SI7812162A8 - Postopek za določitev alfa-amilaze - Google Patents

Description

Tehnični problem

Obstajala je potreba po ugotovitvi novega, tehnološko naprednega postopka za določitev «/--amilaze v raztopini kot telesni tekočini izven človeškega ali živalskega telesa, z encimatsko cepitvijo substrata d—amilaze, ob ugodnih vrednostih lag-faze in dosegljive maksimalne aktivnosti, brez dragih in kompliciranih aparatur in možni avtomatizaciji za industrijsko izvedbo postopka.

Stanje tehnike

Določitev koncentracije α-amilaze v serumu je važen klinični parameter za funkcijo trebušne slinavke. Običajni tržni reagenti za določitev α-amilaze so osnovani. pretežno na sistemu, pri katerem α-amilaza razgradi škrob in nastale razgrajene delce določijo v vidnem ali UV območju, v odvisnosti od tega, ali uporabijo v testu

- 2 kot substrat za amilazo obarvani škrob ali nativni škrob. Bistvena hiba teh postopkov oz. reagentov je v tem, da škro ba kot makromolekule ni mogoče zadostno karakterizirati in standardizirati, tako, da kažejo posamezne šarže zelo različno stopnjo presnove in je treba pri merjenjih vedno delati istočasno še s standardom. Za boljše rezultate bi bil potreben enotnejši substrat, ki daje pri cepitvi zanesljive rezultate.

Korak naprej V smeri enotnejšega substrata je pomenila uporaba maltopentaoze. α-aailaza jo cepi v maltotriozo in maltozo, maltotriozo in maltozo prevedejo z aglukozidazo v glukozo, ki jo lahko potem določijo po poljubnih metodah, npr. z znano heksokinazno metodo.

Poleg maltopentaoze so kot substrat predlagali že tudi maltotetraozo in maltoheksaozo (patenta ZDA . 4

879 265, * 000 042). Vendar so pri tem s tetraozo dosegli izrazito slabše rezultate kot s pentaozo, in s heksaozo še slabše rezultate kot s tetraozo. Tako navajajo za maltotetraozo in -pentaozo še stehiometrično reakcijo, medtem ko ugotavljajo za heksaozo odstopanja od stehiometricne reakcije, ki jih je komaj Še možno tolerirati.

Hiba maltopentaoze, ki smo jo ugotovili tudi pri tetraozi, pa je, da se pojavi znatna prazna vrednost reagentov, t.j., da meritvena reakcija že teče, še predno je dodan skusek, ki ga je treba določiti. Razen tega pa tudi ta prazna vrednost reagentov pri višjih koncentracijah substrata ni konstantna, temveč se več kot 25 minut spreminja, preden je dosežena konstantnost te stranske reakcije. Pokazalo se je tudi, da domnevne različne cepitve maltopentaoze s pankreas-a-amilazo in saliva-a-amilazo, ki bi omogočilo razlikovanje, dejansko sploh ni (J. BC, 1970, 24^,3917 do 3927; J. Biochem. 21» P· XVIH ¹952)_e Opis rešitve tehničnega problema z izvedbenimi primeri

Naloga izuma je torej ustvariti nov, tehnološki postopek za določitev cC-amilaze, pri katerem uporabimo substrat, ki kaže boljšo Čistoto in enotnost kot znani substrati, ki je lahko dostopen in glede prazne vrednosti brez seruma, trajanja lag-faze in dosegljive maksimalne aktivnosti ustreza zahtevam. Razen tega naj bi bila mogoča preprosta meritev brez dragih in kompliciranih aparatur in primernost za hitre diagnostike, kot testne trakove za avtomatizacijo postopka.

V smislu izuma rešimo to nalogo z navim postopkom za določitev &—amilaze z encimatsko cepitvijo substrata

-amilaze in meritvijo proizvoda cepitve, pri katerem raztopino skuska presnovimo z °t--glukozidazo in spojino s splošno formulo I

f

- 4 v kateri predstavlja R glukozidno, fenilglukozidno, mononitrofenilglukozidno, dinitrofenilglukozidno, sorbitno skupino ali skupino glukonske kisline.

Presenetljivo se je pokazalo, da ima maltoheptaoza kot substrat α-amilaze boljše lastnosti, četudi so pri oligomaltozah, ki so bile za ta namen že predlagane , od mal topentaoze proti maltoheksaozi ugotovili bistveno upadanje primernosti, ker dosežejo z njo bistveno slabše rezultate kot s pentaozo· Zato je bilo pričakovati, da bodo z nadaljnjim podaljšanjem oligosaharidne verige maltoze nastopile napake, ki jih ne bo več mogoče tolerirati. Presenetljivo pa smo dosegli boljše rezultate kot s pentaozo. Tako znaša prazna vrednost reagentov pri 0,02 ml skusku z maltopentaozo kot substratom 75 %, z maltobeptaozo pa le 15 %, računano na končno vrednost določitve v normalnem območju.

Razen tega smo ugotovili, da lahko namesto maltoheptaoze same uporabimo tudi določene derivate maltoheptaoze, ki tvorijo pri učinkovanju α-amilaze derivatiziran proizvod cepitve, ki se ga da določiti posebno ugodno.

Postopek v smislu izuma je primeren zlasti za določitev proizvodov cepitve z α-glukozidazo ali maltozefosforilazo.

Pri določitvi z α-glukozidazo in spojine s splošno formulo I, v kateri je R glukozid, se proizvodi cepitve maltoheptaoze, maltotetraoze in maltotrioze dalje

- 5 cepijo v glukozo, slednjo pa potem na znan način merimo.

Za merjenje nastale glukoze dajemo pri tem v prisotnosti α-glukozidaze prednost zlasti heksokinaznemu postopku. Princip te izvedbene oblike postopka v smislu izuma lahko podamo z naslednjimi enačbami:

maltoheptaoza + HpO ff^am^³-^aza> maltotrioza + maltote* traoza maltotrioza + 2HpO g-glukozidaža > 5 glukoze maltotetraoza + 3HpO ^a~g^lukozidaza 4 glukoze glukoz + 7 ATP 7 glukoze- 6-P glukoze-6-Ρ + 7NAD^{+ G 6 FDH} > 7 glukonat-6-P+7NADH + 7H⁺

Za to izvedbeno obliko izuma so zlasti primerni tudi v smislu izuma uporabljeni derivati maltoheptaoze, to rej spojine s splošno formulo I, v kateri R ne predstavlja glukozidne skupine. Pri učinkovanju obeh encimov, a-amilaze in α-glukozidaze, se substituent, torej fenilna skupina, mononitrofenilna skupina ali dinitrofenilna skupina oz. končni ostanek sorbita ali glukoneke kisline odcepi in ga zlahka določimo. Fenilne skupine lahko stoje v a- ali βlegi. če gre za α-lego, se vrši njihova odcepitev z učin- 6 kovanjem same α-amilaze in α-glukozidaze, in odcepljene, substituirane ali nesubstituirane fenole lahko nato zlahka določimo po znanih barvnih reakcijah. Izum pa je uporaben tudi pri substituentih, ki stoje v legi β. V tem primeru uporabljamo dodatno poleg α-glukozidaza tudi še βglukozidazo.

Pri dinitrofenilnih ostankih se lahko nahajata obe nitro skupini v poljubni legi, npr. kot 2,4-, 2,6- ali 3,5-substituenta.

Nitrofenoli oz. dinitrofenoli, ki nastanejo pri odcepitvi substituentov, ki vsebujejo nitro skupine, so sa me obarvane spojine, ki jih lahko brez nadaljnjega optično v

določimo. Ce se odcepi fenol sam, lahko tega določimo po znanih metodah, npr. s presnovo z nukleofilnim sredstvom, kot 3-metil-6-sulfonil-benztiazolon-hidrazonom-(2) (HSK) v prisotnosti monofenoloksidaze. Pri tej reakciji nastane rdeče barvilo, ki ga lahko izmerimo.

Pri odcepitvi sorbita lahko le-tega npr. s sorbitdehidrogenazo oksidiramo v fruktozo; istočasno se prisotni RAD reducira v NADH. Nastanek slednjega lahko zlahka določimo na znan način v UV spektrofotometru. če tega nimamo na razpolago, lahko s presnovo s tetrazolijevo soljo, kot npr. INT (2-(p-jodfenil)-3-(p-nitrofenil)5-fenil-tetrazolijevim kloridom) v prisotnosti diaforaze ali drugega prenašalca elektronov tvorimo tudi obarvan

-? formazan, ki ga lahko izmerimo v vidnem območju.

Na analogen način lahko sproščeno glukonsko kislino določimo po znanih metodah, npr. z glukonat-kinazo, 6-fosfoglukonske kieline-dehidrogenazo in NADP, kot tudi v danem primeru tetrazolijevo soljo in prenašalcem elektronov.

Za izvedbo postopka v smislu izuma so na splošno primerne pH vrednosti med 5 in 9· Prednostno delamo pri pfl vrednostih med 7 in 7»5» ker dobimo pri tem najboljše rezultate in najkrajše reakcijske čase. če uporabimo v smislu izuma nitrofenilne spojine, je območje primernih pH vrednosti nekoliko ožje in leži na splošno med pH 6 in pH 8,5.

Kot puferji so primerni tisti, ki so učinkoviti v območju glavne aktivnosti uporabljenih encimov. Prednostni so fosfat, HEPES (N-(2-hidroksietil)-piperazin-N-2etansulfonska kislina) in glicilglicin. Prednostne koncentracije so med 10 in 200 mM/1.

α-glukozidazo uporabljamo na splošno v količinah med 0,1 in 5000 U/ml. Posebna prednost postopka v smis lu izuma je v tem, da lahko uporabimo relativno velike količine tega encima, tako, da je stopnja, ki določa hitrost cepitev z α-amilazo. Seveda je možna uporaba še večjih količin tega encima, vendar pa s tem ne dosežemo nobenih nadaljnjih prednosti več.

-όSpojine s splošno formulo I, ki jih uporabljamo v smislu izuma, uporabimo v testu na splošno v količinah med 0,1 in 250 mM/Ι. Prednostne so količine med 0,5 in 100 mM/1.

Nasičenje substrata a-amilaze z maltoheptaozo leži pri koncentraciji 8 do 10 mM. Smotrno uporabljamo zato minimalno koncentracijo 8 mM maltoheptaoze, če naj delamo pri pogojih nasičenosti substrata, kar se redno dogaja.

Bazen tega smotrno dodamo aktivirao sredstvo za α-amilazo. Tovrstna aktivirna sredstva so znana. Prednostna sta natrijev klorid ali kalijev klorid.

Pri nadaljnji prednostni izvedbeni obliki postopka v smislu izuma se vrši določitev proizvodov cepitve s presnovo z maltozefosforilazo ob tvorbi glukoze-1-fosfata, ki ga nato določimo na znan način. Po posebno prednostni izvedbeni obliki se vrši določitev glukoze-1-fosfata s pretvorbo v glukoze-6-fosfat s pomočjo β-fosfoglukoze-mutaze, oksidacijo nastalega glukoze-6-fosfata z NAD v prisotnosti glukoze-6-fosfat-dehidrogenaze ob tvorbi glukonat-6-fosfata in NADH, pri čemer tvorbo NADH zlahka spremljamo fotometrično. Merilni signal lahko še okrepimo z nadaljnjo 0ksidacijo z NAD v prisotnosti 6-fosfoglukonat-dehidrogenaze ob tvorbi ribuloze-5-fosfata in nadaljnje molekule NADH.

Princip te izvedbene oblike podajajo sledeče enačbe:

maltoheptaoza + 1^0 β·³¹¹¹*-³²³^ maltotriaza + maltotetraoza -> maltoza maltoza + PO^ 5-“Sl^efosforilaza^ _{glukoza +} β-ginko z e-1-P β-glukoze-l-P β-PGluM,^ ginkoze-6-Ρ glukoze-6-Ρ + NAD⁺ glukonat-6-Ρ + NADH + H⁺ glukonat-6~P+NAD⁺ ribuloze-^-^+NADH + H⁺

Prednost te izvedbene oblike izuma je v tem, da je maltozefosforilaza bolj specifična kot a-glukozidaza in zato ne moti endogene glukoze.

Glede puferja velja na enak način tisto, kar smo navedli za izvedbeno obliko postopka v smislu izuma po načinu dela z a-glukozidazo.

Reagent za določitev α-amilaze vsebuje substrat α-amilaze in sistem za določitev enega od proizvodov cepitve, ki ga tvori α-amilaza iz substrata amilaze, pri čemer substrat

- 10 substrata α-amilaze, ki je označen s tem, da sestoji substrat iz spojine s splošno formulo I.

Prednostni sistem za določitev proizvodov cepit ve je sistem α-glukozidaze, ki vsebuje α-glukozidazo, alka lijski klorid in pufer. Če sestoji substrat iz maltoheptaoze same, so potrebni kot encimi še heksokinaza (HK) in glukoze-6-fosfat-dehidrogenaza (G6PDH), kot tudi NAD, ATP in magnezij.

Prednostno sestoji reagent na osnovi sistema aglukozidaze iz x 105 do 3 x 10* U/l a-glukozidaze,

10⁵ do 5 x 10* HK,

10⁵ do 5 x 10* G6PDH,

0,5 do 8 mM/Ι NAD,

0,5 do 5 mM/Ι ATP, do 3 mM/Ι Mg²⁺ do 100 mM/Ι NaCI ali KC1, do 200 mM/Ι puferja, pH 6,2 do 7»8, in do 100 mM/Ι maltoheptaoze ali njegovega mnogokratnika ali ulomka, v suhi ali raztopljeni obliki.

Pri drugi prednostni izvedbeni obliki sestoji reagent iz α-glukozidaze, KC1 ali NaCI, puferja in sub2 6 strata. Tovrstni reagent vsebuje zlasti 10 do 5 ^x 10 U/l α-glukozidaze, 1 do 100 mM/Ι NaCl ali KC1, 10 do 250 mM/1 puferja, pH 5 do 9, in 0,1 do 250 mM/Ι derivata maltoheptaoze s splošno fcrmulo I, računano na koncentracijo v testu. Reagent ae lahko nahaja v suhi, zlasti liofilizirani obliki, ali v obliki raztopine, kot mešanica vseh sestavin ali ločeno.

Po nadaljni izvedbeni obliki vsebuje reagent gornje vrste dodatno še β-glukozidazo ali/in fenoloksidazo in HSK.

Po nadaljnji izvedbeni obliki izuma vsebuje reagent poleg α-glukozidaze, NaCl ali KC1, puferja in substrata še sorbitdehidrogenazo in NAD ali glukonat-kinazo, ATP, 6-fosfoglukonske kisline dehidrogenazo in NADP, kot tudi v danem primeru tetrazolijevo sol in diaforazo oz. fenazinmetesulfat (PMS).

Prednostni reagent take vrste vsebuje 1 x 10 do 3 χ 10⁶ U/l α-glukozidaze, 2 x 10^ do 5 * 10^ U/l sorbitdehidrogenaze, 1 x 10^y do 5 x 10 U/l heksokinaze, 0,5 do 50 mM/Ι ATP, 10 do 500 U/l diaforaze (Chlostridium Kluyveri), 0,01 do 0,5 mM/Ι tetrazolijeve soli, 0,1 do 10 mM/Ι NAD,

0,2 do 5 mM/Ι MgC^, 0,5 do 20 mM/Ι maltoheptita, 1 do 100 mM/Ι NaCl ali KC1 in 10 do 250 mM/Ι pufer ja, pH 5,5 do 8,5.

V danem primeru je prisotno še neionsko površinsko aktivno sredstvo v količini med 5 in 50 mM/1.

- 12 Prav tako prednostna izvedbena oblika vsebuje 100 do 5 * 10⁶ U/l a-glukozidaze, 10 do 10^ U/l 6-fosfoglukonat-debidrogenaze, 20 do 2 x 10^ U/l glukonat-kinaze, 0,5 do 25 mM/Ι ATP, 0,05 do 1,0 mM/Ι NADP, 1,0 do 20 mM/1 maltoheptaglukonske kisline, 0,5 do 5 mM/Ι MgClg, 1 do 100 mM/Ι NaCl in 10 do 250 mM/Ι pufer ja, pH 5» 5 do 8,5.

Nadaljnji reagent vsebuje

0,1 do 250 mM/1 a-nitrofenil-maltoheptaozida ali dinitrof eni 1-maltoheptao zida, x 10^ do 2,5 x 10⁶ U/l a-glukozidaze, do 100 mM/Ι natrijevega klorida ali kalijevega klorida in 10 do 250 mM/Ι fosfatnega puferja, pH 7,0 do 8,0.

Še druga izvedbena oblika reagenta vsebuje:

0,1 do 250 mM/Ι a-fenilmaltoheptaozida, χ 10² do 1,5 x 10θ U/l a-glukozidaze, do 10^ U/l monofenoloksidaze,

0,1 do 10 mMl/1 HSK, do 100 mM/Ι NaCl ali ZC1 in do 250 mM/Ι puferja.

Drug prednostni sistem za določitev proizvodov cepitve je sistem maltozefosforilaze, ki sestoji v bistvu iz maltozefosforilaze, β-fosfoglukomutaze (PFMG), glukoze6-fosfat-dehidrogenaze (G6PDH), glukoze-1,6-difosfata

- 13 (G1, 6DP), NAD, pufer ja, maltoheptaoze in v danem primeru

6-fosfoglukonat-dehidrogenaze (6PGDH).

Posebno prednostni reagent s tem sistemom za dokazovanje sestoji iz

0,5 x 10* do 20 x 10* U/l malto|zefosforilaze, χ 10² do 1 x 10⁴ β-FGluM, x 10 do 3 x 10 U/l glukoze-6-f osf at-dehidrogenaze,

0,5 do 10 mM/Ι NAD,

0,001 do 1 mM/Ι glukoze-1,6-difosfata,

0,5 do 100 mM/Ι puferja, pH 6,0 do 7,5, do 50 mM/Ι maltoheptaoze in v danem primeru 2 4 x 10 do 1 x 10 U/l 6-fosfoglukonat-dehidrogenaze.

Reagent se lahko nahaja v suhi ali raztopljeni obliki, lahko pa se nahaja tudi impregniran na listastem nosilcu, npr. foliji, vpojnem papirju ali podobno. V tem primeru .sestoji smotrno iz vsaj treh plasti oz. slojev, pri čemer vsebuje prvi sloj substrat, drugi sloj rabi kot zaporni sloj in tretji sloj vsebuje sistem za določitev proizvodov cepitve. Če spravimo tak večslojni reagenčni material, ki je primeren za preprost hitri test na α-amilazo, v stik s tekočim skuskom, ki vsebuje aamilazo, razcepi α-amilaza substrat, in proizvodi cepitve difundirajo skozi vmesni sloj v tretji sloj, ki vsebuje

- 14 določevalni sistem« Kot dokazilno reakcijo uporabimo v tem primeru smotrno reakcijo, pri kateri pride do obarvanja, da bi z nastalo spremembo barve hapravili koncentracijo a-amilaze vizualno vidno, v kolikor proizvodi cepitve niso že sami obarvani.

V smislu izuma uporabljene derivate maltoheptaoze lahko pripravimo po različnih metodah. V kolikor gre za fenilirane derivate, lahko uporabimo tako kemijske kot tudi encimatske metode. Kemijska sinteza temelji načelno na presnovi peracetilirane maltoheptaoze z ustreznim fenolom v prisotnosti Friedel-Craftsovega katalizatorja. Ta metoda je primerna tako za fenol sam kot tudi za mononitrofenol in dinitrofenol. Alternativno je možno tudi, da najprej pripravimo fenilni derivat in tega nato nitriramo, npr. po postopku, opisanem v Buli. Chem. Soc. Japan 34. (1961) 781.

Ta metoda je primerna zlasti za mononitro-derivat, pri čemer lahko morebiti izvedemo ločenje nastalih o- in p-nitrofenilnih derivatov.

Prednostno izvedemo to presnovo s taljenjem ali kuhanjem ob ref luksu v nepolarnem topilu s ZnC^, SnCl^ ali TiCl^ kot Friedel-Craftsovim katalizatorjem. Po uvedbi fenola oz. nitrofenola odcepimo na znan način zaščitne skupine, npr. z natrijevim metilatom, amoniakom, KOH ali barijevim metoksidom, vsakokrat v metanolni raztopini, z vodno raztopino barijevega hidroksida itd.

-15Encimatska priprava fenilnih derivatov se vrši s transglukozidiranjem fenilglukozida oz. ustreznih nitriranth fenilglukozidov z α-ciklodekstrinom, amilazo ali topnim škrobom v prisotnosti specifične mikrobne transferaze. Prednostno uporabljamo zajto transferazo iz Bacillus macerans. Pri tem lahko zato transglukozidiranje uporabimo znano amilazo mikroba Bacillus macerans (E.C. 2.4.1.19. DSM 24; izoliranje: J.A. de Pinto, L.L. Campbell, Biochemistry 2» (1968) 114; transferna reakcija: Methods in Carbohydr. Chemistry, Vol. II, 54?), ki kaže poleg svojega hidrolitekega in ciklizirnega učinka očitno tudi glukozi1transferentno učinkovitost.

Tisto spojino s formulo I, v kateri predstavlja R sorbitni ostanek, lahko pripravimo iz maltoheptaoze z redukcijo z natrijevim borovim hidridom (NaBH^) pri prizanesljivih pogojih.

I

Spojino _s formulo I, v kateri predstavlja R skupino glukonske kisline, lahko končno pripravimo kemijsko ali encimatsko po znanih metodah za pripravo glukonske kisline iz maltoheptaoze, npr. z oksidacijo z bromom (Methods in Carbohydr. Chemistry, Vol. II, 15)·

Kot smo že omenili, z izumom ni ustvarjen samo hiter in specifičen postopek za določitev α-amilaze, temveč je zlasti popolnoma ali daljnosežno odstranjena lag- 16 faza, kar je posebno pomembno pri uporabi postopka v anali znih avtomatih. Poleg tega se da izvesti postopek v smis lu izuma v mnogih izvedbenih oblikah brez kompliciranih aparatur za ovrednotenje in je zato primeren zlasti za hitre diagnostike in za optično določitev v vidnem območju. Istočasno pa se dajo različne izvedbene oblike postopka v smislu izuma izvesti tudi z UV merilnimi pripravami. Nadaljnji prednosti sta stroga proporcialnost in dejstvo, da kemijsko sorodne snovi, ki jih vsebuje kri, ne povzročajo nobenih motenj.

V smislu izuma uporabljene substrate se da dobiti zlahka in z veliko čistoto. Preprost postopek za pripravo maltoheptaoze je opisan v nemški patentni prijavi P 27 41 191.2. Postopek je primeren za določitev a-amilaze v bioloških tekočinah, kot serumu, heparinski plazmi, urinu in pod., ali v drugih tekočih ali trdnih materialih.

Naslednji primeri pojasnjujejo izum.

-17 PRIMER 1

Maltogena metoda (sistem a-glukozidaze)

Reagenčno mešanico, ki vsebuje α-glukozidazo, G6PDH, HK, NAD, ATP, maltoheptaozo, Mg²⁺, NaCI in fosfatni pufer, raztopimo v 2,0 ml destilirane vode. Obstojnost reagenta pri sobni temperaturi znaša okoli 1 uro, pri tem peraturah pod 8 °C 6 ur.

Dobljena raztopina ima naslednje koncentracije

reagentov:
fosfatni pufer	50 mM/lj ;
NaCI	50 mM/1
Mg2+	2 mM/1
maltoheptaoza	10 mM/1
ATP	1,2 mM/1
NAD	2 mM/1
HK	> 2 U/l
G6PDH	ar 2 U/l
a-glukozidaza	ar io u/l.

Raztopim! dodamo pri 25 °C 0,02 ml skuska seruma, jo prenesemo v kiveto z debelino plasti 1 cm in nato v fotometru določimo ekstinkcijo pri Hg 365 nm, 340 nm ali Hg 334 nm. Po 10 minutah odčitamo ekstinkcijo in potem ponovimo odčitanje v presledkih po 1 minuto petkrat.

-18Ιζ tako ugotovljenih razlik ekstinkcije na minuto ( Δε/min), izračunamo srednjo vrednost, odštejemo prazno vrednost reagenta in korigirano vrednost vstavimo v izračun. Izračun se vrši takole:

U/l 25°C = 4244 x P E 365 nm/min = 2290 x0E 340 nm/min ^e 2335 χΔε 334 nm/min

Sl. 1 kaže rezultate vrste razredčin Človeškega seruma s fiziološko raztopino kuhinjske soli, ki jih dobimo po tej metodi.

Če razdelimo reagent na dva dela, od katerih vsebuje eden maltoheptaozo in drugi mešanico vseh ostalih reagentov, lahko obstojnost raztopin, ki jih z njimi priI pravimo, zvečamo. Za mešanico reagentov znaša pri temperaturah do 8 °C 50 ur, pri sobni temperaturi okoli 8 ur. Obstojnost raztopine maltoheptaoze znaša ustrezno 6 tednov oz. okoli 1 teden.

PRIMER 2

Določitev s sistemom maltoze_f₀sforilaze

Pripravili smo dva reagenta, ki sestojita iz substrata amilaze in sistema maltoze-fosforilaze. En reagent je vseboval substrat maltoheptaoze, drugi ustrezno ejr stanju tehnike topni škrob. Koncentracija reagentov po raz tapljanju v vodi je bila naslednja:

izum primerjava

fosfatni pufer	20 mM; pH 6,5	20 mM; pH 6,5
NAD	2 mM	2 mM
maltoheptaoza	10 mM	-
topni škrob	-	5 mg/ml
glukoze-1,6-difosfat	sledovi	sledovi
maltoze-fosforilaze (mikroorg.)	3 U/ml	3 U/ml
β-fosfoglukomutaza (mikroorg.)	1 U/ml	1 U/ml
G6PDH (Leuconostoc mesent)	9 U/ml	9 U/ml
6PGDH (Leuconostoc	1 U/ml	1 U/ml

mesent)

Dobljeno raztopino smo inkubirali pri 30 °C, ji dodali raztopino skuska in določili v fotometru razliko ekstinkcij pri Hg 334 nm. Po 10-minutni predinkubaci ji smo merili razliko ekstinkci j v teku 10 minut Za 2,0 ml reagenta in 0,10 ml skuska velja nato naslednja formula za izračunavanje ;-οπ^{=ΔΕ/π1η x 1699 U/1}

- 20 Pri uporabi petih različnih človeških serumov smo ugotovili z zgornjimi reagenti naslednje vrednosti:

serum	izum	škrob
1	57,4 U/l	15,3 U/l
2	61,2 U/l	27,3 U/l
3	95,1 U/l	39,1 U/l
4	114 U/l	44,2 U/l
5	374 U/l	161 U/l

PRIMER 3

Priprava a-fenilmaltoheptaozida

a) Tridekozacetil-p-D-maltoheptaoza

57»6 g (50 mM) maltoheptaoze in 41 g (500 mM) hrezvodnega natrijevega acetata suspendiramo v 543 ml (5*75 mola) i anhidrida ocetne kisline in 4 ure ob izključitvi vlage močno mešamo pri 100 °C. Po ohlajen ju na okoli 60 °C vmešamo v okoli 1 1 ledene vode in mešamo preko noči pri 4 °C, pri čemer se obori žilava, polkristalinicna masa· Po oddekantiranju supematanta znova zmešamo ostanek z ledeno vodo. Pri tem proizvod popolnoma izkristalizira. Proizvod ločimo, izperemo in posušimo.

Dobitek 80,7 g (76 % teor.) brezbarvni kristali [a]p^T » + 137,5 ⁰ (c « 1,15 kloroform), tal. - 150 ⁰ (neostri,

- 21 Matično lužnico (dekantat) uparimo v vakuumu do suhega in ostanek prav tako zdrgnemo z ledeno vodo in kristaliziramo.

Dobitek 22,5 g

Ca]p^T - 156 ⁰ (c - 1, kloroform), tal. 150 °C.

Celotni dobitek 105 g » 97 % teor.

Proizvod lahko prekristaliziramo iz etanola, pri čemer se tudi po večkratnem prekristaliziranju tališče in sučnost ne spremenita. Proizvod je torej ob atomu C^ optično enotno (β) konfiguriran.

b) Dodekozacetil-a-fenil-D-maltoheptaozid

9,54 g (4,5 mM) tridekozacetil-P-D-maltoheptaoze, 0,61 g (4,5 mM) sveže staljenega ZnClg in 4,25 g (4-5 mM) destiliranega fenola mešamo ob izključitvi vlage 2,5 ur pri 100 °C. Nato še toplo raztopimo v etilacetatu in izperemo s po 2 x 100 ml HgO, 5 x 100 ml 1 n NaOH, 100 ml 1 n ocetne kisline in 100 ml nasičene raztopine natrijevega klorida. Sprva rjava raztopina postane pri tem svetlo rumena. Po sušenju nad MgSO^ uparimo do suhega in prevzamemo v toplem metanolu (5θ ml). Po stanju preko noči se izloči sirupast material, ki ga kristaliziramo iz etanola.

Dobitek: 8,7 g (90 % teor), tal. 155 do 165 °θ (razp.) [a]p^T + 147 ⁰ (c » 8 v kloroformu).

- 22 c) Fenil-a-D-maltoheptaozid

10,8 g (5 mM) peracetil-1-fenil-a-D-maltoheptaozida raztopimo v toplem v 200 ml absolutnega metanola in dodamo pri sobni temperaturi ob dodatku nekaj dioksana med mešanjem 50 ml 0,1 n natrijevega metilata in mešamo 16 ur pri sobni temperaturi. Po 20 minutah se začne proizvod izločati polkristalno« Zončno dodamo 200 ml acetona« ohladimo na 4 °C in odsesamo. Proizvod raztopimo v vodi (160 ml), razbarvamo z aktivnim ogljem in šaržno odstranimo soli s kationskim izmenjalen (Dowex 50 H⁺).

Dobitek: 5,6 g (91 % teor.) brezbarvnega liofilizata Dx]p^T = + 176 ⁰ (c » 10 v E₂0).

Proizvod vsebuje še nekaj proste maltoheptaoze in - po HPLC-analizi (detekcija pri 254 nm) - še 2 UV-pozitivni nečistoti. Odločimo ju s kromatografijo na premreženem dekstranu (Sephadex LH20) z vodo kot eluimim sredstvom.

PRIMER 4

Pri prava p-ni trofeni1-a-D-maltoheptaozida

a) Peracetil-p-nitrofenil-a-D-maltoheptaozid

13,6 g (20 mM) peracetil-maltoheptaoze, pripravljene po primeru 1, a), raztopimo z 11,9 g (100 mM)

- 23 p-nitrofenola v 90 ml absolutnega benzola in med mešanjem in ob izključitvi vlage dodamo 10,4 g - 4,5 ml (40 mM) SnCl^. Pri tem se obori voluminozna masa, ki pa se pri segrevanju spet raztopi· Kuhamo 1 uro pod refluksom. Pri ohlajenju se izloči žilava masa, ki po dodatku 80 ml etilacetata spet preide v raztopino. Privmešanju raztopine v 180 ml 2 n raztopine ^2^3 ^{se ot,}ori kositrov oksidhidrat. Tega odločimo ob dodatku nekaj aktivnega oglja. Vodno fazo odločimo in organsko fazo dobro izperemo, na koncu z nasičeno raztopino NaCl· Po sušenju in uparjenju raztopine dobimo smolast proizvod, ki kristalizira iz etanola. Dobitek: 6,2 g (41 % teor.), tal. = 100 °C (razpad) [a]p^ = + 131 ⁰ (c » 1 v kloroformu).

Proizvod dobimo tudi, če izvedemo nastavek v kloroformu ali s TiCl^ namesto SnCl^.

b) p-nitrofenil-a-D-maltoheptaozid

5,5 g (7 mM) peracetil-p-nitrofenil-maltohepta*· ozida suspendiramo v 100 ml absolutnega metanola in dodamo 5 ml okoli 1 n raztopine natrijevega metilata. Izhodni material postane podoben medu in se počasi raztopi, čez nekaj časa se začne kristalno izločanje dezacetiliranega proizvoda, ki je po mešanju preko noči popolno. Odsesamo, izperemo z metanolom in posušimo.

- 24 Dobitek 2,8 g (86 % teor) [<χ]ξ^Τ - + 124 ⁰ (c - 0,6 v HgO).

Proizvod očistimo na premreženem dekstranu (Sephadex LH20) z vodo kot eluirnim sredstvom. Dobimo 1,2 g (45 %) zgoraj opisane spojine, ki je v encimatskem testu kktivna. Bazen tega smo dobili spojino tudi z nitriranjem α-fenilmaltoheptaozida iz primera 1 z nitrirno kislino po Buli. Chem. Soc. Japan 34 (1961) 718·

Ob uporabi dinitrofenola namesto mononitrofenola dobimo ustrezne dinitrofenilne spojine.

PRIMER 5 p-nitrofenil-a-maltooligosaharidi z encimatsko sintezo z amilazo iz Bacillus macerans (E.C.2.4.1.19 iz Bac. mac.

DSM 24).

Amilaza iz Bacillus macerans ima poleg, ihidrolitskega in ciklizirnega učinka tudi lastnosti transferiranja. glikozila, ki jih lahko izkoristimo za sintezo oligosaharidov in derivatov oligosaharidov (Methods in Carbohydrate Chemistry II, 347). Za sintezo p-nitrofenil-oligosaharidov smo ta postopek optimirali takole:

Pomešamo 680 mg amilaze iz Bacillus macerans (E.C.2.4.1.19 iz Bac. mac. DSM 24)((liofilizat) ( odtehtek 0,46 U/mg, vsebnost proteinov v odtehtku 28,5 %, brez aktivnosti, ki cepijo p-nitrofenil-a-D-glukozid),

- 25 400 mg α-D-p-nitrofenilglukozida,

3,5 g α-ciklodekstrina, in ml Soerensenovega fosfatnega pufer ja, pH 6,2; 0,01 M. Nastavek inkubiramo 24 ur pri 37 °C· Za čiščenje nato ločimo a- in nastali β-ciklodekstrin najprej preko tetrav \ kloretilenske vkljucne spojine. Po kromatografiji na premre ženem dekstranu (Sephadex LH20) dobimo 50 mg liofilizata p-nitrofenil-maltoheptaozida, ki je zelo aktiven v testu z amilazo.

PRIMER 6

Priprava maltoheptaita g maltoheptaoze raztopimo v 5θ ^ml HgO, temu dodamo po obrokih 2 g NaBH^ in mešamo 75 minut pri sobni temperaturi (preskusnna-reducirani sladkor negativen). S kromatografijo na kationskem izmenjalu (Lowex 50 H⁺) odstranimo Na⁺ (pH vrednost raztopine po prehodu skozi izmenjalo 3 »5)· Raztopino po prehodu skozi izmenjalo uparimo v vakuumu in večkrat prevzamemo z metanolom/vodo (dodatek vode k raztopini proizvoda) in uparimo, da odstranimo borovo kislino kot metilester. Raztopino, ki je na koncu nevtralna, liofiliziramo.

Dobitek: 9 g (90 % teor.), brez reduktivnih sladkorjev Vsebnost (encimatsko določena) iz glukoze 86,1 % iz sorbita 89»0 % voda 8,5 %.

- 26 PRIMER 7

Priprava maltoheptonske kisline

11,5 g (0,01 Bol) maltoheptaoze in 6 g Ba-benzoata smo dali v 150 ml vode. Med mešanjem in hlajenjem smo dodali 1 ml broma in mešali še 36 ur. Po izgonu prebit nega broma z dušikom smo dodali 4 ml 4 n HpSO^ in nekaj aktivnega oglja, filtrirali in filtrat ekstrahirali s kloroformom, da smo odstranili benzojevo kislino. Vodni raztopini smo dodali 3»2 g AggCO^ in mešali (pH : nevtralno). Netopne soli smo odfiltrirali in bistro raztopino prelili preko 20 ml Amberlita JR H⁺. Kisli eluat smo takoj nevtralizirali z NaOH in liofilizirali.

Dobitek: 8 g (72 % teor.)

Vsebnost (encimatsko določena) iz glukoze 85 % iz glukonske kisline 80 % voda 9,3 %·

PRIMER 8

Dokaz α-amilaze s fenil-a-maltoheptaozidom kot substratom α-amilaza razcepi fenil-a-maltoheptaozid v fenil-a-maltotriid ali -tetraid, ki ju presnovimo z a-glukozidazo v fenol in glukozo. Sproščeni fenol pripojimo s pomočjo mono f e no 1-oksidaze oksidativno z nukleofilnim reagentom 3-metil-6-sulfonil-benztiazolon-hidrazonom-(2) (HSK) v

- 27 rdeče barvilo, čigar hitrost nastajanja je proporcionalna aktivnosti amilaze v skusku in jo lahko spremljamo fotome trično.

Princip testa:

1. a) fenil-a-maltoheptaozid + Η^Ο fenil-a-Dtri-(tetra)-glukopiranozid + maltotetra-(tri)-oza

b) fenil-a-D-tri-(tetra)-glukopiranozid + 3 (4) HgO > fenol + 5 (4) glukoze

e) fenol + HSK + Og / _{bervilo + 2} ^0

Merilni pogoji:

°C, merilna valovna dolžina 492 nm, 1 cm ki vete.

i

Sestavo reagenta prikazuje naslednja tebela.

TABELA

Reagent_Koncentracija pri testu

fosfatni pufer, pH 7,4	0,05	M/l
natrijev klorid	0,05	M/l
fenil-a-D-maltoheptaozid	10	mM/1
HSK	1	mM/1
mono f enol-oks idaza	1	U/ml
a-glukozidaza	10	U/ml

testni volumen: 2,0 ml

- 28 Namesto fosfatnega puferja so se pokazali kot uporabni tudi glicinski, glicilglicinski, hepes, tris, tra in drugi puferji.

PRIMER 9

Določitev α-amilaze s p-nitrofenil-maltoheptaozidom

Princip testa:

p-nitrofenil-a-maltoheptaozid gr^amilaza> (glukoza)_n + p-nitrofenil-a-(glukoza)_m g^{c ,}S^luko?I^<I^a?.^a» _n glukoz + p-nitrofenol.

Po cepitvi maltoheptaozida razgradimo proizvode cepitve v glukozo in p-nitrofenol. p-nitrofenolatni anion je v alkalni raztopini obarvan rumeno in ga lahko zato direktno optično merimo.

Testni sistem:

Reakcijska zmes: 50 mM/Ι fosfatnega puferja, pH 7,4 mM/Ι natrijevega klorida do 50 U/ml a-glukozidaze oz. 10 mM/Ι p-nitrofenil-a-maltoheptaozida

Testni nastavek:

ml reakcijske zmesi + 50 /Ul skuska (seruma) temperatura: 50 °C val. dolžina: 405 nm

- 29 Start s serumom potem, ko dosežemo merilno temperaturo (10 minut predinkubaci je).

PRIMER 10

Določitev α-amilaze z maltoheptitom

Princip testa:

maltoheptait + HgO ^<x“Sgl.^lazaT> maltotriit + maltotetraoza maltotriit + ^0 .^.rg^^^idaza > sorbit + maltoza sorbit + NAD⁺ ~^DH > fruktoza + NADH + H⁺

NADH + INT + H^{+ diaforaza} > formazan + NAD⁺

SDH = sorbit-dehidrogenaza.

Testni sistem:

Reakcijski nastavek	ml	Koncentracija pri testu
Na-/K-FO,+-pufer 0,02 M/l	1,92	12,8 mM/Ι P04
+ Triton Χ100 2 ml/100 ml
+ NaCl 10 mM/Ι, pH 6,9		6,4 mM/1
MgCl2 0,3 M/l	0,01	1,0 mM/1
maltoheptit 100 mM/1	0,10	3,3 mM/1
NAD c = 40 mg/ml	0,05	1,0 mM/1
INT c - 0,6 mg/ml	0,20	0,09 mM/1
diafhraza (Clostr.Kluyveri) 0,05	167 U/l

mg/ml⁺

- 30 Reakcijski nastavek ml Koncentracija pri testu

ATP c « 50 mg/ml	0,10	3,29 mM/1
heksokinaza 280 U/ml+	0,05	4666 U/l
SDH 180 U/ml+	0,30	18000 U/l
a-glukozidaza 1120 U/ml+	0,20	74670 U/l
skusek (serum)	0,02

+ v testnem puferju

Start z dodatkom skuskaj meritev se vrši pri 4-92 nm; temperatura: 25 °0.

PRIMER 11

Določitev α-amilaze z maltoheptaglukonsko kislino

Princip testa:

maltoheptaglukonska kislina + HgO ^{a ,am}il^&za^, maltottioglukonska kislina + maltotetraoza maltottioglukonska kislina + Hg⁰ glukonska kislina + maltoza glukonska kislina + ATP g¹-^ukoDat~^kina2a> glukonske kisline-6-Ρ + ADP glukoze M.eline-6-F ♦ HADP* ribuloze-5-Ρ + NADPH + COg + H⁺

- 51 Testni sistem:

Reakcijski nastavek ml Koncentracija pri testu

Na-/K-FO4-pufer 0,02 M/l + NaCI 10 mM/Ι, pH 6,9	2,19	14,6 mM/Ι fosf 7,3 mM/Ι NaCI
MgClg 1 M/l	0,01	5,5 mM/1
maltoheptaglukonska kislina 150 mM/1	0,10	5 mM/1
NADP c « 10 mg/ml	0,10	0,38 mM/1
ATP c 50 mg/ml	0,10	2,7 mM/1
glukonat-kinaza 40 U/ml	0,03	1066 U/l
6-fosfoglukonske kislinedehidrogenaza 24 U/ml	0,10	800 U/l
a-glukozidaza 1120 U/ml	0,30	11,2 x 10* U/l
skusek (serum)	0,02

I

Start z dodatkom skuska: meritev se vrši pri 340 nm ali 3θ5 nm, °c, temperatura: testni volumen:

3,00 ml

Navedba o najboljšem,prijavitelju znanem_? načinu za gospodarsko Izkoriščanje prijavljenega izuma p-nitrofenil-a-maltooligosaharidi z encimatsko sintezo z amilazo iz Bacillus macerans (E.C.2.4.1.19 iz Bac. mac.

DSM 24).

Amilaza iz Bacillus macerans ima poleg liidrolitskega in cikliziraega učinka tudi lastnosti transferiranja glikozila, ki jih lahko izkoristimo za sintezo oligosaharidov in derivatov oligosaharidov (Methods in Carbohydrate Chemistry II, 547). Za sintezo p-nitrofenil-oligosaharidov smo ta postopek optimirali takole:

Pomešamo 680 mg amilaze iz Bacillus macerans (E.C.2.4.1.19 iz Bac. mac. DSM 24) ((liofilizat) ( odtehtek 0,46 U/mg, vsebnost proteinov v odtehtku 28,5 %, brez aktivnosti, ki cepijo p-nitrofenil-a-D-glukozid),

400 mg a-D-p-nitrofenilglukozida,

5,5 g α-ciklodekstrina, in ml Soerensenovega fosfatnega puferja, pH 6,2; 0,01 M. Nastavek inkubiramo 24 ur pri 57 Za čiščenje nato ločimo a- in nastali β-ciklodekstrin najprej preko tetrakloretilenske vključne spojine. Po kromatografiji na premre ženem dekstranu (Sephadex LH20) dobimo 50 mg liofilizata p-nitrofenil-maltobeptaozida, ki je zelo aktiven v testu z amilazo.

Določitev »-ητη-ΐ i ft7.fi s p-nitrofenil—maltoheptaozidom

Princip testa:

p-nitrofenil-a-maltoheptaozid —(glukoza)_n + p-nitrofenil-a-(glukoza)_m ^a~g^lukozidaza» _n glukoz + p-nitrofenol.

Po cepitvi maltoheptaozida razgradimo proizvode cepitve v glukozo in p-nitrofenol. p-nitrofenolatni anion Je v alkalni raztopini obarvan rumeno in ga lahko zato direktno optično merimo.

Testni sistem:

Reakcijska zmes: 50 mM/1 fosfatnega puferja, pH 7,4 mM/1 natrijevega klorida do 50 U/ml a-glukozidaze oz. Ί0 mM/1 p-nitrofenil-a-maltoheptaozida

Testni nastavek:

ml reakcijske zmesi + 50 /Ul skuska (seruma} temperatura: 50 °C val. dolžina: 405 nm

Start s serumom potem, ko dosežemo merilno temperaturo (10 minut predinkubacije).

Claims (11)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Postopek za določitev ^--amilaze z encimsko cepitvijo substrata d—amilaze, označen s tem, da raztopino skuska presnovimo z ct-glukozidazo in spojino s splošno formulo I v kateri predstavlja

   R glukozidno, fenilglukozidno, mononitrofenilglukozidno, dinitrofenilglukozidno, sorbitno skupino ali skupino glukonske kisline^in stvorjeno spojino ROH nato izmerimo.
2. 2. Postopek po zahtevku % označen s tem, da delamo pri pH vrednostih med 5 in 9.
3. 3. Postopek po zahtevku 1 ali 2, označen s tem, da uporabimo Ο,Ί do 250 mM/1 spojine s formulo I.

   - rf
4. 4. Postopek po enem od prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da uporabimo pri substituentu v legi β v ostanku sladkorja skupine R dodatno β-glukozidazo.
5. 5. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da proizvode cepitve presnovimo z maltozefosforilazo ob tvorbi glukoze-1-fosfata in tega določimo.
6. 6. Postopek po zahtevku 5, označen s tem, da za določitev nastalega glukoze-1-fosfata le-tega presnovimo s fosfoglukomutazo v glukoze-6-fosfat in z le-tem reduciramo NAD v prisotnosti glukoze-6-fosfat-dehidrogenaze v NADH, ki ga izmerimo.
7. 7. Postopek po enem od prejšnjih zahtevkov, označen s tem, da v primeru, če R predstavlja fenilglukozidno skupino, odcepljeni fenol določimo s 5-metil-6sulfonil-benztiazolon-hidrazonom-(2) v prisotnosti monofenoloksidaze.
8. 8. Postopek po enem od zahtevkov 1 do 6, označen s tem, da v primeru, če R predstavlja sorbitno skupino, odcepljeni sorbit določimo s sorbit-dehidrogenazo in NAD.
9. 9. Postopek po enem od zahtevkov 1 do 6, označen s tem, da v primeru, če R predstavlja skupino glukonske kisline, odcepljeno glukonsko kislino določimo z glukonatkinazo, 6-fosfoglukonske kisline-dehidrogenazo in NADP.

   - 3 ¢-
10. 10. Postopek po zahtevku 8 ali 9, označen s tem, da pri redukciji NAD nastali NADH presnovimo s te trazolijevo soljo v prisotnosti prenašalca elektronov v formazan in le-tega določimo.
11. 11. Postopek po zahtevku 10, označen s tem, da uporabimo kot prenašalca elektronov diaforazo oz. fe nazinmetosulfat.