CH651590A5 - Verfahren und reagensmischung zur bestimmung von alpha-amylase. - Google Patents

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CH651590A5 CH9494/78A CH949478A CH651590A5 CH 651590 A5 CH651590 A5 CH 651590A5 CH 9494/78 A CH9494/78 A CH 9494/78A CH 949478 A CH949478 A CH 949478A CH 651590 A5 CH651590 A5 CH 651590A5
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der a-Amylase und eine Reagensmischung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die Bestimmung des a-Amylasespiegels im Serum ist ein wichtiger klinischer Parameter für die Bauchspeicheldrüsenfunktion. Die handelsüblichen Reagenzien zur Bestimmung der a-Amylase basieren überwiegend auf einem System, bei dem Stärke durch die a-Amylase abgebaut und die gebildeten Bruchstücke im sichtbaren oder im UV-Bereich bestimmt werden, je nachdem, ob man angefärbte Stärke oder native Stärke als Amylasesubstrat in den Test einsetzt. Ein wesentlicher Nachteil dieser Verfahren bzw. Reagenzien beruht darauf, dass die Stärke als Makromolekül nur unzureichend zu charakterisieren und zu standardisieren ist, so dass die Umsatzrate der einzelnen Chargen sehr unterschiedlich ausfällt und bei den Messungen immer ein Standard mitgeführt werden muss. Für bessere Ergebnisse wäre ein einheitlicheres Substrat erforderlich, welches zuverlässige Ergebnisse bei der Spaltung liefert.
Einen Schritt vorwärts in Richtung auf ein einheitlicheres Substrat brachte die Verwendung der Maltopentaose. Diese wird von der a-Amylase zu Maltotriose und Maltose gespalten, Maltotriose und Maltose werden durch die a-Glucosidase in Glucose überführt, die dann nach beliebigen Methoden, beispielsweise mit der bekannten Hexokinase-Methode bestimmt werden kann.
Neben der Maltopentaose wurde auch bereits die Malto-tetraose und die Maltohexaose als Substrat vorgeschlagen (US-PS 3 879 263, 4 000 042). Dabei wurden jedoch mit der Tetraose deutlich schlechtere Ergebnisse als mit der Pentaose, und mit der Hexaose noch schlechtere Resultate als mit der Tetraose erzielt. So wird für die Maltotetraose und -pentaose noch eine stöchiometrische Reaktion angegeben, während für die Hexaose bereits gerade noch tolerierbare Abweichungen von der stöchiometrischen Reaktion festgestellt wurden.
Ein Nachteil der Maltopentaose, der auch bei der Tetraose gefunden wurde, ist jedoch, dass ein erheblicher Reagentienleerwert auftritt, d.h. die Messreaktion bereits läuft, bevor die zu bestimmende Probe zugesetzt wird. Hinzu kommt, dass auch dieser Reagentienleerwert bei höheren Substratkonzentrationen nicht konstant ist, sondern sich mehr als 25 Minuten lang verändert, ehe Konstanz dieser Nebenreaktion erreicht wird. Auch stellte sich heraus, dass die angenommene unterschiedliche Spaltung der Maltopentaose durch Pankreas-a-amylase und Saliva-a-amylase, die eine Unterscheidung ermöglicht hätte, tatsächlich nicht gegeben ist (J. BC, 1970, 245 3917 bis 3927; J. Biochem. 51, p. XVIII 1952).
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Reagens zur Bestimmung der a-Amylase zu schaffen, bei welchem ein Substrat verwendet wird, welches eine bessere Reinheit und Einheitlichkeit aufweist als die bekannten Substrate, leicht zugänglich ist und hinsichtlich Leerwert ohne Serum, Dauer der Lag-phase und erreichbarer Maximalaktivität den Forderungen entspricht. Ferner soll eine einfache Messung ohne teure und komplizierte Appara651 590
turen möglich und Eignung für Schnelldiagnostika, wie Teststreifen, gegeben sein.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein Verfahren zur Bestimmung von a-Amylase durch enzymati-sche Spaltung eines a-Amylasesubstrats, weitere Umsetzung des Spaltprodukts und Messung des Reaktionsprodukts, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass als Substrat eine Verbindung der Formel I
HO
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verwendet wird, in der R ein (l->-4)-verknüpftes Glucopyra-nosyi-, Phenylglucopyranosyl-, Mononitrophenylglucopyra-nosyl-, Dinitrophenylglucopyranosyl-, Sorbit- oder Glucon-säureradikal darstellt, wobei im Falle der Substitution des Glucopyranosylradikals eine l-0-(a oder ß)-Substitution vorliegt. Die Verbindung der Formel I ist,
wenn R= Glucopyranosyl: Maltoheptaosid;
wenn R= Phenylglucopyranosyl: Phenylmaltoheptaosid wenn R= Mononitrophenylglucopyranosyl: Mononitrophenylmaltoheptaosid ;
wenn R= Dinitrophenylglucopyranosyl: Dinitrophenylmaltoheptaosid ;
wennR= Sorbitrest: Maltoheptait;
wenn R= Gluconsäurerest: Maltoheptonsäure.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die Maltoheptaose überlegene Eigenschaften als Substrat der a-Amylase besitzt, obwohl bei den für diesen Zweck bereits vorgeschlagenen Oligomaltosen von der Maltopentaose zur Maltohexaose ein wesentlicher Abfall der Eignung festgestellt wurde, da mit ihr wesentlich schlechtere Resultate als mit der Pentaose erzielt werden. Es war daher zu erwarten gewesen, dass mit einer weiteren Verlängerung der Maltose-oligosac-charidkette nicht mehr tolerierbare Fehler auftreten würden. Überraschenderweise werden jedoch bessere Ergebnisse als mit der Pentaose erzielt. So beträgt der Reagenzienleerwert bei 0,02 ml Probe mit Maltopentaose als Substrat 73%, mit Maltoheptaose dagegen nur 13%, bezogen auf den Endwert der Bestimmung im Normalbereich.
Ausserdem wurde gefunden, dass anstelle der Maltoheptaose selbst auch bestimmte Maltoheptaose-derivate verwendet werden können, welche bei Einwirkung der a-Amylase ein derivatisiertes Spaltprodukt bilden, welches sich besonders vorteilhaft bestimmen lässt.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich in besonderem Masse bei der Bestimmung der Spaltprodukte mittels a-Glucosidase oder Maltosephosphorylase. Man kann wie folgt vorgehen:
Bei der Bestimmung mit a-Glucosidase und einer Verbindung der Formel I mit R = Glucopyranosyl werden die Spaltprodukte der Maltoheptaose, nämlich Maltotetraose und Maltotriose, weitergespalten zu Glucose und letztere dann in an sich bekannter Weise gemessen. Für die Messung der gebildeten Glucose wird dabei in Gegenwart der a-Glucosi-dase besonders das Hexokinaseverfahren bevorzugt. Das Prinzip dieser Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens lässt sich durch nachstehende Gleichungen wiedergeben:
Maltoheptaose + HzO "-Am>lase > Maltotriose + Maltotetraose Maltotriose+ 2H20a-ül"cusidas': >3 Glucose Maltotetraose + 3 H20"-a'ucosid"!"; > 4 Glucose
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7 Glucose+ 7 ATP-ÜÜ>7 Glucose-6-P 7 Glucose-6-P + 7NAD+G6 PDH >7 Gluconat-6-P + 7NADH + 7H +
Für diese Ausführungsform der Erfindung eignen sich besonders auch die erfindungsgemäss verwendeten Malto-heptaosederivate, also die Verbindungen der Formel I, in denen R keine unsubstituierte Glucopyranosylgruppe darstellt.
Bei Einwirkung der beiden Enzyme a-Amylase und a-Glucosidase wird der Substituent der Glucopyranosylgruppe, also eine Phenylgruppe, Mononitrophenylgruppe oder Dinitrophenylgruppe, bzw. der endständige Sorbit- oder Gluconsäurerest abgespalten und lässt sich leicht bestimmen. Die Phenylgruppen können in a- oder ß-Stellung stehen. Handelt es sich um die a-Stellung, so erfolgt deren Abspaltung durch die Einwirkung von a-Amylase und a-Glucosi-dase alleine, und die abgespaltenen, substituierten oder unsubstituierten Phenole lassen sich dann nach bekannten Farbreaktionen leicht bestimmen. Die Erfindung lässt sich aber auch bei ß-ständigen Substituenten in 1-0-Stellung am reduzierenden Ende des Glucopyranosylradikals R anwenden. Im letzteren Fall wird zusätzlich neben der a-Glucosi-dase auch noch ß-Glucosidase verwendet.
Bei den Dinitrophenylresten können die beiden Nitro-gruppen in beliebiger Stellung vorliegen, beispielsweise als 2,4-, 2,6- oder 3,5-Substituenten.
Die bei der Abspaltung der Nitrogruppen enthaltenden Substituenten freiwerdenden Nitrophenole bzw. Dinitrophe-nole sind selbst gefärbte Verbindungen, die sich ohne weiteres optisch bestimmen lassen. Wird Phenol selbst abgespalten, so lässt sich dieses nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung mit einem nucleophilen Agens, wie 3-Methyl-6-sulfonyl-benzthiazolon-hydrazon-(2) (HSK) in Gegenwart von Monophenoloxidase bestimmen. Bei dieser Reaktion wird ein roter Farbstoff gebildet, der gemessen werden kann.
Bei Abspaltung von Sorbit lässt sich dieser z.B. durch Sor-bitdehydrogenase zu Fructose oxidieren; gleichzeitig wird vorhandenes NAD zu NADH reduziert. Die Bildung des letzteren lässt sich in bekannter Weise im UV-Spektrophotometer leicht bestimmen. Steht ein solches nicht zur Verfügung, so kann durch Umsetzung mit einem Tetrazoliumsalz wie z.B. INT (2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazoli-umchlorid) in Gegenwart von Diaphorase oder einem anderen Elektronenüberträger auch ein gefärbtes Formazan gebildet werden, welches im sichtbaren Bereich ausgemessen werden kann.
In analoger Weise lässt sich freigesetzte Gluconsäure nach den hierfür bekannten Methoden bestimmen, z.B. mit Gluconat-kinase, 6-Phosphogluconsäure-dehydrogenase und NADP, sowie gegebenenfalls Tetrazoliumsalz und Elektronenüberträger.
Für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens sind im allgemeinen pH-Werte zwischen 5 und 9 geeignet. Bevorzugt wird bei pH-Werten zwischen 7 und 7,5 gearbeitet, da hierbei die besten Resultate und die kürzeste Reaktionszeit erhalten werden. Werden erfindungsgemäss Nitro-phenylverbindungen eingesetzt, so ist der Bereich der gut geeigneten pH-Werte etwas enger und liegt im allgemeinen zwischen pH 6 und pH 8,5.
Als Puffer eignen sich in der Regel solche, die im Hauptaktivitätsbereich der eingesetzten Enzyme wirksam sind. Bevorzugt werden Phosphat, HEPES (N-(2-Hydroxyäthyl) -piperazin-N-2-äthansulfonsäure) und Glycylglycin. Bevorzugte Konzentrationen liegen zwischen 10 und 200 mMol/1.
Die a-Glucosidase wird im allgemeinen in Mengen zwischen 0,1 und 5000 U/ml eingesetzt. Es ist ein besonderer
Vorzug des erfindungsgemässen Verfahrens, dass relativ grosse Mengen dieses Enzyms verwendet werden können, so dass die a-Amylasespaltung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist. Es ist natürlich auch möglich, noch höhere Mengen an diesem Enzym einzusetzen, hierdurch werden jedoch keine weiteren Vorteile mehr erzielt.
Die erfindungsgemäss verwendeten Verbindungen der Formel I werden im Test im allgemeinen in Mengen zwischen 0,1 und 250 mMol/1 eingesetzt. Bevorzugt werden Mengen zwischen 0,5 und 100 mMol/1.
Substratsättigung der a-Amylase mit Maltoheptaose liegt bei einer Konzentration von 8 bis 10 mMol vor. Zweckmässigerweise wird daher eine Mindestkonzentration von 8 mMol an Maltoheptaose verwendet, falls unter Bedingungen der Substratsättigung gearbeitet werden soll, was in der Regel der Fall ist.
Ausserdem wird zweckmässig ein Aktivierungsmittel für die a-Amylase zugesetzt. Derartige Aktivierungsmittel sind bekannt. Bevorzugt wird Natriumchlorid oder Kaliumchlorid.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Spaltprodukte durch Umsetzung mit Maltosephosphorylase unter Bildung von Glucose-1-phosphat, welches dann in an sich bekannter Weise bestimmt wird. Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung des Glucose-1-phosphats durch Umwandlung in Glucose-6-phosphat mittels ß-Phosphoglucosemutase, Oxidation des gebildeten Glucose-6-phosphats mit NAD in Gegenwart von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase unter Bildung von Glu-conat-6-phosphat und NADH, wobei die Bildung des letzteren photometrisch leicht verfolgt werden kann. Das Messsignal lässt sich noch verstärken durch Weiteroxidation mit NAD in Gegenwart von 6-Phosphogluconat-dehydrogenase unter Bildung von Ribulose-5-phosphat und einem weiteren Molekül NADH.
Das Prinzip dieser Ausführungsform geben die nachfolgenden Gleichungen wieder:
Maltoheptaose + H?0 "-Am>ljse > Maltotriose + Maltotetraose -> Maltose
Maltose + PO%- Mai^epho^honiase > Qiucose + ß-Glucose-1-P ß-Glucose-1 -pii-PGluM > Glucose-6-P Glucose-6-P+ NAD+-^^ü-> Gluconat-6-P+ NADH + H + Gluconat-6-P + NAD+-flPGDH > Ribulose-5-P + NADH + H +
Ein Vorteil dieser Ausführungsform der Erfindung liegt darin, dass Maltosephosphorylase spezifischer ist als a-Glucosidase und daher endogene Glucose nicht stört.
Hinsichtlich der Puffer gilt das zu der Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens mit dem a-Glucosidase-verfahren Ausgeführte in gleicher Weise.
Ausser den beiden oben aufgeführten Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens kann die Bestimmung der gebildeten Bruchstücke der Maltoheptaose, also Maltotetraose, Maltotriose und daraus gebildete Maltose auch nach anderen hierfür bekannten Methoden erfolgen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Reagensmischung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, enthaltend ein a-Amylasesubstrat und ein Reagens zur Bestimmung eines aus dem a-Amylasesubstrat durch die a-Amylase gebildeten Spaltprodukts, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das Substrat aus einer Verbindung der Formel I besteht.
Ein bevorzugtes Reagens für die Bestimmung der Spaltprodukte ist das a-Glucosidasesystem, welches a-Glucosi-dase, Alkalichlorid und Puffer enthält. Besteht das Substrat aus Maltoheptaose selbst, so werden als Enzyme noch Hexo-
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kinase (HK) und Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH) sowie NAD, ATP und Magnesium benötigt.
Bevorzugt besteht eine Reagensmischung auf Basis des a-Glucosidasesystems aus 5 x 103 bis 3 x 104 U/1 a-Glucosidase, 103 bis 5 x 104 U/I HK, 103 bis 5 x 104 U/1 G6PDH, 0,5 bis 8 mMol/l NAD, 0,5 bis 5 mMol/1 ATP, 1 bis 3 mMol/1 Mg:+, 25 bis 100 mMol/1 NaCI oder KCl, 25 bis 200 mMol/1 Puffer, pH 6,2 bis 7,8 und 5 bis 100 mMol/1 Maltoheptaose oder einem Vielfachen oder Bruchteil davon, in trockener oder gelöster Form.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält die Reagensmischung a-Glucosidase, KCl oder NaCI, Puffer und Substrat. Eine derartige Reagensmischung enthält insbesondere 102 bis 5 x 106 U/1 a-Glucosidase, 1 bis 100 mMoi/1 NaCI oder KCl, 10 bis 250 mMol/I Puffer, pH 5 bis 9 und 0,1 bis 250 mMol/1 eines Maltoheptaosederivates der Formel I, bezogen auf die Konzentration im Test. Die Reagensmischung kann in trockener, insbesondere lyophilisierter Form, oder in Form einer Lösung, als Mischung aller Bestandteile oder getrennt vorliegen.
Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält eine erfindungsgemässe Reagensmischung der obigen Art zusätzlich noch ß-Glucosidase oder/und Phenoloxidase und 3-Methyl-6-sulfonyl-benzthiazolon-hydrazon-(2) (HSK).
Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die erfindungsgemässe Reagensmischung neben a-Glucosidase, NaCI oder KCl, Puffer und Substrat noch Sorbitdehydrogenase oder Gluconat-kinase und 6-Phosphogluconsäure-dehydrogenase sowie NAD und gegebenenfalls ein Tetrazoliumsalz und Diaphorase bzw. Phena-zinmethosulfat (PMC).
Eine bevorzugte Reagensmischung dieser Art enthält 1 x 102 bis 3 x 106 U/1 a-Glucosidase, 2 x 103 bis 5 x 104 U/1 Sorbitdehydrogenase, 1 x 103 bis 5 x 104 U/1 Hexokinase, 0,5 bis 50 mMol/1 ATP, 10 bis 500 U/I Diaphorase (Chlostridium Kluyveri), 0,01 bis 0,5 mMol/1 Tetrazoliumsalz, 0,1 bis 10 mMol/1 NAD, 0,2 bis 5 mMol/1 MgCh, 0,5 bis 20 mMol/1 Maltoheptait, 1 bis 100 mMol/1 NaCI oder KCl und 10 bis 250 mMol/1 Puffer, pH 5,5 bis 8,5.
Gegebenenfalls ist noch ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise in einer Menge zwischen 5 und 50 mMol/1, vorhanden.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform enthält 100 bis 3x10" U/1 a-Glucosidase, 10 bis 104 U/1 6-Phosphogluco-natdehydrogenase, 20 bis 2 x 104 U/1 Gluconat-kinase, 0,5 bis 25 mMol/1 ATP, 0,05 bis 1,0 mMol/1 NADP, 1,0 bis 20 mMol/1 Maltoheptagluconsäure, 0,5 bis 5 mMol/1 MgCh, 1 bis 100 mMol/1 NaCI und 10 bis 250 mMol/1 Puffer, pH 5,5 bis 8,5.
Eine weitere bevorzugte Reagensmischung der Erfindung enthält 0,1 bis 250 mMol/1 a-Nitrophenyl-maltoheptaosid oder Dinitrophenyl-maltoheptaosid, 1 x 102 bis 2,5 x 106 U/1 a-Glucosidase, 1 bis 100 mMol/1 Natriumchlorid oder Kaliumchlorid und 10 bis 250 mMol/1 Phosphatpuffer, pH 7,0 bis 8,0.
Noch eine andere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemässen Reagensmischung enthält: 0,1 bis 250 mMol/1 a-Phenylmaltoheptaosid, 1 x 102 bis 1,5 x 106 U/I a-Glucosidase, 10 bis 105 U/1 Monophenoloxidase, 0,1 bis 10 mMol/1 HSK, 1 bis 100 mMol/1 NaCI oder KCl und 10 bis 250 mMol/1 Puffer.
Eine bandere bevorzugte Reagensmischung zur Bestimmung der Spaltprodukte ist das Maltosephosphorylasesystem, welches im wesentlichen aus Maltosephosphorylase, ß-Phosphoglucomutase (ß-PGIuM), Glucose-6-phosphat-de-hydrogenase (G6PDH), Glucose-1,6-diphosphat (G1,6DP), NAD, Puffer, Maltoheptaose und gegebenenfalls 6-Phospho-gluconatdehydrogenase (6PGDH) besteht.
Eine besonders bevorzugte Reagensmischung mit diesem Nachweissystem besteht aus 0,5 x 103 bis 20 x 103 U/1 Maltosephosphorylase, 1 x IO2 bis 1 x 104 ß-Phosphoglucomutase (ß-PGluM), 2x 102 bis 3 x 104 U/1 Glucose-6-phosphat-de-hydrogenase, 0,5 bis 10 mMol/1 NAD, 0,001 bis 1 mMol/1 Glucose-1,6-diphosphat, 0,5 bis 100 mMol/1 Puffer, pH 6,0 bis 7,5, 5 bis 50 mMol/1 Maltoheptaose und gegebenenfalls 1 x IO2 bis 1 x 104 U/1 6-Phosphogluconat-dehydrogenase.
Die erfindungsgemässe Reagensmischung kann in trockener oder gelöster Form vorliegen; sie kann auch auf einem blattförmigen Träger, z.B. einer Folie, einem saugfähigen Papier oder dergleichen, imprägniert vorliegen. Im letzteren Falle besteht sie zweckmässig aus wenigstens drei Schichten bzw. Lagen, wobei eine erste Schicht das Substrat enthält, die zweite Schicht als Sperrschicht dient und die dritte Schicht das Reagens zur Bestimmung der Spaltprodukte enthält. Wird ein derartiges mehrschichtiges Reagensmaterial, welches sich für einen einfachen Schnelltest auf a-Amylase eignet, mit einer flüssigen, a-amylasehaltigen Probe in Berührung gebracht, so spaltet die a-Amylase das Substrat, und die Bruchstücke diffundieren durch die Zwischenschicht in die dritte, das Bestimmungsreagens enthaltende Schicht. Als Nachweisreaktion wird in diesem Falle zweckmässig eine farbbildende Reaktion verwendet, um anhand der auftretenden Verfärbung die Konzentration der a-Amylase visuell sichtbar zu machen, falls die Spaltprodukte nicht selbst schon gefärbt sind.
Die erfindungsgemäss verwendeten Maltoheptaose-deri-vate der Formel I können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden. Soweit es sich um die phenylierten Derivate handelt, lassen sich sowohl chemische als auch enzymatische Methoden anwenden. Die chemische Synthese basiert prinzipiell auf der Umsetzung von peracetylierter Maltoheptaose mit dem entsprechenden Phenol in Gegenwart eines Friedel-Crafts-Katalysators. Diese Methode eignet sich sowohl für Phenol selbst als auch für Mononitrophenol und Dinitrophe-nol. Alternativ ist es auch möglich, zuerst das Phenylderivat herzustellen und dieses anschliessend zu nitrieren, z.B. mit dem in Bull. Chem. Soc. Japan 34, (1961) 718 beschriebenen Verfahren. Diese Methode eignet sich insbesondere für das Mononitro-derivat, wobei unter Umständen eine Trennung der entstandenen o- und p-Nitrophenylderivate vorgenommen werden kann.
Vorzugsweise wird diese Umsetzung durch Schmelzen oder Kochen am Rückfluss in unpolarem Lösungsmittel mit ZnCh, SnCU oder TiCU als Friedel-Crafts-Katalysator durchgeführt. Nach der Einführung des Phenols bzw. Nitrophenols werden die Schutzgruppen in an sich bekannter Weise abgespalten, beispielsweise mit Natriummethylat, Ammoniak, KO H oder Bariummethoxid, jeweils in methanolischer Lösung, mit wässriger Bariumhydroxidlösung usw.
Die enzymatische Herstellung der Phenylderivate erfolgt durch Transglucosidierung des Phenylglucosids bzw. der entsprechenden nitrierten Phenylglucoside mit a-Cyclodextrin, Amylase oder löslicher Stärke in Gegenwart einer spezifischen mikrobiellen Transferase. Bevorzugt wird hierzu eine Transferase aus Bacillus macerans verwendet. Dabei lässt sich für diese Transglucosidierung die bekannte Amylase von Bacillus macerans (E.C. 2.4.1.19. DMS 24; Isolierung: J.A. de Pinto, L.L. Campbell, Biochemistry 7, (1968) 114; Transferreaktion: Methods in Carbohydr. Chemistry, Vol. II, 347) verwenden, welche neben ihrer hydrolytischen und cyclisieren-den Wirkung offenbar auch eine glucosyltransferierende Wirksamkeit aufweist.
Diejenige Verbindung der Formel I, in welcher R einen Sorbitrest darstellt, lässt sich aus der Maltoheptaose durch Reduktion mit Natriumborhydrid (NaBH4) unter milden Bedingungen herstellen.
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Die Verbindung von Formel I schliesslich, in der R eine Gluconsäuregruppe darstellt, lässt sich chemisch oder enzy-matisch nach den bekannten Methoden zur Herstellung von Gluconsäure aus Maltoheptaose herstellen, z.B. durch Oxida-tion mit Brom (Methods in Carbohydr. Chemistry, Vol. II,
13).
Wie bereits erwähnt, wird durch die Erfindung nicht nur ein rasches und spezifisches Verfahren zur Bestimmung der a-Amylase geschaffen, sondern insbesondere wird die lag-phase ganz oder weitgehend beseitigt, was von besonderer Bedeutung bei der Anwendung des Verfahrens auf Analysenautomaten ist. Ausserdem lässt sich das erfindungsgemässe Verfahren in vielen Ausführungsformen ohne komplizierte Apparaturen für die Auswertung durchführen und eignet sich daher insbesondere für Schnelldiagnostica und zur optischen Bestimmung im sichtbaren Bereich. Gleichzeitig lassen sich die verschiedenen Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens jedoch auch mit UV-Messgeräten bestimmen. Weitere Vorteile sind strenge Proportionalität und keine Störung durch chemisch verwandte Inhaltsstoffe des Bluts.
Die erfindungsgemäss eingesetzten Substrate sind gut und in hoher Reinheit zugänglich. Ein einfaches Verfahren zur Herstellung der Maltoheptaose ist in der DE-OS 27 41 191 beschrieben. Das Verfahren eignet sich zur Bestimmung der a-Amylase in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Hepar-inplasma, Urin und dergleichen, oder in anderen flüssigen oder festen Materialien.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Maltogene Methode (a-Glucosidase-system)
Eine Reagenzienmischung, enthaltend a-Glucosidase, G6PDH, HK, NAD, ATP, Maltoheptaose, Mg2+ NaCI und Phosphatpuffer, wird in 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Haltbarkeit des Reagenz bei Zimmertemperatur beträgt etwa I Stunde, bei Temperaturen unter 8 °C 6 Stunden.
Die erhaltene Lösung weist folgende Konzentration der Reagenzien auf :
Phosphatpuffer
NaCI
Mg2+
Maltoheptaose ATP NAD HK
G6PDH a-GIucosidase
50 mMol/1; pH 7,0 50 mMol/1 2 mMol/I 10 mMol/1 1,2 mMol/1 2 mMol/1
< 2 U/1
< 2 U/1 <10 U/1
übrigen Reagenzien enthält, so lässt sich die Haltbarkeit der damit hergestellten Lösungen erhöhen. Sie beträgt für die Mischung der Reagenzien bei Temperaturen bis 8 °C 30 Stunden, bei Zimmertemperatur etwa 8 Stunden. Die Haltbarkeit 5 der Maltoheptaoselösung beträgt entsprechend 6 Wochen bzw. ca. 1 Woche.
Beispiel 2
Bestimmung mit dem Maltosephosphorylase-system io Es wurden zwei Reagenzien hergestellt, bestehend aus dem Amylasesubstrat und dem Maltosephosphorylase-system. Das eine Reagenz enthielt Maltoheptaosesubstrat, das andere entsprechend dem Stand der Technik lösliche Stärke. Die Reagenzienkonzentration nach dem Auflösen in Wasser 15 war wie folgt:
25
30
Die Lösung wird bei 25 °C mit 0,02 ml Serumprobe versetzt, in eine Küvette von 1 cm Schichtdicke gegeben und dann in Extinktion bei Hg 365 nm, 340 nm oder Hg 334 nm in einem Photometer bestimmt. Nach 10 Minuten wird die Extinktion abgelesen und dann in Abständen von je einer Minute fünfmal die Ablesung wiederholt.
Aus den so ermittelten Extinktionsdifferenzen pro Minute (AE/min) wird der Mittelwert gebildet, der Reagenzienleer-wert subtrahiert und der korrigierte Wert wird in die Berechnung eingesetzt.
Die Berechnung erfolgt wie folgt:
U/I 25 ° C = 4244 x AE 365 nm/min = 2290 x AE 340 nm/min = 2335 x AE 334 nm/min
Fig. 1 der Zeichnung zeigt die Ergebnisse einer Verdünnungsreihe von Humanserum mit physiologischer Kochsalzlösung, die nach dieser Methode erhalten werden.
Wird das Reagenz in zwei Chargen aufgeteilt, von denen eine die Maltoheptaose und die andere die Mischung aller
Erfindung
Vergleich
Phosphatpuffer
20 mM; pH 6,520 mM; pH 6,5
NAD
2 mM
2 mM
Maltoheptaose
10 mM
-
lösliche Stärke
-
5 mg/ml
Glucose-1,6-diphosphat
Spuren
Spuren
Maltosephosphorylase
3 U/ml
3 U/ml
(Mikroorg.)
ß-Phosphoglucomutase
1 U/ml
1 U/ml
(Mikroorg.)
G6PDH (Leuconostoc mesent)9 U/ml
9 U/ml
6Ì*GDH (Leuconostoc mesent)l U/ml
1 U/ml
Die erhaltene Lösung wurde bei 30 °C inkubiert, mit der Probelösung versetzt und in einem Photometer die Extinktionsdifferenz bei Hg 334 nm bestimmt. Nach der lOminüti-gen Vorinkubation wird die Extinktionsdifferenz über 10 Minuten gemessen. Für 2,0 ml Reagenz und 0,10 ml Probe ergibt sich dann folgende Berechnungsformel:
AE/min x
2,1 x 1000 6,18x0,1 x0,2
= AE/min x 1699 U/1
Bei Einsatz von fünf verschiedenen Humanseren wurden mit den obigen Reagenzien folgende Werte gefunden:
50
55
Serum
Erfindung
Stärke
1
37,4 U/1
15,3 U/1
2
61,2 U/1
27,3 U/1
3
95,1 U/1
39,1 U/I
4
114 U/1
44,2 U/1
5
374 U/I
161 U/1
Herstellungsverfahren :
1. Herstellung von a-Phenylmaltoheptaosid (I mit R= Phenylglucopyranosyl)
a) Tridecosacetyl-ß-D-maltoheptaose 57,6 g (50 mM) Maltoheptaose und 41 g (500 mM) Natri-60 umacetat wasserfrei werden in 543 ml (5,75 Mol) Essigsäure-anhydrid suspendiert und 4 Stunden lang bei 100 °C kräftig unter Feuchtigkeitsausschluss gerührt. Nach Abkühlung auf ca. 60 °C wird in ca. 1 1 Eiswasser eingerührt und über Nacht bei 4 °C weitergerührt, wobei eine zähe, halbkristalline Masse 65 ausfällt. Nach Abgiessen des Überstands wird der Rückstand erneut mit Eiswasser verrührt. Dabei kristallisiert das Produkt durch. Es wird abgetrennt, gewaschen und getrocknet. Ausbeute 80,7 g (76% d. Th.) farblose Kristalle.
7
651 590
[<*ÊT = + 137,5° (c= 1,15 Chloroform), Fp.= 150° (unscharf).
Die Mutterlauge (das Dekantat) wird im Vakuum zur Trockne eingeengt und der Rückstand ebenfalls mit Eiswasser verrieben und zur Kristallisation gebracht.
Ausbeute 22,3 g.
MdT= 136° (c= 1, Chloroform) Fp. = 150 °C.
Gesamtausbeute 103 g = 97% d. Th;
Das Produkt kann aus Äthanol umkristallisiert werden, wobei sich auch nach mehrmaligem Umkristallisieren Fp und Drehwert nicht ändern. Das Produkt ist daher am Ci-Atom optisch einheitlich (ß) konfiguriert.
b) Dodecosacetyl-a-phenyl-D-maltoheptaosid
9,54 g (4,5 mM) Tridecosacetyl-ß-D-maltoheptaose, 0,61 g (4,5 mM) frisch geschmolzenes ZnCh und 4,23 g (45 mM) destilliertes Phenol werden unter Feuchtigkeitsausschluss 2,5 Stunden lang bei 100 °C gerührt. Dann wird noch warm in Äthylacetat gelöst und mit je 2 x 100 ml H20,3 x 100 ml 1 N NaOH, 100 ml 1 N Essigsäure und 100 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die anfänglich braune Lösung wird dabei hellgelb. Nach Trocknen über MgSCh wird zur Trockne eingeengt und in warmem Methanol (30 ml) aufgenommen.
Nach Stehen über Nacht scheidet sich ein sirupartiges Material ab, das aus Äthanol kristallisiert wird.
Ausbeute: 8,7 g (90° d. Th.) Fp.= 155-165 °C (Zersetzung).
[a]oT= + 147° (c = 8 in Chloroform)
c) Phenyl-a-D-maltoheptaosid
10,8 g (5 mM) Peracetyl-l-phenyl-a-D-maltoheptaosid werden warm in 200 ml absolutem Methanol gelöst und bei Raumtemperatur unter Zusatz von etwas Dioxan unter Rühren mit 30 ml 0,1 N Natriummethylat versetzt und 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach 20 Minuten beginnt sich das Produkt halbkristallin abzuscheiden. Schliesslich wird mit 200 ml Aceton versetzt, auf 4 °C abgekühlt und abgesaugt. Das Produkt wird in Wasser gelöst (160 ml), mit Aktivkohle entfärbt und mit Kationenaustauscher (Dowex 50 H+) im batch entsalzt.
Ausbeute 5,6 g (91% d. Th.) farbloses Lyophilisat.
[c]dt= + 176° (c= 10 in HaO).
Das Produkt enthält noch etwas freie Maltoheptaose und - nach HPLC-Analyse (Detektion bei 254 nm) - noch 2 UV-positive Verunreinigungen. Diese werden durch Chromatographie an vernetztem Dextran (Sephadex LH20) mit Wasser als Elutionsmittel abgetrennt.
2. Herstellung von p-Nitrophenyl-a-D-maltoheptaosid (I mit R = Mononitrophenylglucopyranosyl)
a) Peracetyl-p-nitrophenyl-a- D-maltoheptaosid
13,6 g (20 mM) Peracetyl-maltoheptaose, hergestellt nach Beispiel 1, a), werden mit 11,9 g (100 mM) p-Nitrophenol in 90 ml absolutem Benzol gelöst und unter Rühren und Feuchtigkeitsausschluss mit 10,4 g = 4,5 ml (40 mM) SnCU versetzt. Dabei fällt eine voluminöse Masse aus, die sich jedoch beim Erwärmen wieder löst. Es wird 1 Stunde lang unter Rückfluss gekocht. Beim Abkühlen fällt eine zähe Masse aus, die nach Zusatz von 80 ml Äthylacetat wieder in Lösung geht. Beim Einrühren der Lösung in 180 ml 2 N NaiCCb-Lösung fällt Zinnoxidhydrat aus. Dieses wird unter Zusatz von etwas Aktivkohle abgetrennt. Die wässrige Phase wird abgeschieden und die organische Phase gut gewaschen, zuletzt mit gesättigter NaCl-Lösung. Nach dem Trocknen und Einengen der Lösung erhält man ein harziges Produkt, das aus Äthanol kristallisiert.
Ausbeute 6,2 g (41% d. Th.) Fp.= 100 °C (Zersetzung).
[a]nT= +131° (c= 1 in Chloroform).
Das Produkt erhält man auch, wenn man den Ansatz in Chloroform oder mit TiCU statt SnCl-i durchführt.
b) p-Nitrophenyl-a-D-maltoheptaosid 5,5 g (7 mM) Peracetyl-p-nitrophenyl-maltoheptaosid wird in 100 ml absolutem Methanol aufgeschlämmt und mit 5 ml einer ca. 1 N Natriummethylat-Lösung versetzt. Das Ausgangsmaterial wird honigartig und löst sich langsam. Nach einiger Zeit beginnt die kristalline Abscheidung des entacety-lierten Produkts, die nach Rühren über Nacht vollständig ist. Es wird abgesaugt, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute 2,8 g (86% d. Th.).
[aßT = + 124° (c = 0,6 in H:0)
Das Produkt wird an vernetztem Dextran (Sephadex LH20) mit Wasser als Elutionsmittel gereinigt. Man erhält 1,2 g (45%) der oben beschriebenen Verbindung, die im enzymati-schen Test aktiv ist. Ausserdem wurde die Verbindung auch durch Nitrieren von a-Phenylmaltoheptaosid von Beispiel 1 mit Nitriersäure nach Bull. Chem. Soc. Japan 34 (1961) 718 erhalten.
Unter Verwendung von Dinitrophenol anstelle von Mono-nitrophenol erhält man die entsprechenden Dinitrophenylver-bindungen.
3. p-Nitrophenyl-a-maltooligosaccharide durch enzymatische Synthese mit Bacillus macerans-amylase (E.C.2.4.1.19 aus Bac. mac. DSM 24).
Bacillus macerans-amylase hat neben hydrolytischer und cyclisierender Wirkung auch Glycosyl-transferierende Eigenschaften, die zur Synthese von Oligosacchariden und -deriva-ten ausgenützt werden können (Methods in Carbohydrate Chemistry II, 347). Für die Synthese von p-Nitrophenyl-oli-gosacchariden wurde dieses Verfahren wie folgt optimiert:
680 mg Bacillus macerans-amylase (E.C.2.4.1.19 aus Bac. mac. DSM 24) (Lyophilisat) (0,46 U/mg Einwaage, Proteingehalt der Einwaage 28,5%, frei von p-Nitrophenyl-a-D-glu-cosid-spaltenden Aktivitäten),
400 mg a-D-p-Nitrophenylglucosid,
3,5 g a-Cyclodextrin, und
70 ml Soerensen Phosphat-puffer, pH 6,2; 0,01 M werden gemischt. Der Ansatz wird 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Zur Aufreinigung wird dann a- und entstandenes ß-Cyclodextrin zunächst über die Tetrachloräthylen-Einschlussverbindung abgetrennt. Nach Chromatographie an versetztem Dextran (Sephadex LH20) erhält man 50 mg Lyophilisat von im Amylase-Test hochaktivem p-Nitrophe-nyl-maltoheptaosid.
4. Herstellung von Maltoheptait (I mit R = Sorbitrest)
10 g Maltoheptaose werden in 50 ml HaO gelöst, dazu gibt man portionsweise 2 g NaBH4 und rührt 75 Minuten lang bei Raumtemperatur (Probe auf reduziertem Zucker negativ). Durch Chromatographie an Kationenaustauscher (Dowex 50 H+) wird Na+ entfernt (pH-Wert der Lösung nach Austauscherpassage =3,5). Der Durchlauf wird im Vakuum eingeengt und mehrmals mit Methanol/Wasser (Wasserzusatz zur Lösung des Produkts) aufgenommen und eingeengt zur Entfernung von Borsäure als Methylester. Die am Ende neutrale Lösung wird lyophilisiert.
Ausbeute 9 g (90% d.Th.) frei von reduzierenden Zuckern Gehalt (enzymatisch bestimmt) aus Glucose 86,1%, aus Sorbit 89,0%, Wasser 8,5%.
5. Herstellung von Maltoheptonsäure (I mit~R = Glucon-säurerest)
11,5 g (0,01 Mol) Maltoheptaose und 6 g Ba-benzoat wurden in 150 ml Wasser eingetragen. Unter Rühren und Kühlen wurde 1 ml Brom zugesetzt und 36 Stunden weitergerührt. Nach Abtreiben des überschüssigen Broms durch Stickstoff wurde mit 4 ml 4 N H:SOj und etwas Aktivkohle versetzt, filtriert und das Filtrat mit Chloroform extrahiert, um die Ben5
10
15
20
25
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b5
651 590
8
zoesäure zu entfernen. Die wässrige Lösung wurde mit 3,2 g AgiCCb versetzt und gerührt (pH: neutral). Die unlöslichen Salze wurden abfiltriert und die klare Lösung über 20 ml Amberlite JR + gezogen. Das saure Eluat wurde sofort mit .Na0H neutralisiert und lyophilisiert.
Ausbeute: 8 g (72% d. Th.)
Gehalt (enzymatisch bestimmt) aus Glucose 85%, aus Glu-consäure 80%, Wasser 9,3%.
Beispiel 3
Nachweis von a-Amylase mit Phenyl-a-maltoheptaosid als Substrat.
Phenyl-a-maltoheptaosid wird von der a-Amylase in Phe-nyl-a-maltotriid oder -Tetraid gespalten, welche durch a-Glucosidase zu Phenol und Glucose umgesetzt werden. Das freigesetzte Phenol wird durch Monophenoloxidase oxidativ mit dem nucleophilen Reagens 3-Methyl-6-sulfonyl-benzthiazo-Ion-hydrazon-(2) (HSK) zu einem roten Farbstoff gekuppelt, dessen Bildungsgeschwindigkeit proportional zur Amylaseak-tivität in der Probe ist und photometrisch verfolgt werden kann.
Testprinzip:
I.a) Phenyl-a-maltoheptaosid + H2O "-Amy|ase> phenyl-a-D-tri-(tetra)-glucopyranosid + Maltotetra-(tri)-ose b) Phenyl-a-D-tri-(tetra)-gIucopyranosid + 3 (4)
H20 a'Glucosidase> phenol + 3 (4) GluCOSe
C) Phenol + HSK + Ol Monophenoloxidase».., Farbstoff + 2 H2O
Messbedingungen :
25 °C, Messwellenlänge 492 nm, I cm Küvetten; die Reagenszusammensetzung zeigt folgende Tabelle.
Tabelle
Reagens Konzentration im Test
Phosphatpuffer, pH 7,4 0,05 Mol/1
Natriumchlorid 0,05 Mol/1
Phenyl-a-D-maltoheptaosid 10 mMol/1
HSK 1 mMol/1
Monophenoloxidase 1 U/ml a-Glucosidase 10 U/ml
Testvolumen: 2,0 ml
Anstelle von Phosphatpuffer erwiesen sich auch Glycin-, Glycylglycin-, Hepes-, Tris-, Tra- und andere Puffer als brauchbar.
Beispiel 4
Bestimmung von a-Amylase mit p-Nitrophenyl-maltohep-taosid.
Testprinzip:
p-Nitrophenyl-a-maltoheptaosid"'Amyliliie> (Glucose)n + p-Nitrophenyl-a-(glucose)m"'GluC0Md'u":> n Glucose + p-Nitro-phenol.
Nach der Spaltung des Maltoheptaosids werden die Spaltprodukte zu Glucose und p-Nitrophenol abgebaut. Das p-Nitrophenolatanion ist in alkalischer Lösung gelb gefärbt und kann daher direkt optisch gemessen werden.
Testsystem:
Reaktionsgemisch :
50 mM/1 Phosphatpuffer, pH 7,4 50 mM/1 Natriumchlorid 5 bis 50 U/ml a-Glucosidase 5 bzw. 10 mM/1 p-Nitrophenyl-a-maltoheptaosid
Testansatz:
1 ml Reaktionsgemisch + 50 ul Probe (Serum)
Temperatur: 30 °C Wellenlänge: 405 nm
Serumstart nach Erreichen der Messtemperatur (10 Minuten Vorinkubation).
Beispiel 5
a-Amylase-Bestimmung mit Maltoheptait Testprinzip:
Maltoheptait + H2O "-Am-vlase> Maltotriit + Maltotetraose Maltotriit + H2O "-Glucosidase> Sorbit + Maltose Sorbit + NAD+-^2ä> Fructose + NADH + H +
NADH + INT + h+-^e!!2!H£> Formazan + NAD+
SDH = Sorbitdehydrogenase.
Testsystem:
Reaktionsansatz ml Konzentration im Test
Na-/K-P04-Puffer 0,02 Mol/1 1,92 12,8 mMol/1 PO4 + Triton XI00 2 ml/100 ml
+ NaCI 10 mMol/1, pH 6,9
6,4 mMol/1
MgCh 0,3 Mol/1
0,01
1,0 mMol/1
Maltoheptit 100 mMol/1
0,10
3,3 mMol/1
NAD c = 40 mg/ml
0,05
1,0 mMol/1
INT c = 0,6 mg/ml
0,20
0,09 mMol/1
Diaphorase (Clostr. Kluyveri)
0,05
167 U/1
5 mg/ml+
ATP c = 50 mg/ml
0,10
3,29 mMol/1
Hexokinase 280 U/ml +
0,05
4666 U/1
SDH 180 U/ml +
0,30
18000 U/1
a-Glucosidase 1120 U/ml +
0,20
74670 U/I
Probe (Serum)
0,02
+ in Testpuffer
Start durch Probezugabe: Messung erfolgt bei 492 nm; Temperatur: 25 °C
Beispiel 6
a-Amylasebestimmung mit Maltoheptagluconsäure. Testprinzip:
Maltoheptagluconsäure + H2O «-Aniy|ase> Maltotrioglucon-säure + Maltotetraose
Maltotriogluconsäure + H2O «-G|"cosldase> Gluconsäure + Maltose
Gluconsäure + ATP G|»c°"a'-|t'nase> GIuconsäure-6-P + ADP GlueonsäUre-6-P + NADP+ ft-Pho^ogluconsauredehydrogen^
Ribulose-5-P + NADPH + CO2 + H +
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Testsystem:
9
651 590
Reaktionsansatz ml
Konzentration im Test
Na-/K-PC>4-Puffer 0,02 Mol/1
2,19
14,6 mMol/1
Phosphat,
+ NaCI 10 mMol/1, pH 6,9
7,3 mMol/1 NaCI
MgCh 1 mol/1
0,01
3,3 mMol/1
Maltoheptagluconsäure
0,10
5 mMol/1
150 mMol/1
NADP c= 10 mg/ml
0,10
0,38 mMol/1
ATP c = 50 mg/ml
0,10
2,7 mMol/1
Gluconat-kinase 40 U/ml
0,03
1066 U/1
6-Phosphogluconsäure-dehydro-
0,10
800 U/1
genase 24 U/ml
a-Glucosidase 1120 U/ml
0,30
11,2 x 104 U/1
Probe (Serum)
0,02
Start durch Probenzugabe, Messung erfolgt bei 340 nm oder 365 nm, Temperatur: 25 °C, Testvolumen: 3,00 ml.
G
1 Blatt Zeichnungen

Claims (24)

  1. 651 590
    PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Bestimmung von a-Amylase durch enzy-matische Spaltung eines a-Amylasesubstrats, weitere Umsetzung des Spaltprodukts und Messung des Reaktionsprodukts, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat eine Verbindung der Formel I
    OH
    OH •
    CH-OH
    HO
    OH
    verwendet wird, in der R ein (I-»-4)-verknüpftes Glucopyra-nosyl-, Phenylglucopyranosyl-, Mononitrophenylglucopyra-nosyl-, Dinitrophenylglucopyranosyl-, Sorbit- oder Glucon-säureradikal darstellt, wobei im Falle der Substitution des Glucopyranosylradikals eine l-0-(a oder ß)-Substitution vorliegt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Spaltprodukte durch a-Glucosidase in Glucose überführt und diese bestimmt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man bei pH-Werten zwischen 5 und 9 arbeitet.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man 0,1 bis 250 mMol/1 einer Verbindung von Formel I einsetzt.
  5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einem ß-ständigen Substituenten in 1-0-Stellung am reduzierenden Ende des Glucopyranosylradikals R zusätzlich ß-Glucosidase verwendet.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Spaltprodukte mit Maltosephosphorylase umsetzt unter Bildung von Glucose-1-phosphat und letzteres bestimmt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Bestimmung des gebildeten Glucose-
    1 -phosphats dieses mit Phosphoglucomutase in Glucose-6-phosphat umwandelt und mit letzterem NAD in Gegenwart von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase zu NADH reduziert, welches man misst.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man, wenn R ein (!->• 4)-verknüpftes Phenylglucopyranosylradikal darstellt, abgespaltenes Phenol mit 3-Methyl-6-sulfonyl-benzthiazolonhydrazon-(2) in Gegenwart von Monophenoloxidase bestimmt.
  9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man, wenn R ein (l-<-4)-verknüpftes Sorbitradikal darstellt, abgespaltenes Sorbit mit Sorbit-de-hydrogenase und NAD bestimmt.
  10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man, wenn R ein (!->■ 4)-verknüpftes Gluconsäureradikal darstellt, abgespaltene Gluconsäure mit Gluconat-kinase, 6-Phosphogluconsäuredehydrogenase und NADP bestimmt.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Reduktion von NAD gebildetes NADH mit einem Tetrazoliumsalz in Gegenwart eines Elektronenüberträgers zum Formazan umsetzt und letzteres bestimmt.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als Elektronenüberträger Diaphorase bzw. Phena-zinmethosulfat verwendet.
  13. 13. Reagensmischung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend ein a-Amylasesubstrat und ein Reagens zur Bestimmung eines aus dem Amylasesubstrat durch die a-Amylase gebildeten Spaltprodukts, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat aus einer Verbindung der allgemeinen Formel I
    CH-OH
    OH
    HO
    OH
    besteht, in der R ein (1-» 4)-verknüpftes Glucopyranosyl-, Phenylglucopyranosyl-, Mononitrophenylglucopyranosyl-, Dinitrophenylglucopyranosyl-, Sorbit- oder Gluconsäureradikal darstellt, wobei im Falle der Substitution des Glucopyranosylradikals eine 1 -0-(ct oder ß)-Substitution vorliegt.
  14. 14. Reagensmischung nach Anspruch 13, bestehend im wesentlichen aus a-Glucosidase, Hexokinase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, NAD, ATP. Mg2+, NaCI, Phosphatpuffer und Maltoheptaose als Substrat.
  15. 15. Reagensmischung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus 5 x 103 bis 3 x 104 U/Liter a-Glucosidase, 103 bis 5 x 104 U/Liter Hexokinase, 103 bis 5 x 104 U/Liter Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, 0,5 bis 8 mMol/ Liter NAD, 0,5 bis 5 mMol/Liter ATP, 1 bis 3 mMol/Liter Mg2+, 25 bis 100 mMol/Liter NaCI oder KCl, 25 bis 200 mMol/Liter Puffer, pH 6,2 bis 7,8 und 5 bis 100 mMol/Liter Maltoheptaose oder einem Vielfachen oder Bruchteil davon in trockener oder gelöster Form besteht.
  16. 16. Reagensmischung nach Anspruch 13, bestehend im wesentlichen aus Maltosephosphorylase, ß-Phospho-gluco-mutase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Glucose-1,6-diphosphat, NAD, Puffer, Substrat und gegebenenfalls 6-Phospho-gluconat-dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat aus Maltoheptaose besteht.
  17. 17. Reagensmischung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die aus 0,5 x 103 bis 2 x 104 U/Liter Maltosephosphorylase, 1 x IO2 bis 1 x 104 U/Liter ß-Phospho-gluco-mutase, 2 x 102 bis 3 x 104 U/Liter Glucose-6-phosphat-de-hydrogenase, 0,5 bis 10 mMol/Liter NAD, 0,001 bis l mMol/ Liter Glucose-1,6-diphosphat, 0,5 bis 100 mMol/Liter Puffer, pH 6,0 bis 7,5, 5 bis 50 mMol/Liter Maltoheptaose und gegebenenfalls 1 x IO2 bis 1 x 104 U/Liter 6-Phospho-gluconat-dehydrogenase besteht.
  18. 18. Reagensmischung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie a-Glucosidase, NaCI oder KCl, Pufferund eine Verbindung der Formel I enthält.
  19. 19. Reagensmischung nach Anspruch 13 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie 102 bis 5 x 106 U/1 a-Glucosidase,
    1 bis 100 mMol/1 NaCI oder KCl, 10 bis 250 mMol/1 Puffer, pH 5 bis 9, und 0,1 bis 250 mMol/1 einer Verbindung der allgemeinen Formel I, bezogen auf die Konzentration im Test, enthält.
  20. 20. Reagensmischung nach einem der Ansprüche 13, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich noch ß-Glucosidase oder/und Phenoloxidase und 3-Methyl-6-sul-fonyl-benzthiazo!on-hydrazon-(2) enthält.
  21. 21. Reagensmischung nach einem der Ansprüche 13, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich Sorbit-dehydrogenase oder Gluconat-kinase und 6-Phosphoglucon-säure-dehydrogenase sowie NAD enthält.
  22. 22. Reagensmischung nach Anspruch 21, dadurch gekenn2
    5
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    15
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    65
    zeichnet, dass sie zusätzlich Tetrazoliumsalz und Diaphorase oder Phenazinmethosulfat enthält.
  23. 23. Reagensmischung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oberflächenaktives Mittel enthält.
  24. 24. Reagensmischung nach einem der Ansprüche 13 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem blattförmigen Trägermaterial imprägniert oder inkorporiert vorliegt.
CH9494/78A 1977-09-13 1978-09-11 Verfahren und reagensmischung zur bestimmung von alpha-amylase. CH651590A5 (de)

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