SE433857B - Forfarande och reagens for bestemning av alfa-amylas - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 7809278-0 godtyckliga metoder, exempelvis med den kända hexokinas-metoden.

Utom maltopentaos har även maltotetraos och maltohexaos föreslagits som substrat (US-PS 3 879 263, Ä 000 0ü2). Därvid erhölls emellertid med tetraosen tydligt sämre resultat än med pentaosen, och med hexaosen uppnåddes ännu sämre resultat än med tetraosen. Så anges för maltotetraosen och -pentaosen ännu-en stökiometrisk reaktion, medan för hexaosen jämnt och nätt tolerer- bara avvikelser från den stökiometriska reaktionen fastställdes.

En nackdel hos maltopentaosen, som även påvisats hos tet- raosen, är emellertid, att ett avsevärt reagenstomvärde förekom- mer, dvs. mätreaktionen sätter igång förrän det för bestämning avsedda provet tillsättes. Härtill kommer, att även detta rea- genstomvärde vid högre substratkoncentrationer icke är konstant, utan förändras under mer än 25 min, förrän konstans hos denna bi- reaktion uppnås. Det visade sig även, att den postulerade skilj- aktíga spjälkningen av maltopentaosen med pankreas-u-amylas och saliv-a-amylas, som hade möjliggjort ett särskiljande, i själva verket icke förelåg (J. BC, šïâ, 3917-5927 (1970), J. Biochem. ål, p. XVIII (1952)).

Till grund för uppfinningen ligger därför uppgiften, att åstadkomma ett förfarande och ett reagens för bestämning av d-amylas, vid vilket förfarande ett substrat användes, som upp- visar en bättre renhet och enhetlighet än de kända substraten, är lätt tillgängligt och med avseende på tomvärde utan serum, varaktigheten av fasförskjutningen Ülag-phase") och uppnåelig maximalaktivitet motsvarar fördringarna. Vidare bör en enkel mätning utan dyr och komplicerad apparatur vara möjlig och läm- pad för snabbdiagnostika, såsom testremsor.

Denna uppgift löses enligt uppfinningen genom ett förfa- rande för bestämning av c-amylas genom enzymatisk spjälkning av ett a-amylassubstrat och mätning av en spjälkningsprodukt, vil- ket förfarande kännetecknas därav, att som substrat användes en förening med den allmänna formeln HQOH GHZOH c o o H 0 on K! O Ho oH on vari R betecknar en glukosid-, fenylglukosid-, mononitrofenyl- 10 15 20 25 30 35 H0 7809278-0 glukosid-, dinitrofenylglukosid-, sorbitol- eller glukonsyragrupp. överraskande nog har det visat sig, att maltoheptaosen har överlägsna egenskaper som substrat för u-amylas, ehuru vid de för detta ändamål redan föreslagna oligomaltoserna från maltopentaos till maltohexaos fastställts en väsentlig minskning av lämplighe- ten, enär därmed erhålles väsentligt sämre resultat än med pen- taosen.- Det kunde därför förväntas, att med en ytterligare för- längning av maltos-oligosaccaridkedjan icke mera tolererbara fel skulle uppträda. överraskande nog erhålles emellertid bättre re- sultat än med pentaosen. Sålunda utgör reagenstomvärdet vid 0,02 ml prov med maltopentaos som substrat 73 Z, med maltoheptaos däremot endast 13 I, räknat på slutvärdet vid bestämning i normal- området.

Dessutom har det visat sig, att i stället för maltoheptaos jämväl vissa maltobeptaos-derivat kan användas, vilka vid inver- kan av a-amylas bildar en derivatiserad spjälkningsprodukt, vilken med synnerlig fördel låter sig bestämmas.

Förfarandet enligt uppfinningen lämpar sig speciellt för bestämning av spjälkningsprodukter medelst 4-glukosidas eller maltosfosforylas.

Vid bestämningen med a-glukosidas och en förening med den allmänna formeln I med R = glukosid vidarespjälkas spjälknings- produkter av maltoheptaos, maltotetraos och maltotrios till glukos och sistnämnda mätes därpå på i och för sig känt sätt.

För mätningen av den bildade glukosen är därvid i närvaro av Q-glukosidas speciellt hexokinasförfarandet att föredraga. cipen vid denna utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen kan âskâdliggöras genom följande reaktionsföljder: maltoheptaos + H20 Éïšmïèšåa maltotrios + maltotetraos maltotrios + 2H2O Ézåšgšgšågêš 3 glukos maltotetraos + 3H2O åïåëgšgšïgšå U glukos 7 glukos + 7 ATP gg-7 glukos-6-P 7 glukos-6-P + 7NAD+ E-É-2239 7 glukonat-6-P+7NADH + 7H+ För denna utföringsform av uppfinningen lämpar sig Prin- isynnerhet de enligt uppfinningen användbara maltoneptaosderiva- ten, alltså de föreningar med den allmänna formeln I, i vilka R icke utgör en glukosidgrupp. Vid inverkan av de båda enzy- merna d-amylas con a-glukosidas avspjälkas substituenten, allt- så en fenylgrupp, mononitrofenylgrupp eller dinitrofenylgrupp resp. den i ändställning stående sorbitol- eller glukonsyrares- 10 15 20 25 30 35 7809278-0 ten, och kan lätt bestämmas. Fenylgrupperna kan förefinnas i d- eller B-ställning. Rör det sig om d~ställningen, så sker avspjälkningen genom inverkan av d-amylas och a-glukosidas en- bart och de avspjälkade, substituerade eller osubstituerade fe- nolerna kan därpå lätt bestämmas genom kända färgreaktioner.

Uppfinningen är emellertid även användbar vid i ß-ställning stående substituenter. I sistnämnda fall användes dessutom för- utom 4-glukosidas jämväl 3-glukosidas. .

Vid dinitrofenylrester kan de båda nitrogrupperna förefin- nas i godtycklig ställning, exempelvis som 2,ü-, 2,6- eller 3,5-substituenter.

De vid avspjälkningen av nitrogrupper innehållande substi- tuenter frigjorda nitrofenolerna resp. dinitrofenolerna är själva färgade föreningar, som utan vidare kan bestämmas optiskt. Av- spjälkas fenol som sådan, så kan denna bestämmas enligt kända me- toder, exempelvis genom omsättning med ett nukleofilt reagens, såsom 3-metyl-6-sulfonyl-benstiazolon-hydrazon-(2) (HSK) Å när- varo av monofenoloxidas; -Vid denna reaktion bildas ett rött färgämne, som kan mätas.

Vid avspjälkningen av sorbitol kan denna t.ex. genom sorbitoldehydrogenas oxideras till fruktos; samtidigt reduceras förefintlig NAD till NADH. Bildningen av sistnämnda kan på känt sätt lätt bestämmas i UV-spektrofotometer. Står en sådan icke till förfogande, så kan genom omsättning med ett tetrazoliumsalt t.ex. INT {2-(p-jodfenyl)-3-(p-nitrofenyl)-5-fenyl-tetrazolium- k1orid} i närvaro av diaforas eller en annan elektronöverförare även bildas en färgad formazan, som kan uppmätas i det synliga omrâdet.

På analogt sätt kan frigjord glukonsyra bestämmas enligt härför kända metoder, t.ex. med glukonat-kinas, 6-fosfoglukonsy- ra-dehydrogenas och NADP, ävensom eventuellt tetrazoliumsalt och elektronöverförare. ' För genomföringen av förfarandet enligt uppfinningen är i allmänhet pH-värden mellan 5 och 9 lämpade. Företrädesvis arbetar man vid pH-värden mellan 7 och 7,5, enär härvid de bäs- ta resultaten och den kortaste reaktionstiden erhålles. Insät- tes enligt uppfinningen nitrofenylföreningar, så är området för väl lämpade pH-värden något mera inskränkt och ligger i regel mellan pH 6 och 8,5. 10 15 20 25 50 35 HO 7809278-0 Som buffertar lämpar sig sådana, som är verksamma inom huvudaktivitetsområdet för de insatta enzymerna. Företrädesvis användes fosfat, HEPES IN-(2-hydroxietyl)-piperazin-N-2-etan- sulfonsyra] och glycylglycin. Föredragna koncentrationer lig- ger mellan 10 och 200 mmol/1.

I allmänhet insättes d-glukosidasen i mängder mellan 0,1 och 5000 U/ml. Det är en speciell fördel vid detta förfarande enligt uppfinningen, att relativt stora mängder av detta enzym kan användas, så att d-amyiasspjälkningen är det hastighetsbe- stämmande steget. i större mängder av detta enzym, men härigenom uppnås icke mera nâgra ytterligare fördelar. A De enligt uppfinningen använda föreningarna med den all- männa formeln I insättes vid testen i allmänhet i mängder mel- lan 0,1 och 250 mmol/l. Att föredraga är mängder mellan 0,5 och 100 mmolll. g Substratmättning av d-amylas med maltoheptaos föreligger Lämpligen användes_därför Det är givetvis även möjligt att insätta ännu vid en koncentration av 8-10 mmol. en minsta koncentration av 8 mmol maltoheptaos, för det fall ar- betet skall ske under betingelser för substratmättníng, vilket i regel är fallet.

Dessutom tillsättes ett aktiveringsmedel för d-amylasen.

Sådana aktiveringsmedel är kända. Att föredraga är natriumklo- rid eller kaliumklorid. o Vid en ytterligare föredragen utföringsform av förfaran- det enligt uppfinningen sker bestämningen av spjälkningsproduk- terna genom omsättning med maltosfosforylas under bildning av glukos-l-fosfat, som därpå bestämmes på i och för sig känt sätt.

Enligt en speciellt föredragen utföringsform sker bestämningen av glukos-1-fosfatet genom omvandling till glukos-6-fosfat me- delst B-fosfoglukomutas, oxidation av det bildade glukos-6-fos- fatet med NAD i närvaro av glukos-6-fosfat-dehydrogenas under bildning av glukonat-6-fosfat och NADH, varvid bildningen av sistnämnda lätt kan följas fotometriskt. Mätsignalen kan ytter- ligare förstärkas genom fortsatt oxidation med NAD i närvaro av 6-fosfoglukonat-dehydrogenas under bildning av ribulos-S-fosfat och en ytterligare molekyl NADH.

Principen för denna utföringsform åskådliggöres av föl- jande reaktionsföljder: 0 maltoheptaos + H20 Éïâæïšëâà maltotrios + maltotetraos-eamaltos 10 15 20 25 30 v35 __.___.._.._.. ...___ 7809278-O maltosfosforflas glukos + 8_glukos_l_P maltos + P03' Q 8-P luM --5--9 glukos-6-P ß-glukos-l-P glukos-6-P + NAD* -Éšggfie giukønat-6-P + NADH + H* gluxonac-6-P + NAD* -ÉÉïë3í> ribuiøs-5-P + NADH 4 H* En fördel vid denna utföringsform av uppfinningen ligger däri, att maltosfosforylasen är mera specifik an.a-glukosídas och därför icke verkar störande på endogen glukos.

Med avseende på bufferten gäller det för utföringsformen av förfarandet enligt uppfinningen med d-glukosidasförfarandet genomförda på samma sätt. a Förutom genom de båda ovan anförda utföringsformerna av förfarandet enligt uppfinningen kan bestämningen av de bildade brottstyckena av maltoheptaos, jämväl maltotetraos, maltotrios med därur bildad maltos även ske enligt andra härför kända me- toder.

~'Ett ytterligare föremål för uppfinningen är ett reagens för bestämning av d-amylas, innehållande ett u-amylassubstrat och ett system för bestämning av en ur d-amylassubstratet genom d-amylas bildad spjälkningsprodukt, vilket reagens kännetecknas däram att substratet består av en förening med den allmänna formeln I. f Ett föredraget system för bestämningen av spjälkningspro- dukterna är ett d-glukosidassystem, som innehåller a-glukosidas, alkaliklorid och buffert. Består substratet av maltoheptaos som sådan, så erfordras som enzymer.dessutom hexokinas (HK) och glukos-6-fosfat-dehydrogenas (GÖPDH) ävensom NAD, ATP och magne- sium. _ Företrädesvis består ett reagens på basis av d-glukosi- dassystemet av 5 x 105 till 5 x 10” U/1 u-gluxosiaas, 103 till 5 x lo" _U/I _Hx, i 103 till 5 x 10" U/I* ç6PDH, 0,5 till 8 mm/1 NAD, 0,5 :ill 5'mM/1 Are, 1 till 3 mm/1 Mga* 25 till ioo mn/1 Nacl eller Kcl, 25 till zoo mm/1 buffert,pH 6,2 ci11 7,8 och 5 till 100 mn/1 malconeptaos eller en mångfald eller bråkdel därav, i torr eller löst form. 10 15 20 25 30 35 H0 7809278-0 Enligt en annan föredragen utföringsform består reagenset av a-glukosídas, KC1 eller NaCl, buffert och substrat. Ett så- dant reagens innehåller isynnerhet_102 till 5 x 106 U/1 a-gluko- sidas, 1 till 100 mmol/1 NaCl eller KCl, 10 till 250 mmol/1 buffert, pH 5 till 9, och 0,1 till 250 mmol/1 maltoheptaosderivat med den allmänna formeln I, beroende på koncentrationen i testen. Bea- genset kan föreligga i torr, isynnerhet lyofiliserad form, eller i form av en lösning, som blandning med alla beståndsdelar eller med separata sådana. ' Enligt en ytterligare utföringsform innehåller ett rea- gens enligt uppfinningen av ovan anförda slag dessutom 8-gluko- sídas eller/och fenoloxidas och HSK.

Enligt ytterligare en utföringsform av uppfinningen inne- håller reagenset enligt uppfinningen förutom d-glukosidas, NaCl eller KCl, buffert och substrat dessutom sorbitoldehydrogenas och NAD eller glukonat-kinas, ATP, 6-fosfoglukonsyra-dehydrogenas och NADP ävensom eventuellt ett tetrazoliumsalt och diaforas resp. fenazinmetosulfat (PMS). J Ett föredraget reagens av detta slag-innehåller l x 102 till till 3 X iob U/1 d-glukosidas, 2 x 105 till 5 x 10" U/1 sorbitoi- dehydrogenas, 1 x 103 till 5 x 10u U/1 hexokinas, 0,5 till 50 mmol/1 ATP, 10 till 500 U/l diaforas (Chlostridium Kluyveri), 0,01 till 0,5 mmol/1 tetrazoliumsalt, 0,1 till 10 mmol/1 NAD, 0,2 till 5 mmol/1 MgC12, 0,5 till 20 mmol/1 maltoheptit, 1 till 100 mmol/1 NaCl eller KCl och 10 till 250 mmol/1 buffert, pH 5,5 till 8,5. 1 Eventuellt ingår dessutom ett icke joniserande ytaktivt medel i en mängd mellan 5 och 50 mmol/1.

Ett jämväl föredraget reagens innehåller 100 till 3 x 106 U/1 d-glukosidas, 10 till l0u U/1 6-fosfoglukonatdehyd- rogenas, 20 till 2 x 104 U/1 glukonat-kinas, 0,5 till 25 mmol/1 ATP, 0,05 till 1,0 mmol/1 NADP, 1,0 till 20 mmol/1 maltohepta- glukonsyra, 0,5 till 5 mmol/1 MgC12, 1 till 100 mmol/1 NaCl och 10 till 250 mmol/1 buffert, pH 5,5 till 8,5.

Ytterligare ett reagens enligt uppfinningen innehåller 0,1 till 250 mmol/1 d-nitrofenyl-maltoheptaosid eller dinitro- fenyl-maltoheptaosid, . _ 1 X 102 :iii 2,5 x 106 u/1 4-giukosiaas, 1 till 100 mmol/1 natriumklorid eller kaliumklorid och 10 till 250 mmol/1 fosfatbuffert, pH 7,0 till 8,0. 10 15 20 25 50 35 NO 7809278~Û Vid ännu en utföringsform innehåller reagenset enligt upp- finningen: ' 0,1 till 250 mmol/l u-fenylmaltoheptaosid, 1 X 102 t111 1,5 x 105 U/1 0-glukosiaas, 10 till 105 U/l monofenoloxidas, 0,1 till 10 mmoi/1 HSK, l till 100 mmol/l NaCl eller KCl och 10 0111 250 mm01/1 buffert.

Ett annat föredraget system för bestämning av spjälknings- produkterna är maltosfosforyiassystemet, vilken väsentligen be- står av maltosfosforylas, B-fosfoglukomutas (ßPMG), gluk0sÅ6- fosfat-dehydrogenas (G6PDH), glukos-1,6-difosfat (GlL6DP), NAD, buffert, maltoheptaos och eventuellt 6-fosfoglukonat-dehydroge- nas (SPGDH). ' ' Ett speciellt föredraget reagens med detta påvisningssys- tem består av - 0,5 x 103 till 20 x 103 U/l maltosfosforylas, 1 x 102 0111 1 x 10“ ß~PG1uM, ' 2 x 102 t111 3 x 10" 0/1 g10kos-6-fosfat-aenyarogenas, 0,5 till 10 mmol/1 NAD, 0,001 till l mmol/l glukos-1,6-difosfat, 0,5 t111 100 nmnl/1 buffert, pH 6,0 c111 1,5, 5 till 50 mmol/1 maltcheptaos och eventuellt 1 x 102 1111 1 x 10" U/1 6-fasfogiukønat-eenyarogenas.

Reagenset enligt uppfinningen kan föreligga i torr eller löst form, och det kan även föreligga impregnerat på en bladfor- mig bärare, t.ex. en folie, ett absorberande papper eller lik- nande. I sistnämnda fall består det lämpligen av minst tre skikt resp. lager, varvid ett första skikt innehåller substra- tet, det andra skiktet tjänstgör som spärrskikt och det tredje skiktet innehåller systemet för bestämning av spjälkningsproduk- terna. Bringas ett sådant, av flera skikt bestående reagensmate- rial, som lämpar sig för en enkel snabbtest på 0-amylas, i berö- ring med ett flytande d-amy1ashaltigt_prov, så spjälkar d-amyla- sen substratet och brottstyckena diffunderar genom mellanskíktet in i det tredje, bestämningssystemet innehållande skiktet. Som påvisningsreaktion användes i detta fall lämpligen en färgbildande reaktion, som genom den uppkommande färgningen visuellt synliggör koncentrationen av d-amylasen, för det fall spjälkningsprodukter- 10 15 20 25 30 35 40 ._..--..-...\........ _. . _. 7809278-o na icke som sådana är färgade.

De enligt uppfinningen använda maltoheptaos-derivaten kan framställas enligt olika metoder. För så vitt det rör sig om fenylerade derivat, kan såväl kemiska som även enzymatiska metod- der användas. Den kemiska syntesen baserar sig principiellt på omsättning av peracetylerad maltoheptaos med motsvarande fenol i närvaro av en Friedel-Crafts-katalysator. Denna metod lämpar sig såväl för fenol som sådan som även för mononitrofenol och dinitrofenol. Alternativt är det även möjligt att först fram- ställa fenylderivatet och därpå nitrera detta, ttex. enligt det i Bull. Chem. Soc. Japan âï, 718 (1961) beskrivna förfarandet.

Denna metod lämpar sig isynnerhet för mononitro-derivatet, var- vid vid behov en separering av de bildade o- och p-nitrofenylde- rivaten kan genomföras.

Företrädesvis genomföras denna omsättning genom smältning eller kokning under återflöde i opolära lösningsmedel med ZnCl2, SnCl¿ eller Ticlu som Fridel-Crafts-katalysator. Efter införingen av fenolen resp. nitrofenolen avspjälkas skyddsgrup- perna på i och för sig känt sätt, exempelvis med natriummetylat, ammoniak, KOH eller bariummetoxid, eventuellt i metanolisk lös- ning, med vattenhaltig bariumhydroxidlösning osv.

Den enzymatíska framställningen av fenylderivaten sker genom transglukosidering av fenylglukosid resp. motsvarande nitrerade fenylglukosider med d-cyklodextrin, amylas eller lös- lig stärkelse i närvaro av en specifik mikrobiell transferas.

Företrädesvis användes härför en transferas från Bacillus macerans. Därvid kan för denna transglukosidering användas den kända amylasen från Bacillus macerans EE.C. 2.4.l.l9. DSM Zü; isolering: J.A. de Pinto, L.L. Campbell, Biochemistry 1; 114 (l968); Transfer-reaction: Methods in Carbohydr. Chemistry, vol II, 3473, vilken förutom en hydrolytisk och cykliserande ver- kan uppenbarligen även har en glukosyltransfererande verkan.

Samma förening med formeln I, i vilken R betecknar en sorbitol-grupp, kan framställas ur maltoheptaos genom reduktion med natriumborhydrid (NaBHu) under milda betingelser.

Föreningen med formeln I, vari R betecknar en glukonsyra- grupp, kan slutligen på kemisk eller enzymatisk väg enligt känd metodik användas för framställning av glukonsyra ur maltoheptaos, t.ex. genom oxidation med brom (Methods in Carbohydr. Chemistry, voi. II, 13).

UI 10 15 20 25 30 35 HO 7809278-Û 10 Som redan anförts, åstadkommas genom uppfinningen icke endast ett snabbt och specifikt förfarande för bestämning av u-amylas, utan isynnerhet elimineras fasförskjutningen helt eller i vittgående grad, vilket är av speciell betydelse vid an- vändning av förfarandet på analysautomater. Dessutom kan förfa- randet enligt uppfinningen genomföras i flera utföringsformer utan komplicerade apparaturer och lämpar sig därför isynnerhet för snabbdiagnostika och för optisk bestämning i det synliga om- rådet. Samtidigt kan de olika utföringsformerna av förfarandet enligt uppfinningen även bestämmas med UV-mätapparatur. Ytter- ligare fördelar är sträng proportionalitet och ingen störning ge- nom kemiskt likartade ämnen i blodet.

De enligt uppfinningen insatta substratetn är lätt och med stor renhet tillgängliga. Ett enkelt förfarande för fram- ställning av maltoheptaos har beskrivits i den tyska patentansök- ningen P 27 Ål 191.2. Förfarandet lämpar sig för bestämning av d-amylas i biologiska vätskor, såsom serum, heparinplasma,urin och och dylikt, eller i andra flytande eller fasta material.

Följande exempel åskådliggör uppfinningen.

Exempel l. Maltogen metod (a-glukosidas-system) En reagensblandning, som innehåller d-glukosidas,G6PDH,c HK, NAD, ATP, maltoheptaos, Mg2+, NaCl och fosfatbuffert, löses i 2,0 ml destillerat vatten. Reagensets hållbarhet vid rumstem- peratur utgör ca l h, vid temperaturer under 8°C 6 h.

Den erhållna lösningen visar följande reagenskoncentra- tioner: fosfatbuffert 50 mmol/l; pH 7,0 NaCl g 50 mmol/l Mg2+ _ 2_mmo1/l g É maltoheptaos lO mmol/l É ATP 1,2 mmsi/1 É NAD 2 mmoi/1 ' HK :š2 U/1 _ l G6PDH ' ie: U/1' - I a-glukosidas ålO U/1 i e - Lösningen försättes vid 25°C med 0,02 ml serumprov, in- _ föres i en kyvett med l om skikttjocklek och därpå bestämmas É extinktionen vid Hg 365 nm, BRO nm eller Hg BBH nm i en foto- Efter 10 min avläses extinktionen och därpå upprepas avläsningen fem gånger med en min mellanrum; meter. 10 15 20 25 BO 7809278-0 ll Ur de så bestämda extinktionsdifferenserna per min (AE/min) bildas medelvärdet,reagenstomvärdet subtraheras och det korrigerade värdet insättas i beräkningen.

Beräkningen sker på följande sätt: u/1 25°c = uzßn X AE 365 nm/min = 2290 x AE SÄO nm/min = 2355 x AE 534 nm/min På ritningen visar fig. l resultaten av en utspädnings- serie av humanserum med fysiologisk koksaltlösning, vilka resul- tet erhållits med ovan anförda metod.

Uppdelas reagenset på två charger av vilka den ena inne- håller maltoheptaosen och den andra en blandning av alla övriga reagenser, så kan hållbarheten hos de därmed beredda lösningarna förhöjas. Den utgör för blandningen med reagenserna vid tempe- raturer till 8°C 30 h, vid rumstemperatur ca 8 n. Maltoheptaos- lösningens motsvarande hållbarhet utgör 6 veckor resp. ca l vecka.

Exempel 2. Bestämning med maltosfosforylas-system Två reagenser framställdes, vilka består av amylassubst- rat och maltosfosforylas-system. Det ena reagenset innehåller r maltoheptaossubstrat, det andra löslig stärkelse enligt tekni- kens ståndpunkt. Reagenskoncentrationen var efter upplösning i vatten följande: Enligt uppfinningen Jämförelse Fosfatbuffert 20 mM; pH 6,5 20 mM; pH 6,5 NAD 2mM* emm Maltoheptaos 10 mM - Löslig stärkelse e - 5 mg/ml Glukos-1,6-difosfat spår spår Maltosfosforylas 3 U/ml 3 U/ml (Mikroorg.) G6PDH (Leuconostoc mesenteroídes) 9 U/ml 9 U/ml GPGDH (Leuconostoc mesenteroides) 1 U/ml 1 U/ml Den erhållna lösningen inkuberas vid 3000, försättes med provlösningen och bestämmas i en fotometer med extinktionsdiffe- Efter 10 min förínkubering mätes extink- tionsdifferensen under 10 min. För 2,0 ml reagens och 0,19 ml prov användes därpå följande beräkningsformel â¿%3ššl%2g-ï-5:5 = AE/min x 1699 U/l 3 I rensen vid Hg 534 nm.

AE/min x 10 15 20 e gå 30 35 40 e7809278-Û 12 Vid insättning av fem olika humansera erhölls med ovan anförda reagens följande värden: Serum Enligt uppfinningen Stärkelse l 37,4 U/1 15,3 U/l 2 61;2 U/1 27,3 U/1 3 95,1 U/1 39,1 U/l H 11k U/1_ uu,2 U/1 5 BYÅ U/1 151 U/l Exempel 3. Framställning av d-fenylmaltoheptaosid a) Tridekosacetyleß-D-maltoheptaos 57,6 g (50 mM) maltoheptaos och Ål g (500 mM) vattenfritt natriumacetat suspenderas i SU3 ml.(5,75 mol) ättiksyraanhydrid och omröres kraftigt U h'vid l00°C under.uteslutning av fuktighet.

Efter avkylning till ca 60°C inröres i ca l liter isvatten och omröringen fortsättes under en natt vid H°C, varvid en seg, halvkristallin massa utfaller. Efter avhällning av den över- stående vätskan hopröres återstoden åter med isvatten. Därvid ikristalliserar produkten, som separeras, tvättas och torkas.

Utbyte 80,7 g (76 % av teoretiskt utbyte) färglösa kristaller. (d3âT = + 157,5° (c = 1,15, klorøform), smäitpunkc 15o°c (eskarp).

Moderluten (det avdekanterade) indunstas i vakuum till torrhet och återstoden rives med isvatten och bringas till kris- tallisering. Z Utbyte 22,3 g. _ _ {«3§T = + 156° (Q 1, kioreform), smältpunxt 15o°c.

Totalutbyte l03 g 97 1 av teoretiskt utbyte.

Produkten kan omkrístalliseras ur etanol, varvid även efter flerfaldiga omkristalliseringar smältpunkt och vridnings- vinkel icke ändras. Produkten är därför optisk: enhetlig: (E) konfigurerad vid Cl-atomen. ' b) Dodekosacetyl-d-fenyl-D-maltoheptaosid 9,54 g (D,5 mM) tridekosacetyl-B-D-maltoheptaos, 0,61 g (u,5 mm) nysmält znclg och h,25 g (45 mm) aescillerad fenoi omrördes under uteslutning av fuktighet 2,5 h vid l00°C. Där- på löses reaktionsprodukten ännu som varm i etylacetat och tvät- tas med 2 x 100 ml H20, 3 X 100 ml 1 n NaOH, 100 ml l n ättik- syra och 100 ml mättad NaCl-lösning. Den till en början bruna lösningen blir därvid ljusgul. Efter torkning över MgSOu in- dunstas till torrhet och upptages i varm metanol (30 ml).y Efter stående över en natt avskiljer sig ett sirapsartat material, som u; u 10 15 20 30 H0 7809278-0 15 kristalliseras ur etanol.

Utbyte 8,7 g (90 2 av teoretiskt utbyte). Smältpunkt 155-16500 (sönderdelning). [d}šT = + lU7° (c = 8 i kloroform). c) Fenyl-d-D-maltoheptaosid 10,8 E (5 mM) peracetyl-l-fenyl-d-D-maltoheptaosid löses i 200 ml varm absolut metanol och försâttes vid rumstemperatur under tillsats av litet dioxan under omröring med 30 ml 0,l n natriummetylat och omröres 16 h vid rumstemperatur. Efter 20 min börjar produkten avskiljas i halvkristallin form. Slutligen tillsättes 200 ml aceton, avkyles till 4°C och avsuges. Produk- ten löses i vatten (160 ml), avfärgas med aktivt kol och satsen avsaltas med katjonbytare ("Dowex 50 H+").

Utbyte 5,6 g (91 1 av teoretiskt utbyte) färglöst lyofilisat. í«)§T = + 176° (C = 10 1 H20). ' 0 Produkten innehåller ännu något fri maltoheptaos och - el- ter HPLC-analys (bestämning vid 254 nm) - dessutom 2 UV-positiva föroreningar. Dessa separeras genom kromatografi medelst tvär- bindningsbundet dextran ("Sephadex LH20") med vatten som elue- ringsmedel. g Exempel U. Framställning av p-nitrofenyl-d-D-maltoneptaosid a) Peracetyl-p-nitrofenyl-d-S-maltoheptaosid 13,6 g (20 mM) peracetyl-maltoheptaos, som framställts enligt exempel l a), löses med ll,9 g (100 mM) p-nitrofenol i 90 ml absolut bensen och försattes under omröring och uteslut- ning av fuktighet med l0,H g = 4,5 ml (H0 mM) SnClu. Därvid avskiljes en voluminös massa, som dock åter löser sig vid upp- värmning. Det hela kokas l h under återflöde. Vid avkylning avskiljes en seg massa, som efter tillsats av 80 ml etylacetat åter går i lösning.i Vid inrörning av lösningen i 180 ml 2 n Na2CO5-lösning avskiljes_tennoxidhydrat. Detta separeras under tillsats av litet aktivt kol. Den vattenhaltiga fasen separeras och den organiska fasen tvättas omsorgsfullt, till slut med mät- tad NaCl-lösning. Efter torkning och indunstning av lösningen erhålles en nartsartad produkt som omkristalliseras ur etanol. utbyte 6,2 g (M1 z av teoretiskt utbyte). smäitpunkt 1oo°c (sönderdelning). ' {a]gT = + 13l° (c = 1 i kloroform).

Produkten erhålles även, när reaktionen genomföras i klo- roform eller med TiClq i stället för SnCl¿. 10 15 20 25 30 35 7809278-0 lß b) p-nitrofenyl-d-D-maltoheptaosid 5,5 g_(7 mM) peracetyl-p-nitrofeny1-maltoheptaosid upp- slammas i 100 ml absolut metanol och försättes med 5 ml ca l n natriummetylat-lösning. Utgångsmaterialet blir honungsartat och löser sig långsamt. Efter någon tid börjar den avacetyle- rade produkten att avskilja sig i kristallin form, och efter om- röring över en natt äravskiljningen fullständig. Produkten av- suges, tvättas med metanol och torkas.

Utbyte 2,8 g (86 % av teoretiskt utbyte). fal? = + 121+° (c = 0,6 i H20). ' _ Produkten renas med tvärbindningsbundet dextran ("Sephadex LH20") med vatten som elueringsmedel. Därvid erhål- les 1,2 g (H5 %) av ovan angivna förening, som är aktiv i enzy- matisk test. Dessutom erhålles föreningen genom nitrering av d-fenylmaltoheptaosid enligt exempel 1 med nitrersyra enligt Bull. Chem. Soc. Japan 23, 718 (1961).

Under användning av dinitrofenol i stället för mononitro- fenol erhålles motsvarande dinitroderivat.

Exempel 5. p-nitrofenyl-N-maltooligosackarid genom enzymatisk syntes med Bac. macerans-amylas (E.C.2.U.l.l9 ur Bac. macerans DSM 2H) Bacillus macerans-amylas har förutom hydrolytisk och cyk- liserande verkan även glukosyl-transfererande egenskaper, vilka kan användas för syntes av oligosackarider och Éderívat (Methods in Carbohydrate Chemistry II, BH7). För syntesen av p-nitro- fenyl-oligosackarider optimerades detta förfarande på följande sätt:, _ 680 mg Bacillus macerans-amylas (E.C.2.U.l.l9 ur Bac. macerans DSM 2H)(lyofilisat) (0,ß6_U/mg invägning, proteinhalt av invägningen 28,5 1, fri från p-nitrofenyl-d-D-glukosid-spjäl- kande aktiviteter), 400 mg d-D-p-nitrofenylglukosid, 3,5 g d-cyklodextrin, och 70 ml Sörensen-fosfatbuffert, pH 6,2; 0,01 M blandades.

Satsen inkuberades 2H h vid 37°C. För rening-separerades därpå d- och bildad 8-cyklodextrin närmast över tetrakloretylen-inne- slutníngsförening. Efter kromatografi medelst tvärbindningsbun- det dextran ("Sephadex LH20“) erhölls 50 mg lyofilisat av i amy- lastest högaktiv p-nitrofenyl-maltoheptaosid. lO 15 20 25 30 55 H0 7809278-0 15 Exempel 6. Framställning av maltoheptait l0 g maltoheptaos löses i 50 ml H20. Därtill sättes por- tionsvis 2 g NaBHu och omröres 75 min vid rumstemperatur (prov på reducerat socker negativt). Genom kromatografi medelst kat- jonbytare (“Dowex 50 H+“) avlägsnas Na+ (lösningens pH efter utbytespassage 3,5). Genomflödet indunstas i vakuum och uppta- ges flera gånger med metanol/vatten (vattentillsats till produkt~ lösningen) och indunstas därpå för avlägsnande av borsyra som metylester. Den till slut neutrala lösningen lyofiliseras.

Utbyte 9 g (90 % av teoretiskt utbyte) fritt från-reduoerande socker.

Halt (bestämd på enzymatisk väg) ur glukos 86,1 Z ur sorbitol 89,0 z vatten 8,5 Z Exempel 7. Framställning av maltoheptonsyra 11,5 g (0,0l mol) maltoheptaos och 6 g Ba-bensoat införes i 150 ml vatten. brom och därpå omröres ännu 36 h. tet brom genom kväve tillsättes H ml U n H2SOu och något aktivt kol, varpå filtreras och filtratet extraheras med kloroform för avlägsnande av bensoesyran. Den vattenhaltiga lösningen försät- tes med 3,2 g Ag2CO3 och omröres (pH neutral reaktion). Olösliga salter avfiltreras och den klara lösningen får passera genom 20 ml "Amberlite JR H+". Det sura eluatet neutraliseras omedelbart med Na0H och lyofilieras. _ Utbyte 8 g (72 % av teoretiskt utbyte).

Under omröring och kylning tillsättes 1 ml Efter avdrivning av överskot- Halt (bestämd på enzymatisk väg) ur glukos 85 % ur glukonsyra 80 1 vatten 9,3 % Exempel 8. Påvisning av d-amylas med fenyl-a-maltoheptaosíd som substrat Fenyl-a-maltoheptaosid spjälkas av d-amylas i fenyl-d- -maltotriíd eller -tetraid, som genom &glukosidas omsättes till Den frigjorda fenolen kopplas genom monofenol- oxídas oxidativt med ett nukleofilt reagens i form av 3-metyl- 6-sulfonyl-benstiazolon-hydrozon-(2) (HSK) till ett rött färgäm- ne, vars bildningshastighet är proportionell mot amylasaktivite- ten i provet och fotometriskt kan följas. fenol och glukos.

Testprincip: t l. a) fenyl-u-maltoheptaosid + H20 š:ÉEš9~fenyl-d-D-tri- l0 15 20 25 30 55 7809278-0 16 (tetra)~glukopyranosíd + maltotetra-(tri)-os b) fenyl-u-pftrí-(tetra)-glukopyranosid'+ 3 (U) H20 Eïsšëïgåšgââè fenol + 3 (4)_glukoš I c) fenol + Hsx + 02 9939É399l95šÉë§>- färgämne + 2 H20 Mätbetingelser: 25°C, mätvåglängd H92 nm, l cm kyvetter; reagenssammansättningen framgår av följande tabell.

TABELL _ _ ggggens Koncentration i test Fosracbuffert, pfl 7,0 0,05 mal/1 Natriumklorid 0,05 mol/1 Fenyl-d-D-maltoheptaosíd 10 mmol/l Hsx - i 1 mmul/1 Mcnofenoloxídas 1 U/ml d-glukosídas 10 U/ml Testvolym: 2,0 ml I stället för fosfatbuffert visade sig även glycin-, gly- cylglycín-, hepes-, tris~, tra- och andra buffertar vara tjänliga.

Exempel 9. Bestämning av d-amylas med p-nitrofenyl-maltoheptaosid Testprincip: p-nitrofenyl-d-maltoheptaosíd Éïâmlšëâa (glukos)n + p-nitrofenyl-d4(glukos)m gïsšaëgšigââë n glukos + p-nitrofenol. e 7 Efter spjälkningen av maltoheptaosideg nedbrytes spjälk- ningsprodukterna till glukos och p-nitrofenol. Därvid är p-nitrofenolat-anjonen i alkalisk lösning gulfärgad och kan därför direkt optiskt mätas.

Testsystem: Reaktionsblandning: 50 mM/l fosfatbuffert, pH 7,4 50 mM/l natriumklorid 5 till 50 U/ml d-glukosidas 5 resp. 10 mM/l p-nitrofenyl-d-malto- heptaosíd Testsats: 1 ml reaktionsblandníng + 50 /ul prov (serum) Temperatur: 30°C våglängd: H05 nm Serumstart efter fippnående av mättemperatur (10 min förinkuba- tion). 10 20 25 30 35 17 7809278-0 Exempel 10. 0-amylas-bestämning med maltoheptit Testprincip: _ Maltoheptait + H20 5:ÉmïšÉ§>maltotriit + maltotetraos Maltotriit + H20 5:5l352§¿Éâ§+ sorbitol + maltos ;»@iu81+-NAD* ÉEÉ; fruxcos + NADH + H* NADH + :NT + H* É¿ëÉ93åïa formazan + nA0*e SDH = sorbitoldehydrogenas.

Testsystem: Reaktionssats _ E10 Koncentration i test Na-(K-Püä-buffert 0,02 mol/1 1,92 12,8 mmol/1 P0” +Tr1ton 100 2 ml/100 ml + NaCl 10 mmol/1, pH 6,9_ 6,ü mmol/1 MgC12 0,3 mol/1 0,01 1,0 mmol/l Maltoheptit 100 mmol/l 0,10 3,3 mmol/l NAD c = HO mg/ml 0,05 1,0 mmol/1 INT c = 0,6 mg/l . 0,20 0,09 mmol/1 Diaforas.(C1ostridíum Kluyverí) 0,05 167 U/1 5 mg/ml* ATP c = 50 mg/ml 0,10 3,29 mmol/1 Hexqkinas 280 U/ml* 0,05 M666 u/1 snu 180 U/ml* 0,30 18000 u/1 0-gluxosiaas 1120 U/ml* 0,20 74670 0/1- Prov (serum) I 0,02 + i testbuffert , , Start genom provtillsatsz mätning sker vid 492 nm; temperatur: 2500 Exempel 11. u-amylasbestämning genom maltoheptaglukonsyra Testprincip: _ L ' d-amylas - maltoheptaglukcnsyra + H20 ----4? maltotrloglukonsyra + maltotetraos maltotrioglukonsyra + H20 filåšgšgšigâša glukonsyra + maltos å1Uk°nSYPa+ ÅTP ššgkggëšïšigââë glukonsyra~6-P + ADP . _ .. + 6-fosfo luk ' - .. _ slUhOfl=yPa-6-P + NADP °“SY”a rlnulos-8-P+fnoPH+c0, + H* dehydrogenas _ Testsystem: Reaktionssats: gl Koncentration i test Na-/K-P0 -buffert 0,02 mol/l 2,19 lä,6 mmol/l fosfat, + NaCl 1 mmol/1, pH 6,9 7,3 mmol/l NaCl Mgclz 1 mel/1 _ 0,01 3,3 mmol/1 Maltoheptaglukonsyra 0,10 5 mmol/1 150 mmol/1 NADP c = 10 mg/ml 0,10 0,38 mmol/1 7809278-0 18 Reaktíonssats= Q; Koncentration i test ATP c = 50 mg/ml. 0,10 2,7 mmol/l Glukonat-kinas 40 U/l 0,03 7 1066 U/1 6-fosfoglukonsyra-dehydro- 0,10 800 U/l genas 2U U/l 0-glukosidas 1120 u/ml 0,30 0 11,2 X 1o“ U/1 Prov (serum) 0,02 Start genom provtillsats, mätning sker vid'3H0 nm eller 365 nm Temperatur: 25°C, testvolym: 3,00 ml. J

Claims (1)

1. 780-9278-0 59 Patentkrav

   1. Förfarande för bestämning av d-amylas genom enzymatisk spjälkning av ett d-amylassubstrat och mätning av en spjälknings- produkt, k ä n n e t e c k n a t därav, att som substrat använ- des en förening med den allmänna formeln CHZOH _ oH2OH SU vari R betecknar en glukosid-, fenylglukosid-, mononitrofenyl- glukosid-, sorbitol- eller glukonsyragrupp.

   2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att spjälkningsprodukterna genom d-glukosidas överföras till glukos och att denna bestämmes på i och för sig känt sätt.

   3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n_e t e c k n a t därav, att man arbetar vid pH-värden mellan 5 och 9. U. Förfarande enligt krav 2 eller 3, k ä n n e t e c k - n a t därav, att 0,1 till 250 mmol/1 förening med formeln I ínsättes. J I

   5. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t därav, att vid en i ß-ställning ståen- de substituent vid sockerresten av gruppen R därjämte användes B-glukosidas. _

   6. Förfarande enligt krav l, k ä n_n e t e c k n a t därav, att spjälkningsprodukterna omsättes medelst maltosfosfo- _rylas under bildning av glukos-l-fosfat och att det sistnämnda bestämmas. _

   7. Förfarande enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att för bestämning av bildat glukos-1-fosfat detta med fosfoglukomutas omvandlas till glukos-6-fosfat och att med sist- nämnda NAD i närvaro av glukos-6-fosfat-dehydrogenas reduceras till NADH, som mätes.

   8. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e - t e c k n a t därav, att när R är en fenylglukosidgrupp, avspjäl- kad fenol med 3-metyl-6-sulfonyl-benstiazolon-hydrazon-(2) be- stämmes i närvaro av monofenoloxidas.

   9. Förfarande enligt något av krav 1-7, k ä n n e t e c k- n a t därav, att när R är en sorbítolgrupp, avspjälkad sorbitol 07809278-0 ' 0,5 till 5 mmoi/1 ATP, lv bestämmes med sorbitol-dehydrogenas och NAD.

   10. Förfarande enligt något av krav l-7, k'ä n n e - t e c k n a t därav, att, när R är en glukonsyragrupp, avspjäl- kad glukonsyra bestämmes med glukonat-kinas, 6-fosfoglukonsyra- dehydrogenas och NADP. 7 ll. Forfarande enligt krav 9 eller 10, k ä n n e t e c k- n a t därav, att vid reduktíonen av NAD bildad NÄDH omsättes med ett tetrazolíumsalt i närvaro av en elektronöverförare till formazan och att sistnämnda bestämmes.

   12. Förfarande enligt krav ll, k ä n n e t e c k n a t därav, att som elektronöverförare användes díaforas resp. É fenazinmetosulfat.

   13. Reagens för bestämning av d-amylas, innehållande ett u-amylassubstrat oçh ett system för bestämning av en ur amylas- substratet genom 4-amylasen bildad spjälkningsprodukt, k ä n - n e t e cfk n a t därav, att substratet består av en förening med den allmänna formeln 7 CHZOH O \\ OH H0 OH vari R är en glukosid-, fenylglukosid-, mononitrofenylglukosíd-, sorbitol- eller glükonsyragrupp. 142 Reagens enligt krav 13, bestående av' a-glukosidas, hexokinas, glukos-6-fosfat-dehydrogenas, NAD, ATP, Mg, NaCl. fosfatbuffert och maltoheptaos som substrat. 1 15, Reagens enligt krav 14, k ä n n e t e c k n a ti där- av,att det består av 5 X 103 till 5 X 10" u/1 «-giuxosidas, 103 till 5 X 10" U/1 nexoxinas, 103 till 5 x l0u U/l glukos~6-fosfat-dehydrogenas, 0,5 till 8 mmol/l NAD, 3 1 till 5 mmoi/1 Mg2*, 25 till 100 mmol/l NaCl eller KCl, 25 till 100 mmol/l buffert, pH 6,2 till 7,8, och 5 till 100 mmol/1 maltoheptaos eller ' en mångfald eller bråkdel därav i torr e1ler_löst form. 7809278-Û 11

   10. Reagens enligt krav 13, bestående av _ maltosfosforylas, ß-fosfo~gluko-mutas, glukos-6-fosfat-dehydro- genas, glukos-1,6-difosfat, NAD, buffert, substrat och even- tuellt 6-fosfo-glukonat-dehydronegas, k ä n n e t e c k n a t därav, att substratet består av maltoheptaos.

   17. Reagens enligt krav 16, k ä n n e t e c k n a t där- av, att det består av 0,5 x 105 till 2 x 10" u/1 maiuos-rosforylas, l x lo2 till 1 x 10” U/1 ß-fosfo-gluko-mutas, 2 x 102 till 3 x l0u U/1 glukos-6-fosfat-dehydrogenas, 0,5 till l0 mmol/1 NAD, 0,001 till 1 mmol/1 glukos-1,6-difosfat, 0,5 till 100 mmoi/1 buffert, pa 6,0 till 7,5, 5 till 50 mmol/1 maltohepcaøs ' och eventuellt 1 x 102 till 1 x 10

   13. Reagens enligt krav 13, k ä n n e t e c k n a t där- Ä U/1 6-fosfo-glukonatedehydrogenas. av att reagenset består av a-glukosidas, NaCl eller KCl, buffert och förening med den allmänna formeln I.

   19. Reagens enligt krav 13 eller 13, k ä n n e t e c k - n a t därav, att det innehåller 102 till 5 x 106 U/1 d~glukosi- das, I l till 100 mmol/l NaCl eller KCl, 10 till 250 mmol/l buffert, pH 5 till 9, och 0,1 till 250 mmol/1 förening med den allmänna formeln I, med be- aktande av koncentrationen vid testen. I 20. Reagens enligt något av krav 13, 18 eller 19, k ä n - n e t e c k n a t därav, att det dessutom innehåller ß-glukosi- das eller/ochifenoloxidas och 5-metyl-6-sulfonyl-bensitazolon- hydrazon-(2).

   21. Reagens enligt något av krav IS eller 18 till 19, k ä n n e t e'c k n a t därav, att det dessutom innehåller sor- bitol-dehydrogenas eller glukonat-kinas och öefosfoglukonsyra- dehydrogenas ävensom NAD. 22ïReagens enligt krav 21, k ä n n e t e c k n a t där- av, att det dessutom innehåller tetrazoliumsalt och diaforas eller PMS.

   23. Reagens enligt krav 21 eller 22, k ä n n e t e c k - n a t därav, att det innehåller ett ytaktivt medel.

   34. Reagens enligt något av krav 13-23, k ä n n e t e c k- n a t därav, att det föreligger impregnerat eller inkorporerat i ett bladformigt bärarmaterial,