DE2740957C2

DE2740957C2 -

Info

Publication number: DE2740957C2
Application number: DE19772740957
Authority: DE
Inventors: Ivan Endre Camarillo Calif. Us Modrovich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-09-13
Filing date: 1977-09-12
Publication date: 1987-07-30
Also published as: SE7711853L; JPS5843078B2; DE2740957A1; GB1570971A; CH631208A5; FR2364457B1; CA1102225A; FR2364457A1; JPS5352685A; JPH0147999B2; SE446742B; JPS60105494A

Description

Die Erfindung betrifft ein stabilisiertes flüssiges Präparat für biologische diagnostische Bestimmungen, das in einem wäßrigen Träger ein oder mehrere Enzyme und ein oder mehrere Coenzyme und ein organisches Stabilisierungsmittel sowie einen oder mehrere Puffer zur Einstellung des pH enthält.

Aus der DE-OS 20 51 714 ist ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Glucose bekannt, das darin besteht, daß man die Glucose enthaltende Probe mit einer Lösung, die Hexokinase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Adenosin-5-triphosphat und Nikotinamid-adenin-dinucleotid- phosphat, einen chromogenen Elektronenakzeptor und einen Zwischenelektronenträger enthält, inkubiert und die optische Dichte der entstehenden Lösung bestimmt. Um die Lagerung und das Handhaben der Lösung zu erleichtern, wird empfohlen, sie zu lyophilisieren oder alle Bestandteile in der Form von Kapseln oder Tabletten aufzubewahren und vor der Verwendung mit Wasser zu rekonstituieren. D. h. diese Enzyme und Coenzyme enthaltende Lösung ist für sich nicht ausreichend lagerungsstabil.

Aus der DE-AS 20 61 984 ist ein Reagenz für die Bestimmung von Lactat-dehydrogenase bekannt. Das verwendete Reagenz enthält das Coenzym Nikotinamid-dinucleotid, das Enzym Diaphorase und als Stabilisatoren etwa 3 bis etwa 20% Saccharose und etwa 0,1 bis 3% Azid. Es wird gesagt, daß diese Reagenz eine überlegene Haltbarkeit besitzt. Die in den Tabellen aufgeführten Werte lassen erkennen, daß der NAD-Gehalt bei einer Lagerung bei +4°C innerhalb 27 Tagen von 5,12 auf nur 5,0 mg/ml absinkt, während im gleichen Zeitraum jedoch der Gehalt an Herz-Diaphorase von 1,25 auf 1,14 IE/ml absinkt. Auch wenn dieses Reagenz lyophilisiert und das Lyophilisat gelagert und vor dem Test in destilliertem Wasser gelöst wurde, zeigte sich, daß die Aktivität der Diaphorase innerhalb von 65 Tagen Lagerung bei 33°C von 1,0 bis 1,1 IU auf 0,75 bis 0,83 abgesunken war.

Aus der US-PS 32 96 094 ist es bekannt, Glycerin zusammen mit teilhydrolysiertem Collagen (Gelatine) zu verwenden, um Papain in wäßriger Lösung, jedoch in Abwesenheit von Coenzymen, zu stabilisieren. Papain ist aber ein besonders thermostabiles Enzym, das wie in dieser US-PS 32 96 094 in Spalte 1, Zeilen 20-22, ausgeführt, während der Lagerung auch in Abwesenheit von Glycerin nur allmählich seine proteolytische Aktivität verliert.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein stabilisiertes flüssiges Präparat für biologische diagnostische Bestimmungen zu schaffen, das in einem wäßrigen Träger ein oder mehrere Enzyme und ein oder mehrere Coenzyme und ein organisches Stabilisierungsmittel sowie einen oder mehrere Puffer zur Einstellung des pH enthält, besonders stabil und einfach anzuwenden ist.

Diese Aufgabe wird durch das stabilisierte flüssige Präparat gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Die Ansprüche 2 bis 5 nennen Ausgestaltungen der Erfindung. Im Anspruch 6 ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Präparats zur Bestimmung von Glukose angegeben.

Die Präparate gemäß der Erfindung können in der klinischen Diagnostik beispielsweise für die Bestimmung der folgenden Bestandteile biologischer Flüssigkeiten verwendet werden.

1. Glutamat-oxalacetat-transaminase (SGOT)
2. Glutamat-pyruvat-transaminase (SGPT)
3. Lactat-dehydrogenase (LDH-P)
4. Lactat-dehydrogenase (LDH-L)
5. Creatin-phosphokinase (CPK)
6. α -Hydroxybutyrat-dehydrogenase ( α -HBD)
7. Glucose (via Hexokinase-G-6-PDH)

Die oben genannten Reagenzien reagieren oft in gleicher Weise, und einige der ablaufenden chemischen Reaktionen sind gleich. Das folgende Reaktionsschema soll die Art der ablaufenden Umsetzungen veranschaulichen:

Reaktionsschema 1 - Allgemeines Modell

Gemäß der Erfindung verlaufen alle obigen enzymatischen Reaktionen nach diesem allgemeinen Schema, wobei die Reaktion (2) gewöhnlich als Kupplungsreaktion, die Reaktionen (2) oder (3) als Meßreaktionen und die Reaktion (1) als Primärreaktion bezeichnet werden können. Für eine Messung sind jedoch nicht alle drei Umsetzungen erforderlich; es können vielmehr eine oder zwei davon ausreichend sein. Im Falle der Messung der Lactat-dehydrogenase- (LD)-Aktivität erfolgt nur die Umsetzung (2):

Reaktionsschema 2 - LDH

Umgekehrt können auch mehr als die drei oben aufgeführten Reaktionen erfolgen, wie im Falle der Creatin-phosphokinase (CPK):

Reaktionsschema 3 - CPK

Symbole:

CP= Creatin-phosphat CPK= Creatin-phosphokinase ADP= Adenosin-5′-diphosphat AM= Adenosin-monophosphat ATP= Adenosin-triphosphat HK= Hexokinase NAD= Nikotinamid-adenin-dinukleotid NADP= Nikotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat NADH₂= Nikoinamid-adenin-dinukleotid, reduziert GLDH= Glutamat-dehydrogenase G-6-PDH= Glucose-6-phosphat-dehydrogenase G-6-P= Glucose-6-phosphat INT= Tetrazoliumsalz PEP= Phosphoenol-pyruvat PMS= Phenazin-methosulfat PK= Pyruvat-kinase

In diesem Fall können die Reaktionen (2) und (3) als Kupplungsreaktionen, die Reaktionen (3) oder (4) als Meßreaktionen und die Reaktion (1) als Primärreaktion bezeichnet werden.

Im Zusammenhang mit dem Reaktionsschema 1 - allgemeines Modell, ist bekannt, daß die Anwendung der Reaktionsfolge die quantitative analytische Bestimmung entweder der Reaktionssubstrate/Produkte oder der katalytisch wirkenden Enzyme ermöglicht.

Die quantitative Bestimmung dieser Bestandteile in biologischen Flüssigkeiten ist ein bekanntes und vielfach verwendetes diagnostisches Mittel in der Human- und Veterinärmedizin.

Enzyme sind komplexe Proteinmoleküle von hohem Molekulargewicht, deren chemische Struktur gewöhnlich unbekannt ist. Sie werden derzeit nach ihrer katalytischen Aktivität und extremen Substratspezifität klassiert. Sie können als biologische Katalysatoren, die eine Umsetzung eines bestimmten Substrats oder eine Umsetzung einer Gruppe ähnlicher Substrate zu katalysieren vermögen, definiert werden.

Koenzyme sind organische Chemikalien von niedrigerem Molekulargewicht und definierter Struktur, deren Reaktionen oder Wechselwirkungen notwendig für eine spezielle Enzymbestimmung oder -reaktion sind. Sie werden katalysiert, wobei es zu einer reversiblen Änderung der Struktur des Koenzyms und/oder seiner atomaren Zusammensetzung kommt. Koenzyme sind sehr wertvoll für klinische Bestimmungen. Einige von ihnen haben starkes Absorptionsvermögen, und ihre Reaktionen mit dem Substrat sind stöchiometrisch, so daß die Bildung oder das Verschwinden der absorbierenden Form photometrisch verfolgt werden kann. Nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) und seine reduzierte Form (NADH₂) werden in vielen wichtigen klinischen Bestimmungen, wie den oben beschriebenen S.G.O.T., S/P.G.T. und LDH Bestimmungen verwendet. NAD und NADH₂ haben ein Molekulargewicht von etwa 700 und sind sehr komplexe organische Moleküle. NADH₂ absorbiert stark bei 340 nm, während NAD bei dieser Wellenlänge nicht absorbiert.

Substrate sind organische Chemikalien bekannter Struktur, deren Reaktionen oder Wechselwirkungen durch Enzyme katalysiert werden, wobei es zu einer Veränderung der Struktur, atomaren Zusammensetzung oder stereochemischen Rotation kommt. Allgemein unterliegen Substrate leicht einem mikrobiologischen Abbau, da sie als Nahrung für Bakterien, Fungi und andere Mikroorganismen dienen. Im übrigen bleiben diese Verbindungen in wäßrigem Medium bei oder nahe neutralem pH (d. h. pH im Bereich von 4-10) stabil. Typische Substrate sind Glucose, Lactat oder Milchsäure, Gluconat und dergleichen.

Die folgenden Reaktionen veranschaulichen die Bestimmung von Glucose unter Verwendung der Koenzyme ATP und NAD:

Das Enzym, das die primäre Reaktion verursacht, ist Hexokinase, und das Enzym, das die Kupplungs- und Meßreaktion verursacht, ist G-6-PDH. Bei der obigen Reaktion wird die Glucose durch Messen des NADH, das bei der Meßreaktion gebildet wird, bestimmt. Die Reaktion wird im wesentlichen vollständig ablaufen gelassen, und die Menge an gebildetem Koenzym NADH wird im wesentlichen gemessen.

NAD ist zwar in Wasser und in trockener Form, wenn es einer feuchten Umgebung ausgesetzt ist, instabil, ist jedoch nicht annähernd so instabil wie die reduzierte Form NADH₂. Daher muß das NADH₂ frei von Feuchtigkeit gehalten werden, während das NAD mit einer wäßrigen Lösung in einem Behälter abgefüllt werden kann, sofern es gemäß der Erfindung stabilisiert ist. Die Stabilität ist bei saurem pH besser, während es bei alkalischem pH leichter zu einer Zersetzung des NAD kommt. Weder der genaue Mechanismus noch die Endprodukte sind von Bedeutung, abgesehen davon, daß das zersetzte NAD nicht mehr als Koenzym zu wirken vermag und auch nicht den Extinktionskoeffizienten bei der erforderlichen Wellenlänge hat.

Einer der Vorteile der Erfindung besteht darin, daß alle Komponenten in einer einzigen Flasche stabilisiert werden können. Bei der Herstellung eines stabilisierten Enzym- oder Koenzympräparates gibt es zwei wesentliche Gesichtspunkte. Erstens ist es wesentlich, daß das stabile Enzym oder Koenzym in einem flüssigen Medium vorliegt, und zweitens muß die Zahl der Verpackungen soweit wie möglich begrenzt sein. Bei der Stabilisierung von Koenzymen, wie NAD, wurde festgestellt, daß das NAD weit stabiler als das NADH ist. Daher ist es nicht notwendig, die komplexen Stabilisierungsmethoden, die für NADH erforderlich sind, anzuwenden, und folglich können alle Reagenzien in nur einer Lösung abgefüllt werden.

Bei der Stabilisierung der Enzyme und Koenzyme gemäß der Erfindung wird als eine Möglichkeit Gelatine in destilliertem Wasser gelöst. Die Gelatine ist vorzugsweise in der stabilisierten Lösung bis zu einer Menge, die bei Kühlschrankbedingungen ohne auszufallen in homogener Suspension bleibt, anwesend. Sie ist zweckmäßig in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 0,5% der Gesamtmasse und vorzugsweise in dem Bereich von 0,05 bis etwa 0,5% anwesend. Anstelle von Gelatine kann auch Polyvinylpyrrolidin oder Dextran verwendet werden.

Die Gelatine etc. kann durch Erwärmen, im allgemeinen auf über 30°C, in dem Wasser gelöst werden. Die Geschwindigkeit, mit der sie in Lösung geht, nimmt mit steigender Temperatur zur.

Nachdem die Gelatine etc. vollständig in Wasser gelöst ist, kann ein Azid, wie Natriumazid, vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,1% Gewicht/Gewicht, zugesetzt werden. Jedoch kann die Menge an zugesetztem Azid in dem Bereich von 0,01 bis etwa 0,5% liegen. Überraschenderweise wurde gefunden, daß das Azid die Stabilität der Enzyme erhöht, während bisher nur angenommen wurde, daß es bakteriostatisch oder als Bakterizid wirkt. Obwohl der Mechanismus der Stabilisierung durch das Azid in Kombination mit den übrigen Bestandteilen nicht vollständig geklärt ist, konnte doch festgestellt werden, daß das Azid eine solche erhöhte Stabilität ergibt. In vielen Fällen ist das Azid nicht notwendig und kann fortgelassen werden. D. h. in vielen Fällen sind die Gelatine etc. und das organische Stabilisierungsmittel (vgl. Anspruch 1) in dem wäßrigen Medium ausreichend, um die erforderliche Stabilisierung der labilen Komponenten zu bewirken. In einigen wenigen Fällen muß das Azid fortgelassen werden, da es die Stabilisierung stört oder sonst ein Substrat, beispielsweise Glucose, beträchtlich angreift.

Außer dem obigen können selbstverständlich noch andere bakterizide oder fungizide Mittel, die mit einem Substrat nicht chemisch reagieren oder die enzymatische Reaktion behindern, verwendet werden. Beispiele für solche Mittel, die außer Natriumazid verwendet werden können, sind Benzoesäure, Phenol, Thymol und Pentachlorphenol.

In manchen Fällen kann es erwünscht sein, ein Metall, wie Magnesium, das die Initiierung einer Umsetzung bei der Verwendung der stabilisierten Masse unterstützt, zu verwenden. Eines der bevorzugten Mittel für diesen Zweck ist Magnesium in der Form des Salzes Magnesiumchlorid. Dieses Mittel muß nicht in die stabilisierte Masse gemäß der Erfindung eingebracht werden und kann zur Zeit ihrer Verwendung zugesetzt werden. Dieses Mittel, das die kuppelnden Enzyme aktiviert, wird zweckmäßig in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 1% und vorzugsweise etwa 0,03% verwendet.

In diesem Stadium des Verfahrens kann die Lösung in einem Wasserbad auf etwa Raumtemperatur, wie etwa 20 bis etwa 25°C gekühlt werden. Nachdem die Lösung gekühlt ist, kann ein Puffer, wie Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, zugesetzt werden. Dieser Puffer wird zweckmäßig in einer Menge von etwa 50 mMol bis etwa 200 mMol, jedoch in ausreichender Menge, um das pH in dem Bereich von 6,0 bis etwa 8,5 zu halten, zugesetzt. Andere bekannte Puffer und andere Formen der Puffer können ebenfalls in dem Verfahren verwendet werden. In manchen Fällen können Puffersalze der im folgenden beschriebenen Art verwendet werden. Der Puffer wird in einer Menge, die notwendig ist, um das pH zwischen 6,0 und 8,5 zu halten, zugesetzt. Im allgemeinen ist der Puffer eine Kombination von 0,1 bis 1% eines Alkalihydroxids und 0,5 bis 3% eines sauren Alkalicarbonats oder -phosphats. Der Gesamtsalzgehalt beeinflußt auch die erforderliche Menge an Polymer. Bei einem hohen Salzgehalt, beispielsweise über 4 Gew.-%, ist wegen der elektrostatischen Stabilisierung durch das Salz eine geringere Menge an Gelatine etc. erforderlich. Bei höherem Salzgehalt kann jedoch die Gelatine etc. die Lösung trüben oder ausfallen, so daß die Lösung erwärmt werden muß, um das Polymer erneut aufzulösen.

Nachdem das pH der Lösung in dem gewünschten Bereich eingestellt ist, kann das erste der Koenzyme, beispielsweise das ATP oder das NAD usw., zugesetzt werden. In diesem Fall wird das ATP in einer Menge von etwa 0,3 mMol bis etwa 30 mMol, bezogen auf die Gesamtmasse, zugesetzt.

Wie erwähnt, werden Lösungen von sowohl stabilisierten Enzymen als auch stabilisierten Koenzymen hergestellt. D. h. es können auch zwei oder mehr Koenzyme und zwei oder mehr Enzyme in der gleichen Lösung stabilisiert werden. Wenn zwei oder mehr Koenzyme stabilisiert werden, so können sie allgemein entweder gleichzeitig oder in irgendeiner Reihenfolge zugesetzt werden. Das NAD wird vorzugsweise in einer Menge in dem Bereich von etwa 0,6 mMol bis etwa 60 mMol, bezogen auf die Gesamtmasse, zugesetzt.

In diesem Stadium des Verfahrens wird zweckmäßig das pH erneut auf wenigstens in den Bereich von 6,5 bis 8,0 oder bis 6,0, vorzugsweise auf 7,5, eingestellt.

Nach der Einstellung des pH kann das organische Stabilisierungsmittel, beispielsweise Glycerin (vgl. Anspruch 1) zugesetzt werden. In diesem Fall wird es in einer Menge in dem Bereich von 25 bis 40%, vorzugsweise 30%, Vol./Vol. zugesetzt. Allgemein kann die Menge an organischem Lösungsmittel in dem Bereich von etwa 5 bis 70% Vol./Vol. liegen.

Das organische Stabilisierungsmittel hat die folgenden Eigenschaften:

1. pH-Bereich 4 bis 10;
2. flüssig bei Raum- und Kühlschranktemperaturen;
3. reagiert nicht anders mit NAD oder ATP und dergleichen als durch Bildung elektrostatischer (d. h. Wasserstoff-)Bindungen;
4. mischbar mit Wasser;
5. geringere freie Standardenergie der Solvolyse (Einstellung normaler Resonanz).

Das Stabilisierungsmittel muß auch mit Wasser mischbar und bei Raum- und Kühlschranktemperaturen flüssig sein und darf nicht anders mit den reaktiven Stellen der Enzyme und Koenzyme als durch Bildung elektrostatischer Bindungen reaktiv sein, d. h. darf keinen Abbau bewirken. Flüssige Polyole mit zwei bis vier Hydroxylgruppen und zwei bis 10 Kohlenstoffatomen, wie Glycerin, Äthylenglycol, Propylenglycol und Butandiol, werden erfindungsgemäß als Stabilisierungsmittel eingesetzt. Glycerin, Propylenglycol und 1,2-Propandiol sind die Lösungsmittel der Wahl.

Wie erwähnt, muß kein Azid oder anderes bakteriostatisches Mittel verwendet werden, da das Polyol selbst als bakteriostatisches Mittel wirkt. Trotzdem ist manchmal der Zusatz eines Azids bevorzugt, da es offensichtlich die Kupplung zwischen dem Glycerin etc. und den Enzymen verbessert, obwohl das Stabilisierungsmittel und das Glycerin etc. bereits die erforderliche Stabilität in einer wäßrigen Lösung ergeben.

Nachdem das Glycerin oder ein anderes Polyol zugesetzt sind, wird das pH der so gebildeten Lösung erneut eingestellt. Typischerweise kann das pH leicht basisch sein, und daher kann HCl zugesetzt werden, um das pH einzustellen. Wenn das pH dagegen leicht sauer ist, kann eine geeignete Base zugesetzt werden, um ein pH von 7,5 einzustellen.

Wesentlich ist, daß das Koenzym NAD in Überschußmengen anwesend ist. Wie erwähnt, erfolgt die Glucosebestimmung durch Messen des NADH, das aus dem NAD gebildet wird. Das NADH ist in sauerer Umgebung instabil und wird bei einem pH von 6 und außerordentlich schnell bei einem pH von 4 abgebaut. Daher wird das pH der Lösung über dem neutralen pH von 7 gehalten. Obwohl das NAD in der sauren Umgebung stabiler ist, wurde gefunden, daß es in einer schwach basischen Umgebung mit einem pH von 7,5 nicht wesentlich abgebaut wird. Trotzdem wird das NAD in beträchtlichem Überschuß zugesetzt, so daß immer, selbst nach einigen Jahren in der flüssigen Umgebung, eine ausreichende Menge an nicht-abgebautem NAD anwesend ist.

Allgemein werden alle Koenzyme in einer Menge, die zur Durchführung der gewünschten Bestimmung wenigstens ausreichend ist, anwesend sein. Typischerweise gibt es keine maximale Menge für das anwesende Koenzym. Jedoch ist die Menge durch wirtschaftliche Erwägungen begrenzt.

Nachdem die Koenzyme der flüssigen Lösung zugesetzt sind, können die gewählten Enzyme zugesetzt werden. Wie im Falle der Koenzyme können auch die Enzyme in jeder Reihenfolge zugesetzt werden. Auch können ein oder mehrere Enzyme zugesetzt werden. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung und dem oben spezifizierten Enzymsystem sind die beiden Enzyme HK und G-6-PDH. Das HK wird vorzugsweise in einer Menge von nicht unter 111 I.E. je Liter (pH 7,6 25°C) zugesetzt. Vorzugsweise wird jedoch das HK in einer Menge von wenigstens 1000 I.E. je Liter zugesetzt.

Das G-6-PDH wird vorzugsweise von L-mesenteroiden Bakterien gebildet und in einem Bereich von etwa 100 I.E. je Liter bis etwa 30 000 I.E. je Liter oder darüber konzentriert. Vorzugsweise werden normalerweise etwa 3000 I.E. an dem G-6-PDH dieser Art bei einem pH von etwa 7,8 bei 25°C verwendet.

Die Enzyme sind zweckmäßig in einer Menge von wenigstens 100 I.E. je Liter anwesend, obwohl in den meisten derartigen Reagenzien das Enzym, beispielsweise die Hexokinase, in einer Mindestmenge von 1000 I.E. je Liter anwesend sind. In den normalen Abfüllungen des Handels ist das Enzym in einer Menge von etwa 1000 bis etwa 10 000 I.E. bei einem pH von 7,6 und einer Temperatur von etwa 25°C anwesend. Für die maximale Menge an dem Enzym gibt es keine Grenze, obwohl normalerweise für fast alle Verwendungszwecke die Menge an Enzym nicht größer ist als 10 000 I.E.

Es ist wesentlich, daß die Enzyme nach der letzten Einstellung des pH zugesetzt werden. Der Mechanismus der Stabilisierung der Enzyme und Koenzyme ist nicht vollständig geklärt. Es ist jedoch anzunehmen, daß das Lösungsmittel das Enzym in dem flüssigen Medium dadurch stabilisiert, daß es die Stelle der funktionellen Gruppe, d. h. denjenigen Teil des Moleküls, wo die Substratreaktion tatsächlich erfolgt oder katalysiert wird, abschirmt. Außerdem kann angenommen werden, daß die Stabilisierung auf einer Abschirmung der Enzyme und Koenzyme gegen mikrobielle Verunreinigung und damit Abbau beruht. Das Koenzym NAD unterscheidet sich von dem Koenzym NADH darin, daß es sich in dem Lösungsmittel, wie Propylenglycol, nicht merklich auflöst. Jedoch ist das NAD stabiler in Wasser, und das Koenzym wird offensichtlich durch das Polyol stabilisiert. Ein reines Polyol denaturiert die Enzyme; eine solche Denaturierung erfolgt jedoch nicht in einer wäßrigen Lösung, wie einem Gemisch von Wasser und Stabilisierungsmittel. Offensichtlich muß in dem organischen Stabilisierungsmittel eine polare Gruppe anwesend sein, um die aktiven Stellen der Enzyme in stabilem Zustand zu halten. Auch erfolgt in dem konzentrierten wäßrig-organischen Lösungsmittel irgendeine physikalische oder chemische Reaktion, da die Enzyme und Koenzyme ihre katalytische Aktivität behalten und bei den angegebenen Konzentrationen nicht abgebaut werden.

Außerdem scheint die Gelatine etc. in irgendeiner Weise mit dem Azid unter Ausbildung einer elektrostatischen oder kovalenten Bindung zwischen den Enzymen und dem Polymer zu reagieren. Außerdem breitet sich die Gelatine etc. offensichtlich so aus, daß es die aktiven Stellen der Enzyme einkapselt und damit abschirmt. Auf diese Weise wird eine Denaturierung oder andere Form des Abbaus des Enzyms verhindert.

Einige der weiteren Reaktionen, die mit den stabilisierten Enzym- und Koenzymmassen durchgeführt wurden, sind unten angeführt. Die Reaktion der Phosphorylierung von Creatin ist:

Die restlichen Umsetzungen werden anhand der obigen Liste von Symbolen verständlich. Für eine NADP-Reaktion:

Für eine ADP-Reaktion:

Für die folgende Reaktion wird die Ausgangsreaktion Creatin + ATP zur Herstellung des ADP angewandt. Danach:

Die folgenden Umsetzungen zeigen die Verwendung von Urease und GLDH- Enzymen in den stabilisierten flüssigen Massen:

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung:

Beispiel I

Etwa 0,7 g Gelatine werden zu etwa 700 ml Wasser zugesetzt. Diese Lösung wird auf über 30°C erwärmt, um die Gelatine aufzulösen.

Diese Lösung wird dann in ein Wasserbad gestellt, um die Temperatur auf etwa 22°C zu senken.

Dann wird das pH in den Bereich von 6,5 bis 8,0 eingestellt. Dann werden der Lösung etwa 2,0 g ATP und anschließend 4,0 g NAD zugesetzt. Zusammen mit dem NAD werden 3 g Magnesiumchlorid zugesetzt. Dann werden 300 ml Glycerin zugesetzt.

Nach der Zugabe des Glycerins wird das pH durch Zugabe von 1-normaler Salzsäure auf etwa 7,5 eingestellt.

Nachdem eine vollständige Auflösung erzielt ist, wird die Lösung in einen Behälter aus Plastik oder Glas gefüllt, der dann verschlossen wird. Die Behälter werden abgedichtet und unter Kühlschrankbedingungen gelagert. Es wurde gefunden, daß eine in dieser Weise stabilisierte Koenzymmasse eine Lagerungsstabilität bis zu vier Jahren ohne merklichen Abbau besitzt.

Beispiel II

Der gemäß Beispiel I hergestellten Probe wird das Enzym Hexokinase zugesetzt, bevor sie in dem Glasbehälter abgedichtet wird, Es wird die gleiche Lagerungsbeständigkeit ohne merklichen Abbau erzielt.

Beispiel III

Der Probe von Beispiel II wird noch das Enzym G-6-PDH zugesetzt, bevor sie in dem Glasbehälter abgedichtet wird, und es wird die gleiche Lagerungsfestigkeit ohne merklichen Abbau erzielt.

Beispiel IV

Etwa 1,0 g eines Dextrans als Polymer werden zu etwa 700 ml Wasser zugesetzt. Diese Lösung wird dann auf über 30°C erwärmt, um das Polymer aufzulösen. Die Lösung wird in ein Wasserbad gestellt, um die Temperatur auf etwa 22°C zu senken.

Nach dem Senken der Temperatur werden der Lösung etwa 2,2 g NADP und anschließend 4,0 g ATP zugesetzt. Das pH der Lösung wird in dem Bereich von 6,5 bis 8,0 eingestellt. Dann werden 325 ml Glycerin zugesetzt.

Nachdem eine vollständige Auflösung erzielt ist, wird die Lösung in einem Behälter aus Plastik oder Glas eingebracht, der dann verschlossen wird. Die Behälter werden luftdicht verschlossen und unter Kühlen gelagert. Es wurde gefunden, daß eine stabilisierte Koenzymmasse etwa so wirksam ist wie die Masse von Beispiel I, obwohl kein Azid zugesetzt wurde.

In den folgenden Beispielen sind schematisch die Reagenzien und die Mengen, in denen sie in den verschiedenen wesentlichen Stufen der Herstellung der stabilisierten Massen gemäß der Erfindung zugesetzt werden, angegeben.

Beispiel V - Stabilisiertes ADP, AMP und NAD

Etwa 700 ml Wasser,
0,5 g Gelatine,
Auflösen unter Erwärmen,
0,7 g Natriumazid,
Kühlen auf Raumtemperatur,
50 g Creatinphosphat,
4 g ADP,
20 g AMP,
15 g NAD,
Auflösen und Einstellen des pH zwischen 7 und 9,
300 ml Glycerin,
Mischen und erneute pH-Einstellung,
Abfüllen in eine Flasche und Abdichten.

Beispiel VI - Stabilisiertes ADP, AMP, NAD, HK und G-6-PDH

Etwa 300 bis etwa 15 000 I.E. G-6-PDH je Liter und etwa 100 bis etwa 10 000 I.E. je Liter HK werden der Lösung von Beispiel V zugesetzt, bevor sie abgefüllt wird.

Beispiel VII

1,5 g NAD,
Auflösen in 5 ml Wasser,
Zusatz von 5 ml Glycerin,
pH-Einstellung auf unter 5.

Beispiel VIII - Stabilisierung von NAD und HK

1,5 g NAD,
Auflösen in 10 ml 0,1 molar Piperazin[bis]äthansulfonsäure als Puffer vom pH 7,
pH-Einstellung auf 6 bis 7,
Zusatz von 10 ml Glycerin,
erneute pH-Einstellung,
Zusatz und Auflösung von 10 mg HK mit einer Aktivität von 150 I.E./mg.,

Beispiel IX - Stabilisierung von Creatin, ATP und PEP

1000 ml Wasser,
Zusatz von 12,1 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
Zusatz von 1,0 g Gelatine,
Auflösen unter Erwärmen auf über 30°C,
Kühlen auf Raumtemperatur,
Zusatz von 2,0 g ATP;
Zusatz von 2 g PEP,
Zusatz von 10,0 g Creatin,
Auflösen und pH-Einstellung auf 9.

Beispiel X

Der stabilisierten Lösung von IX werden 100 bis 10 000 I.E./l LDH und 100 bis 10 000 I.E./l PK zugesetzt, bevor die Lösung abgefüllt wird.

Jede der Massen der Beispiele V bis X hat die gleiche Lagerbeständigkeit ohne beträchtlichen Abbau.

Claims

1. Stabilisiertes flüssiges Präparat für biologische diagnostische Bestimmungen, das in einem wäßrigen Träger ein oder mehrere Enzyme und ein oder mehrere Coenzyme und ein organisches Stabilisierungsmittel sowie einen oder mehrere Puffer zur Einstellung des pH enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es

a) als Coenzym Nikotinamid-adenin-dinucleotid (NAD), Adenosin-triphosphat (ATP), Adenosin-5′-diphosphat (ADP), Nikotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP) und/oder Adenosin-monophosphat (AMP),
b) als Enzym Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G-6-PDH), Hexokonase (HK), Glutamat-dehydrogenase (GLDH), Creatin-phosphokinase (CPK), Lactat-dehydrogenase (LDH), Pyruvat-kinase (PK) und/oder Alkaliphosphatase,
c) als organisches Stabilisierungsmittel 5 bis 70 Vol.-% an einem flüssigen Polyol mit zwei bis vier Hydroxylgruppen und zwei bis zehn Kohlenstoffatomen sowie 0,01 bis 0,5% an Gelatine, Polyvinylpyrrolidon oder Dextran enthält und
d) einen pH-Wert von 6,0 bis 8,5 aufweist.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es noch 0,01 bis 1% Magnesiumchlorid enthält.

3. Präparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyol Glycerin, Äthylenglykol, Propylenglykol, 1,2- Propandiol oder Butandiol ist.

4. Präparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyol in einer Menge von 25 bis 50 Vol./Vol.-% anwesend ist.

5. Präparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es noch 0,01 bis 0,5% an einem Azid enthält.

6. Verwendung eines Präparates gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, das als Coenzym ATP und NAD und als Enzym G-6-PDH und HK enthält, zur Bestimmung von Glucose.