlauf der ChE-Wirksamkeit im Serum durch die Verwendung von AMNCI als Substrat.
Fig. 4 ist ein Diagramm, das den optimalen pH von ChE zeigt.
Fig. 5 ist ein Diagrann, daß die Wirkung der Pufferkonzentration auf die ChE-Wirksamkeit zeigt.
Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Stabilität von AMNCI gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse zeigt.
Fig. 7 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Serumverdünnung und der ChE-Wirksamkeit zeigt.
Fig. 8 zeigt eine S-V-Kurve und eine Lineweaver-Burk- Auftragung.
Das neue Cholinderivat der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, indem man 2,6-Dimethylnaphthoylcarboxylat reduziert, um 6-Hydroxymethylnaphthoesäure zu erhalten, die Hydroxygruppe der 6-Hydroxymethylgruppe der so erhaltenen Verbindung acetyliert, die acethylierte Verbindung mit 2-Dimethylaminoethanol umsetzt und dann die sich ergebende Verbindung mit Methylhalogenid, wie Methyljodid und dergleichen, zur Reaktion bringt.
Die Bestimmungsmethode der ChE-Wirksamkeit unter Verwendung des neuen Cholinderivates (AMNCI) der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend erläutert.
Die UV-Spektren von AMNCI (a) und 6-Acetoxymethyl-2- naphthoesäure (b) sind in Fig. 1 gezeigt. Durch Hydrolyse durch die Wirkung von ChE ergibt AMNCI Cholin und 6-Acetoxymethyl-2-naphtoesäure. Cholin weist keine UV-Absorption bei einer Wellenlänge länger als 300 nm auf. 6-Acetoxymethyl-2-naphtoesäure weist fast keine UV-Absorption bei einer Wellenlänge länger als 335 nm auf. Andererseits weist AMNCI eine UV-Absorption bei einer Wellenlänge kürzer als 355 nm auf. Deshalb tritt, wenn AMNCI als Substrat zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit verwendet und die Reaktion bei einer Wellenlänge von 335 bis 355 nm verfolgt werden, keine ernsthafte Interferenz durch Serumkomponenten auf. Deshalb kann eine Mengenabnahme des Substrates AMNCI genau bestimmt werden, so daß die ChE-Wirksamkeit genau ermittelt werden kann. AMNCI weist auch noch viele andere Vorteile auf, wie nachfolgend beschrieben wird.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit unter Verwendung des neuen Cholinderviates der allgemeinen Formel (I) bereitgestellt, wobei eine Probe, enthaltend ChE, mit dem durch die allgemeine Formel (I) dargestellten neuen Cholinderivat gemischt und dann die optische Absorption, insbesondere bei einer Wellenlänge von ungefähr 335 bis ungefähr 355 nm, gemessen werden.
In dem UV-Verfahren nach W. Kalow ist, wie bereits vorstehend erwähnt, die Bestimmungswellenlänge 240 nm, deshalbt tritt ernsthafte Interferenz durch Blutkomponenten bei den anfänglichen Absorptionen auf. Andererseits tritt bei der Bestimmungswellenlänge von ungefähr 335 bis ungefähr 355 nm für das erfindungsgemäß verwendete Substrat keine bedeutende Interferenz auf, so daß die ChE-Wirksamkeit unter optimalen Bestimmungsbedingungen ermittelt werden kann. In dem UV-Verfahren nach W. Kalow hat das als Substrat verwendete Benzoylcholin in 1/15 M Phosphatpuffer (pH 7,40) ein Absorptionsmaximum nahe 230 nm, und die Absorptionskurve weist einen Steigungsbereich bei der Bestimmungswellenlänge von 240 nm auf. Deshalb ist die Abweichung des Absorptionskoeffizienten wegen der Abweichung der Wellenlänge groß. Das neue Substrat AMNCI hat ein Absorptionsmaximum nahe 335 nm, wobei diese Tatsache es ermöglicht, die Bestimmungswellenlänge bei einem Absorptionspeak festzulegen. Dies legt nahe, daß die Differenz beim Absorptionskoeffizienten, die durch das Problem geringerer Genauigkeit der Bestimmungswellenlänge des Analyzers hervorgerufen wird, sehr klein und die Diferenz bei den gemessenen Werten in unterschiedlichen Geräten ebenfalls klein werden.
Darüber hinaus kann die Enzymreaktion, da Benzoylcholin bei Konzentrationen von 50 µM oder mehr Substratinhibierung erfährt, nicht bei hohen Substratkonzentrationen durchgeführt werden, was zu einem engen Bereich der Linearität des Zeitverlaufs in den Absorptionskurven führt, so daß die Bestimmung nicht bis zu hohen Einheiten der ChE-Wirksamkeit durchgeführt werden kann. Im Gegensatz dazu erfährt das neue Substrat der vorliegenden Erfindung bis zu Substratkonzentrationen von 300 µM keine Substratinhibierung, und deshalb kann die Reaktion bei hohen Substratkonzentrationen im Reaktionssystem ausgeführt werden (siehe Fig. 8).
Ferner ist das neue Substrat AMNCI sehr stabil gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse. Beispielsweise trat in einem 250 mM Tris-Maleinsäure-Puffer, pH 8,0, bei 37°C 60 Minuten lang kaum Hydrolyse ein (siehe Fig. 6). Dieses Ergebnis zeigt, daß nicht-enzymatische Hydrolyse bei der Bestimmung vernachlässigbar ist und die ChE-Wirksamkeit sehr genau bestimmt werden kann.
Als Puffer, um den pH des Reaktionssystems konstant zu halten, können Barbiturate, Phosphate, Pyrophosphate, Glycin, Glycylglycin, Tris(hydroxymethyl)aminomethan usw. verwendet werden. Jeder andere Puffer kann auch verwendet werden, solange er seine Pufferkapazität im pH-Bereich von 7,5 bis 10,0 aufrecht erhalten kann.
Die Michaelis-Konstante (Km-Wert) von AMNCI für ChE ist im wesentlichen dieselbe wie die von Benzoylcholin und beträgt ungefähr 5×10-5 (1/20×10-3) Mol/l in einem 250 mM Tris-Maleinsäure-Puffer (pH 8,0) (siehe Fig. 8). Der Km-Wert von AMNCI ist klein genug, um die Reaktion bei einer hohen Substratkonzentration im Reaktionssystem der Bestimmungsmethode der vorliegenden Erfindung durchzuführen, und der Bereich der Linearität von Absorption und Zeit wird vergrößert, so daß die Bestimmung für hohe Einheiten der ChE-Wirksamkeit in hinreichendem Maße durchgeführt werden kann.
Wenn AMNCI als Substrat verwendet wird, liegt der optimale pH von ChE in einem 250 mM Tris-Maleinsäure-Puffer nahe 8,0 (siehe Fig. 4). Wie bereits vorstehend ausgeführt, ist AMNCI bie pH 8,0 stabil gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse, deshalb macht es die Bestimmungsmethode der vorliegenden Erfindung möglich, die Enzymreaktion am pH-Optimum von ChE durchzuführen.
Als Cholinesterasen sind zwei Arten bekannt, nämlich pseudo-ChE, das in Serum vorkommt, und echtes ChE, das in Erythrocyten vorkommt. Die Cholinesterase, deren Wirksamkeit üblicherweise in einer klinischer Untersuchung bestimmt wird, ist pseudo-ChE in Serum. Da aber Serum mit echtem ChE in einigen Fällen kontaminiert ist, wird ein Substrat bevorzugt, das selektiv mit pseudo-ChE alleine reagiert. Das in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete AMNCI ist ein Substrat mit sehr hoher Spezifität, das gut mit pseudo-ChE, jedoch kaum mit echtem ChE reagiert.
Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit werden im einzelnen in den nachfolgend beschriebenen Beispielen gezeigt und die Maßnahmen, die in einem herkömmlichen UV-Verfahren angewandt werden, können auch in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit ist frei von den verschiedenen Problemen der herkömmlichen Verfahren. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend beschrieben.
  • (1) Der Reaktionsmechanismus des Bestimmungssystems ist einfach und klar, und es treten nur sehr wenige Fehlerquellen bei den erhaltenen Werten auf.
  • (2) Die Bestimmung kann bei der Wellenlänge einer Spitze der Absorptionskurve (335 nm) durchgeführt werden.
  • (3) Da das in der Erfindung als Substrat verwendete AMNCI stabil gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse ist, ist die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Werte sehr hoch.
  • (4) AMNCI hat eine hohe Substratspezifität für peudo-ChE.
  • (5) Da es unnötig ist, eine Blindprobe für jede Probe einzusetzen, kann die Bestimmung einfach und schnell durchgeführt werden, so daß viele Proben auf einmal gehandhabt werden können.
  • (6) Da AMNCI stabil ist, kann die Enzymreaktion am pH-Optimum (8,0 bis 8,2) für ChE durchgeführt werden.
  • (7) Da AMNCI keine Substratinhibierung erfährt, kann die Reaktion bei hohen Substratkonzentrationen durchgeführt werden.
  • (8) Die Bestimmung ist möglich bis zu hohen Einheiten der ChE-Wirksamkeit.
Wie bereits festgestellt, ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit frei von den Mängeln der herkömmlichen Verfahren, weist viele Vorteile und Charakteristika auf, erlaubt genaue und einfache Bestimmung der ChE-Wirksamkeit und kann die Bestimmung der ChE-Wirksamkeit in täglichen klinischen Untersuchungen bedeutend erleichtern. Demgemäß stellt das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit eine nützliche Bestimmungsmethode der ChE-Wirksamkeit im Serum von normalen Personen, von Patienten mit Lebererkrankung, von Patienten mit Nierenerkrankung usw. dar.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend detaillierter mit Bezug auf die Beispiele, die keine Einschränkung darstellen, sondern der Verdeutlichung dienen, weiter erläutert.
Beispiel 1 Synthese von 6-Acetoxymethyl-2-naphthoyl-cholinjodid (AMNCI)
Eine Lösung von 21,6 g 2,6-Naphthalindicarbonsäure und 28,5 g Thionylchlorid in 200 ml trockenem Benzol, enthaltend einen Tropfen Pyridin, wurde 2 Stunden lang am Rückfluß gehalten, wonach das Lösungsmittel eingeengt wurde, um 23 g 2,6-Naphthoyldichlorid zu erhalten. Diese Substanz wurde in 500 ml trockenem Methanol 2 Stunden lang am Rückfluß gehalten, die entstehenden Fällungen wurden durch Filtration gesammelt, um 19 g 2,6-Dimethylnaphthalindicarboxylat zu erhalten. Dieses Produkt wurde in 500 ml 50%igem Ethanol suspendiert, worauf 30 g NaBH₄ zugegeben wurden, und es wurde die Reduktion durchgeführt, um 12 g 6-Hydroxymethyl-2-naphthoesäure zu erhalten. Zu dieser Substanz wurden 11,9 ml Essigsäureanhydrid und 1 Tropfen konz. Schwefelsäure zugegeben. Die entstehende Mischung wurde 30 Minuten lang am Rückfluß gehalten, um 10 g 6-Acetoxymethyl-2-naphthoesäure zu erhalten, Schmelzpunkt: 180 bis 190°C.
Elementaranalyse für C₁₄H₁₂O₄ (M. W. 244,250)
Gefunden (%):
C 69,03; H 4,83.
Berechnet (%):
C 68,85; H 4,95.
Eine Lösung von 8,4 g 6-Acetoxymethyl-2-naphthoesäure in 150 ml trockenem Toluol, enthaltend 5,4 ml Thionylchlorid und 1 Tropfen Pyridin, wurde 30 Minuten lang am Rückfluß gehalten, abgekühlt und dann die sich ergebende Mischung filtriert. Das Lösungsmittel des Filtrates wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, um 8,5 g 6-Acetoxymethyl-2-naphthoylchlorid zu erhalten. Diese Substanz wurde in 50 ml trockenem Toluol gelöst und die sich ergebende Lösung wurde tropfenweise zu einer Lösung von 7 ml 2-Dimethylaminoethanol in 150 ml trockenem Toluol unter Kühlung auf 5 bis 10°C gegeben. Danach wurde die entstandene Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Wasser und dann mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Die Toluolphase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert, um 8,5 g einer öligen Substanz zu erhalten. Diese Substanz wurde in 200 ml Aceton gelöst, worauf eine Lösung von 3,7 g Methyljodid in 50 ml Ethylacetat zugefügt wurde. Die Lösung wird unter Kühlen stehen gelassen, wonach die ausgefällten Kristalle durch Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen und dann im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet wurden, um 10,2 g 6-Acetoxymethyl-2-naphthoylcholin­ jodid (AMNCI) zu erhalten, Schmelzpunkt: 182 bis 184°C. Diese Kristalle ergaben einen einzigen Fleck (Rf=0,36) in einer Silicagel-Dünnschichtchromatografie (n-Butanol: Essigsäure : Wasser=4 : 1 : 2).
Elementaranalyse für C₁₉H₂₄NO₄I (M. W. 457,312)
Gefunden (%):
C 49,72; H 5,36; N 3,06.
Berechnet (%):
C 49,90; H 5,29; N 3,06.
UV-Spektrum und IR-Spektrum des synthetisierten Produktes sind in Fig. 1 bzw. 2 gezeigt.
Beispiel 2 Verfahren zur Bestimmung der ChE-Wirksamkeit im Serum
  • (1) ein 250 mM Tris-Maleinsäure-Puffer, pH 8,0 (25°C).
  • (2) eine Probe
  • (3) eine 1,3 mM wäßrige Substratlösung (AMNCI)
Zu 2,0 ml des Puffers (1) wurden 0,10 ml der Probe gegeben, und es wurde eine Vorerwärmung bei 37°C ungefähr 2 bis 10 Minuten lang durchgeführt. Es wurden 0,5 ml der Substratlösung (3) zugefügt, wobei gleichzeitig eine Stoppuhr gestartet wurde, und dann wurde nach genau 20 und 80 Sekunden die optische Absorption bei einer Wellenlänge von 335 nm bestimmt, um die Veränderung der optischen Absorption pro Minute zu ermitteln. Fig. 3 zeigt den Zeitverlauf.
Als die Probe (Serum) wurde Consera I (hergestellt von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) verwendet. Der Wert der ChE-Wirksamkeit wird aus der folgenden Gleichung berechnet:
  • (1) Δ O. D. ist die Änderung der optischen Absorption pro Minute bei einer Wellenlänge von 335 nm.
  • (2) Der molekulare Absorptionskoeffizient bei 335 nm beträgt 1195.
Aus der obigen Gleichung wurde das verwendete Serum mit 461 (IE/l) Einheiten ermittelt. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde Linearität ohne Zeitverschiebung beim Zeitverlauf bis zu 7 Minuten bei 690 (IE/l) ChE-Einheiten beobachtet. Diese Tatsache zeigt an, daß Autoanalyzer eingesetzt werden können.
Beispiel 3
Der pH des Puffers (1) in Beispiel 2 wurde von 7,6 bis 8,4 verändert, und das pH-Optimum für ChE wurde im genannten Verfahren bestimmt. Diese Bestimmung wurde in vollem Umfang gemäß Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme des pH′s des Puffers. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Unter diesen Bedingungen betrug der optimale pH 8,0.
Beispiel 4
Die Konzentration des Puffers (1) in Beispiel 2 wurde von 50 bis 300 mM variiert, und die optimale Konzentration des Puffers wurde im genannten Verfahren bestimmt. Die Bestimmung wurde in vollem Umfang gemäß Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme der Konzentration des Puffers. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Unter diesen Bedingungen betrug die optimale Konzentration des Puffers 200 bis 300 mM.
Beispiel 5
Zu den 2,0 ml Puffer (2) in Beispiel 2 wurden 0,5 ml Substratlösung (3) zugefügt und die entstehende Lösung wurde in eine wärmeisolierende Küvette mit einer Temperatur von 37°C gegeben. Die Änderung der optischen Absorption bei einer Wellenlänge von 335 nm wurde in Abhängigkeit der Zeit verfolgt, wobei die Stabilität des Substrates gegenüber nicht-enzymatischer Hydrolyse untersucht wurde. Als Ergebnis war das Substrat bis zu 60 Minuten nahezu stabil, wie in Fig. 6 gezeigt. Da das Substrat AMNCI stabil beim pH-Optimum von 8,0 ist, ist es unnötig, einen Reagens-Blindwert für jede Probe zu ermitteln.
Beispiel 6
Die Substratspezifität wurde gemäß dem Bestimmungsverfahren in Beispiel 2 untersucht. Als Probe wurden pseudo-ChE (hergestellt von Sigma), 10 E/ml, und echtes ChE (hergestellt von Sigma), 10 E/ml, eingesetzt. Die Abnahmegeschwindigkeit der optischen Absorption (Detla E/Min.) betrug 0,0470 für pseudo-ChE bzw. 0,0005 für echtes ChE. Das Reaktivitätsverhältnis von pseudo-ChE zu echtem ChE, erhalten aus der Abnahmegeschwindigkeit der optischen Absorption, war ungefähr 1 : 0,01. Diese Tatsache zeigt, daß die Substratspezifität von AMNCI sehr hoch ist.
Beispiel 7
Die Beziehung zwischen der Verdünnung des Serums und der ChE-Wirksamkeit wurde gemäß Beispiel 2 untersucht. Das Serum wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung, enthaltend 5% Albumin, verdünnt. Wie in Fig. 7 gezeigt, sind Serum-Verdünnung und ChE-Wirksamkeit proportional, und zwar gemäß einer Geraden, die durch den Null-Punkt geht. Diese Tatsache macht deutlich, daß die ChE-Wirksamkeit in weitem Maße von niedrigen bis zu hohen Einheiten bestimmt werden kann.
Beispiel 8
Die Substratlösungen (3) in Beispiel 2 wurden in geeigneter Weise als verdünnte Lösungen verwendet, aus diesen Lösungen wurde eine Lineweaver-Burk-Auftragung erhalten. Der Km-Wert für das Substrat der vorliegenden Erfindung wurde mit 5×10-5 Mol/l aus dieser Auftragung berechnet (siehe Fig. 8). Aus dieser Tatsache geht deutlich hervor, daß das Substrat der vorliegenden Erfindung hohe Affinität zu ChE aufweist und eine hinreichende Anwendbarkeit für dieses Reaktionssystem besitzt.

Claims (4)

1. Neues Cholinderivat, dargestellt durch die allgemeine Formel (I) worin X ein Halogenatom ist.
2. Verfahren zur Bestimmung der Cholinesterase-Wirksamkeit, wobei eine Probe, enthaltend Cholinesterase, mit einem Substrat gemischt wird, und zwar mit dem neuen Cholinderivat, dargestellt durch die allgemeine Formel (I) worin X ein Halogenatom ist, und wobei die optische Absorption des Reaktionsproduktes davon gemessen wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat 6-Acetoxymethyl-2-naphthoylcholinjodid ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Absorption bei einer Wellenlänge von ungefähr 335 bis ungefähr 355 nm gemessen wird.
DE3905861A 1988-02-24 1989-02-24 Neues cholinderivat und verfahren zur bestimmung von serum-cholinesterase-wirksamkeit unter verwendung desselben Granted DE3905861A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP63041375A JPH0662521B2 (ja) 1988-02-24 1988-02-24 新規コリン誘導体及びそれを用いた血清コリンエステラーゼ活性測定法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3905861A1 true DE3905861A1 (de) 1989-08-31
DE3905861C2 DE3905861C2 (de) 1992-01-30

Family

ID=12606666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3905861A Granted DE3905861A1 (de) 1988-02-24 1989-02-24 Neues cholinderivat und verfahren zur bestimmung von serum-cholinesterase-wirksamkeit unter verwendung desselben

Country Status (3)

Country Link
US (1) US4983756A (de)
JP (1) JPH0662521B2 (de)
DE (1) DE3905861A1 (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5536591A (en) 1990-04-26 1996-07-16 Ovonic Battery Company, Inc. Electrochemical hydrogen storage alloys for nickel metal hydride batteries
JPH11228587A (ja) * 1998-02-12 1999-08-24 Nippon Chem Ind Co Ltd 光学活性なホスフィンオキシドカルボン酸及びその製造方法
EP1133571B1 (de) * 1998-11-23 2006-06-28 Proteome Sciences, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur schmerzbehandlung
US20070287991A1 (en) * 2006-06-08 2007-12-13 Mckay William F Devices and methods for detection of markers of axial pain with or without radiculopathy

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL142872C (de) * 1963-03-28
JPS5337696A (en) * 1976-08-26 1978-04-06 Omnium Chimique Sa Hexahydrocantinonee6 derivative
GB2096989B (en) * 1978-04-17 1983-04-20 Kyowa Hakko Kogyo Kk Choline derivatives and a process for their preparation
IT1156840B (it) * 1978-06-27 1987-02-04 Sigma Tau Ind Farmaceuti Acil derivati della carnitina
JPS5935599B2 (ja) * 1980-12-25 1984-08-29 株式会社 シノテスト研究所 コリンエステラ−ゼ活性測定法
US4582855A (en) * 1981-11-12 1986-04-15 American Hospital Supply Corporation Aromatic and esters of hydroxypropylamines
JPH0236237B2 (ja) * 1982-01-26 1990-08-16 Toyo Boseki Pphidorokishiansokukosansokuteiyoshakusoseibutsu
JPS58170744A (ja) * 1982-03-31 1983-10-07 Sagami Chem Res Center 光学活性な１−（６−メトキシ−２−ナフチル）−２−（アルコキシカルボニル）アミノ−１−プロパノン
JPS6452742A (en) * 1987-04-27 1989-02-28 Syntex Pharma Int Omega-quaternary ammonium alkyl ester and thioester of acidic non-steroidal antiinflammatory
JPH0796529B2 (ja) * 1987-07-27 1995-10-18 三井東圧化学株式会社 光学活性化合物

Also Published As

Publication number Publication date
DE3905861C2 (de) 1992-01-30
US4983756A (en) 1991-01-08
JPH01216964A (ja) 1989-08-30
JPH0662521B2 (ja) 1994-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0431456B1 (de) Verwendung eines schwer löslichen Salzes einer Heteropolysäure zur Bestimmung eines Analyts, entsprechendes Bestimmungsverfahren sowie hierfür geeignetes Mittel
US4260679A (en) Method and reagent for the quantitative determination of hydrogen peroxide and precursors thereof
EP0114267B1 (de) Testsystem und Verfahren zur Bestimmung von NAD(P)H
DE2920292C3 (de) L-γ -Glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid und dessen Säureadditions- oder Alkalisalze, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von γ-Glutamyltranspeptidase
DE3851265T2 (de) Hydrolysierbare Verbindungen, die elektronübertragende Mittel freigeben und ihre analytische Verwendung.
DE2847202A1 (de) Verfahren zur bestimmung von triglyceriden
DE2833612B2 (de) Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd
DE3003490A1 (de) Reagenz zur analytischen bestimmung von wasserstoffperoxid
EP0748866B1 (de) Verfahren und Mittel zur gleichzeitigen kolorimetrischen und elektrochemischen Messung eines Analyten
DE3780205T2 (de) Verfahren zur messung von lipidgebundener sialinsaeure und dabei zu verwendender reagenssatz.
DE2818603A1 (de) Kinetisches glucosereagens und dessen verwendung in einem kinetischen nachweisverfahren
DE1959410B2 (de) Indikator zur bestimmung der reduzierten pyridincoenzyme
EP0008342A1 (de) Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Glutamat-oxalacetat-transaminase und Glutamat-pyruvat-transaminase
DE3905861C2 (de)
DE2914721A1 (de) Verfahren zur bestimmung der cholinesterase-aktivitaet sowie fuer dieses verfahren verwendbare cholin-derivate
DE69124780T2 (de) Oxidierbares, farbproduzierendes Reagenz
DE2509156A1 (de) Verfahren zur bestimmung der cholesteringesamtmenge in einer serumprobe und einzelreagens zur durchfuehrung dieses verfahrens
DE3780201T2 (de)
DE68912054T2 (de) Phosphorsäure-Derivate und Verfahren zur Bestimmung der Säure-Phosphatase-Aktivität unter Verwendung derselben.
EP0067234A1 (de) Verfahren zur aktivitätsbestimmung von cholinesterase
DE69128873T2 (de) Verfahren zur enzymatischen Messung von Wasserstoffperoxid und Reagenz dafür
EP0217371A2 (de) Phosphate von Resorufin-Derivaten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von Phosphatasen
DE3301470C2 (de)
DE3889845T2 (de) Verfahren zur Massanalyse von Wasserstoff-Peroxyd und Reagens dafür.
DE3150416C2 (de) Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Aktivität von Angiotensin-konvertierendem Enzym

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition