JPS61124397A - α−アミラ−ゼの活性測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、臨床診断、生化学的研究等の分野においてａ
−アミラーゼの活性を測定するために使用する試薬に関
するものである。

従来の技術 血液や尿などの体液中に倉まれているα−アミラーゼの
活性測定は、臨床診断や生化学的研究における重要な基
礎データを提供するものであり、広〈実施されている。

その場合に採用される酵素活性測定法としては種々の方
法があるが、近年開発された方法の一つに、マルトオリ
ゴ糖の還元性分子末端ｌニインジケーター化合物として
フェノール類をグルフシダーゼさせてなる基質または無
処理マルトオリゴ糖からなる基質に、σ−グルコシグー
ゼ（またはα−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダー
ゼ）の存在下または不存在下に、検体中のα−アミラー
ゼを作用させ、避難するインジケーター化合物またはグ
ルコースを定量することによってα−アミラーゼの活性
を知る方法がある（米国特許第３８７９２６３号、特公
昭５７−５３０７９１）。この場合に作用させるａ−グ
ルコシダーゼやβ−グルコシダーゼは追随酵素と呼ばれ
、２沈を用いると上記基質の加水分解が化学量論的に進
行し、測定精度が向上する。具体的には、たとえばα−
アミラーゼを含有する検体に基質としてｐ−ニトロフェ
ニル−α−マルトペンタオサイドを、また追随酵素とし
てａ−グルコシダーゼを、それぞ粍加え、まずα−アミ
ラーゼの作用に上りｐ−二トロ７工二ルーα−マルトペ
ンタオサイトからｐ−二トａフェニル−ａ−マルトサイ
ドおよびマルシトリオースを生成させ、これらに次いで
追随酵素を作用させてｐ−二トロフェノールおよびグル
ツースを生ｒ＆させ、インジケーター化合物である前者
の生成量の時間的変化を追跡することによｒ）ａ−アミ
ラーゼの活性を知る。この場合、ｐ−二トロフェノール
は波長４００ｎｍ付近に極大吸収を有し、一方、これが
結合した基質・ｐ−ニトロ７エ二ルーα−マルトペンタ
オサイドは波長３００止付近に極大吸収を有するから、
波長４００ｎ−付近の吸光度を測定することにより、１
１離したインジケーター化合物の定量を容易に行うこと
ができる。

上記例のほかにも、芳香環に直結したニトロ基または芳
香環と共役する炭素−炭素１Ｉｌ１２重結合を介して芳
香環と結合した二）び基を有する芳香族フェノール類（
以下、ニトロ基置換フェノール類という）をインジケー
ター化合物として結合させた基質を用いてａ−アミラー
ゼ活性を測定する方法は幾つか提案されており、その一
つとして、吸光度測定による定量値がｐＨ変動の影響を
受は難い点でより有利な、０−ノ翫ロゲン置換ニトロフ
ェノールがインジケーター化合物として結合された０−
ハロゲン置換ニトロフェニルマルトオリゴサイドを基質
として用いる方法（本発明者らによるもので、特願昭５
８−１．１１２９６号として特許出願済；未公開）があ
る。

明が解ｉしようとする問題点 追随酵素を用いるａ−アミラーゼ活性測定法は、特に基
質としてニトロ基置換フェノール類が結合されたちのを
用いる場合、測定が簡単で測定精度もよく、すぐれたも
のであるが、検体がα−アミラーゼを全く含有しないも
のの場合でも、追随酵素が基質を加水分解させ（いわゆ
るブランク反応）、偽紅アミラーゼ活性測定値を与える
ので、それを補正することが必要であり、また、ブラン
ク反応が急速であるときは、基質と追随酵素からなる酵
素活性測定試薬が使われる前に有効基質濃度の低下を招
くし、ブランク値も大きくなって酵素活性測定精度が悪
くなろという問題がある。

本発明の目的は、基質と追随酵素とを併用するα−アミ
ラーゼ活性測定法における上述のような問題点を解決し
、ブランク反応を起こし難く安定性のよいα−アミラー
ゼ活性測定用試薬を提供することにある。

問題点を解決するための手段 上記目的を達成することに成功した本発明は、マルトオ
リゴ糖の還元性分子末端に７エ／−ル類を結合させてな
るグルフンｒまたはマルトオリゴ糖をａ−アミラーゼの
基質として含有し、α−グルコシグーゼを追随酵素とし
て含有するα−７ミテーゼの活性測定用試薬４非イオン
界面活性剤またはデキストラン硫酸エステルもしくはそ
の塩をブランク反応抑制のための助剤としで含有させた
ことを特徴とするものである。

本発明に上るａ−アミラーゼ活性測定用試薬に含有させ
る非イオン界面活性剤、デキストラン硫酸エステルらし
くはその塩の量は、全液量に対して０．０１〜Ｓｖ／ｖ
％程度でよ（、特にデキストラン硫酸エステルとその塩
の場合、有効量の下限は約０．００１％である。非イオ
ン界面活性剤とデキストラン硫酸エステル（またはその
塩）は併用してもよく、その場合は七へらを単独で用い
た場合よりも一層顕著な使用効果が得られる。

本発明によるＱ−７ミラーゼ活性測定用試薬に含有させ
る非イオン界面活性剤は、水溶性の点で問題のないＨＬ
Ｂ値１２以上のものであればなんでもよいが、使用可能
なものの具体例としては次のようなものがある。これら
は２種以上を併用してもよい。

（ｉ）　　ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリ
オキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン
ステアリルエーテル等のポリオキシエチレン長鎖フルキ
ルエーテル。

（ｉｉ）　　ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテ
ル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等の
ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル。

（ｉｉｉ）　　ポリオキシエチレンモノオレエト、ポリ
オキシエチレンモノオレエート、ポリオキシエチレンモ
ノステアレート等のポリオキシエチレン脂肪酸エステル
。

（ｉｖ）　　ポリオキシエチレンステ７リルエーテルラ
ウレー）、ポリオキシエチレン７ニルフエニルエーテル
ラウレート等の、ポリオキシエチレンアルキルエーテル
もしくはポリオキシエチレンフルキル７リールエーテル
の脂肪酸エステル。

（Ｖ）ポリオ斗ジエチレンソルビタンモノラウレート、
ポリオキシエチレンソルビタントリラウレート、ポリオ
キシエチレンソルビタンモノステアレーＦ、ポリオキシ
エチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソ
ルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンペンタエ
リスリトールモ／ラツレート等の、多価アルコール脂肪
酸エステルのポリエチレンオキシド付加物。

（ｖｌ）　　その他、ポリエチレングリコール類、ポリ
オキン工チレンーボリオ斗ジプロピレンブロック共重合
体類、ボリプひピレングリフール１１’。

また、デキストラン硫酸エステルとしては分子量が約５
万〜１００万のものが使われ、その塩としては、ナトリ
ウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が適当である。

ａ−アミラーゼの活性測定用試薬の基本的な成分の一つ
である基質は、前述のような原理によるａ−アミラーゼ
の活性測定を可能にするマルトオリゴ糖またはこれとフ
ェノール類とから形ｒ＆さｈた各種グルコシドの中から
任意に選ぶことができるが、特に適当な基質の具体例と
しては次のようなものがある。

（ｉ）　　マルトオリゴ糖類 マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキ
サオース、マルトヘプタオース等。

（ｉｉ）　　ｐ−二トロフェニルマルトオリゴサイド類
ｐ−二トロフェニルーα−マルトペンタオサイＦ、ｐ−
ニトロフェニル−β−マルトペンタオサイド、ｐ−ニト
ロフェニル−α−マルトヘキサオサイド、ｐ−二トロフ
ェニルーβ−マルトヘキサオサイド、ｐ−ニトロフェニ
ル−α−′マルトヘブタオサイｌ’、ｐ−二トロフェニ
ルーβ−マルトヘプタオサイド等。

（ｉｉｉ）ハロゲン置換二）ロフェニルマルトオリゴｌ
　）”類２−クロルー４−二トロフェニル一〇−マルト
ペンタオサイト、２−クロル・４−二Ｆロフェニルーβ
−マルトペンタオサイト、２−クロル−４ニトロ７Ｉニ
ル−α−マルトヘキサオサイド、２−クロル−４−ニト
ロフェニル−β−マルトヘキサオサイド、２−クロル−
４−二トロフェニルーａ−マルトヘプタオサイド、２−
クロル−４−二トロフェニルーβ−マルトヘプタオサイ
ド、２．６−フクロルー４−ニトロフェニル−α−マル
トペンタオサイ）’、３．５−フクロルー４−二）ｅ７
７ｘニル−α−マルトペンタオサイド、２．６−ジクロ
ル−４−ニトロフェニル−β−マルトヘン９２４Ｎ　ｌ
’、２−７’ロム−４−ニトロフェニル−ａ−マルトペ
ンタオサイド等。

また、いま一つの基本的な成分である追随酵素すなわち
ａ−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼとしては
、いがなる起源のものを用いてもよく、たとえばサツカ
ロマイセス・カルロスベルゲンシス、酵母などから得ら
れたａ−グルコシダーゼや、アーモンドがら得られたβ
−グルコシダーゼを用いることができる。

本発明によるα−アミラーゼの活性測定用試薬には、上
記各成分のほかに、活性測定に必要な池の酵素類、緩衝
剤（ｐＨ６，５〜７．５のらのが好ましい）、抗生物質
、サルファ剤等の化学療法剤、キレート剤（エチレンノ
アミン四酢酸塩等）、安定剤（カルシウム塩など）等を
、用いる基質や検体の種類に応じて適宜配合することが
できる。

本発明によるα−アミラーゼの活性測定用試薬は、非イ
オン界面活性剤など、従来α−アミラーゼの活性測定に
は使われたことのない助剤を含有するが、この試薬を用
いるａ−アミラーゼの活性測定に特殊な操作は不要であ
って、マルトオリゴ糖またはこれとフェノール類とから
形Ｆ＆されたグルコシドをα−アミラーゼの基質として
含有し、α−ググルシグーゼを追随酵素として含有する
従来のα−アミラーゼ活性測定用試薬を用いる場合と全
く同様にして測定を行うことができる。

すなわち、検体と基質との反応と同時に、あるいは反応
前または反応後に、α−グルコシグーゼおよびβ−グル
コシダーゼを非イオン界面活性剤またはデキストラン硫
酸エステル（またはその塩）とともに添加して反応させ
る。そして基質から遊離したグルコースまたはフェ７−
ル類を常法により定量することにより、α−アミラーゼ
の活性を測定する。グルコースを定量する方法としては
、たとえばグルコ−又オキシダーゼを作用させ、生成す
る過酸化水素をパーオキングーセおよび呈色試薬と反応
させ、生成物の吸光度を測定する方法、生成する過酸化
水素を直接、過酸化水素電極を用いる電気的方法により
定量する方法、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ヘ
キソキナーゼ、アデノシン−３−リン酸およびニコチン
７ミド７デニンジヌクレオチドを作用させ、生成する還
元型二フチンアミド７デニンノヌクレオチドの３４０ｎ
１１の吸光度変化を測定する方法などがある。フェノー
ル類を定量する方法としては、遊離したフェノール類が
たとえばｐ−二トロフェノールや０−クロル−ｐ−二ト
ロフェノールの場合は直接吸光度変化を測定する方法が
あり、７エ／−ル類が７二／−ル、２゜６−ジクロロ７
エ７−ル等の場合は、呈色試薬たとえば４−７ミノ７ン
チピリンを添加して酸化縮合させ、生成物の吸光度を測
定する方法などがある。

本発明の試薬は、従来のこの種の試薬と同様、血清、尿
、膵液、だ液などに含まれるａ−７’−ラーゼの活性測
定に広く使用することができる。

一発一明の効果 本発明によるα−アミラーゼの活性測定用試薬は、上述
のように追随酵素によるブランク反応を抑制する作用を
有する非イオン界面活性剤またはデキストラン硫酸エス
テルもしくはその塩を含有させたちのであるから、使用
前の基質分解がほとんどなく安定性にすぐれており、ま
た、これを用いてα−アミラーゼの活性測定用を行うと
きはブランク値が小さく、かつ添加した助剤による妨害
もないから、従来よりも精度の高い測定を行うことがで
きる６ 実施例 以下実施例および実験例を示して本発明を説明する。

実施例　ｌ ５０ｍＭ　ＰＩＦＥＳ”緩衝液（ｐＨ７，０）２−クロ
ル−４−ニトロフェニル−β−マルトペンタオサイトＳ
＋ｓＭ ａ−グルコシダーゼ　　　　　　　　　　　　８０Ｕ／
＋ｓｌβ−グルコシダーゼ　　　　　　　　　　　　Ｉ
ＯＵ／ｍ１ＣａＣ１＝　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１輸ＭＮａＣ１１ｍＭ 縦　ピペラノンーＮ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン
酸）上記の基本組成を有する試薬に第１表記載のとおり
の助剤を添加してα−アミラーゼの活性測定用試薬Ａ−
Ｘを調製した。また対照例として、助剤無添加のもの（
ａ）を用意した。

上記試薬により、血清および尿を検体として、下記の方
法によりα−アミラーゼの活性測定を行なった６３７°
Ｃで５分間加温した試薬３ｍｌを試料２０ｕｌに加えて
反応させ、添加後４分から８分までの直線部を４００ｎ
彌で測定する。追随酵素によるブランク反応を知るため
、水を試料として同様の測定を行う。

各測定例における１分間の吸光度変化を第１表に示す（
検体についての測定値は水を試料としたときの測定値を
ブランク値として除いである。）。

同表から明らかなように、本発明の実施例品を用いた場
合は対照例に比べてブランク値が、少ない場合でも２４
％、最高９２％も低下した。また、助剤による妨害も認
められなかった。

（なお第１表および後記第２表において、ポリオキシエ
チレンアルキルエーテルは日光ケミカルズ社製・ＢＬ−
８ＳＹ、ポリオキシエチレンアルキル７ヱニルエーテル
はシグマ社Ｍ・トリトンＸであり、いずれもアルキル基
の炭素数は不明である。） 実験例 ５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）マルトヘプ
タオース　　　　　　　　　　　　　　１５ｍＭ５ｍＭ
グルツース−６−リン酸酢水素酵素　　　　６Ｕ／＋ｌ
α−グルコシダーゼ　　　　　　　　　　　　８０Ｕ／
噛１へキソキナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　Ｓ
Ｕ／ｍ１ＣａＣ１＋　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１＋５ＭＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１＋ａＭ７デノンンー３−リン酸　
　　　　　　　　　　　　　１ｍＭニコチンアミドアデ
ニンノヌクレオチド　　　　２．５＋＋Ｍ上記の基本組
成を有する試薬に第２表記載のとおりの助剤を添加して
α−アミラーゼの活性測定用試薬Ａ−Ｘを調製した。ま
た対照例として、助剤無添加のもの（ａ）を用意した。

上記試薬について、調製直後および４℃で２４時間保存
後に、３４０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第２
表に示す。

同表から、本発明の実施例品は対照例に比べて保存によ
る吸光度変化が少なく、安定性がすぐれていることがわ
かる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）マルトオリゴ糖の還元性分子末端にフェノール類
   を結合させてなるグルコシドまたはマルトオリゴ糖をα
   −アミラーゼの基質として含有し、α−グルコシダーゼ
   を追随酵素として含有するα−アミラーゼの活性測定用
   試薬において、非イオン界面活性剤またはデキストラン
   硫酸エステルもしくはその塩を含有することを特徴とす
   るα−アミラーゼの活性測定用試薬。
2. （２）追随酵素として更にβ−グルコシダーゼを含有す
   る特許請求の範囲第１項記載の試薬。
3. （３）基質がハロゲン置換ニトロフェニルマルトオリゴ
   サイドである特許請求の範囲第１項記載の試薬。