HU182005B - Method and reagent for determining alpha-amylase - Google Patents
Method and reagent for determining alpha-amylase Download PDFInfo
- Publication number
- HU182005B HU182005B HU78BO1734A HUBO001734A HU182005B HU 182005 B HU182005 B HU 182005B HU 78BO1734 A HU78BO1734 A HU 78BO1734A HU BO001734 A HUBO001734 A HU BO001734A HU 182005 B HU182005 B HU 182005B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- mmol
- substrate
- amylase
- units
- liter
- Prior art date
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 title abstract 4
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 title abstract 4
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 title abstract 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 34
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims abstract description 4
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 claims abstract description 3
- 150000008131 glucosides Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- BNABBHGYYMZMOA-AHIHXIOASA-N alpha-maltoheptaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O[C@@H]6[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]6O)CO)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O BNABBHGYYMZMOA-AHIHXIOASA-N 0.000 claims description 22
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 14
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 claims description 13
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 claims description 13
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 13
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 claims description 11
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 8
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 claims description 6
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 108010009384 L-Iditol 2-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 108010057899 Maltose phosphorylase Proteins 0.000 claims description 5
- 102100026974 Sorbitol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 5
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 108010021382 Gluconokinase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100024009 Probable gluconokinase Human genes 0.000 claims description 4
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 101000935015 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) N-acetyl-6-hydroxytryptophan oxidase ivoB Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 239000012992 electron transfer agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000005375 photometry Methods 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- RWHOZGRAXYWRNX-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1,6-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1O RWHOZGRAXYWRNX-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims 2
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 claims 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 claims 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 claims 1
- 150000002338 glycosides Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 1
- -1 maltoheptaose compound Chemical class 0.000 abstract description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 7
- 230000004992 fission Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 2
- NEZJDVYDSZTRFS-RMPHRYRLSA-N Phenyl beta-D-glucopyranoside Chemical group O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1 NEZJDVYDSZTRFS-RMPHRYRLSA-N 0.000 abstract 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 8
- LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N UNPD55895 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N malto-tetraose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N maltotetraose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N 0.000 description 8
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 8
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 8
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 8
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 7
- 229950006191 gluconic acid Drugs 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 5
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 4
- FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N UNPD130147 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(OC4C(OC(O)C(O)C4O)CO)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 4
- FJCUPROCOFFUSR-UHFFFAOYSA-N malto-pentaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 FJCUPROCOFFUSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FJCUPROCOFFUSR-GMMZZHHDSA-N maltopentaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 FJCUPROCOFFUSR-GMMZZHHDSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 4
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 6-Phospho-D-gluconate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 101710125031 6-phosphogluconate dehydrogenase, NAD(+)-dependent, decarboxylating Proteins 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N alpha-maltohexaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N malto-hexaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NFBQIWJDUKFHJP-SQOUGZDYSA-N (2r,3s,4r,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-2-phosphonooxyhexanoic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C(O)=O)OP(O)(O)=O NFBQIWJDUKFHJP-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- KHITWSIKYBVTMR-VVTKTIMZSA-N (2s,3r,4r,5r)-4-[(2r,3r,4r,5s,6r)-5-[(2r,3r,4r,5s,6r)-5-[(2r,3r,4r,5s,6r)-5-[(2r,3r,4r,5s,6r)-5-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymeth Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)CO)[C@H](O)CO)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@@H](CO)O4)O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 KHITWSIKYBVTMR-VVTKTIMZSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZZMTSNZRBFGGU-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-7-fluoroquinazolin-4-amine Chemical compound FC1=CC=C2C(N)=NC(Cl)=NC2=C1 FZZMTSNZRBFGGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 125000006306 4-iodophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1I 0.000 description 1
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020001657 6-phosphogluconate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004567 6-phosphogluconate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FNZLKVNUWIIPSJ-UHNVWZDZSA-N D-ribulose 5-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023515 NAD kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010084634 NADP phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000009569 Phosphoglucomutase Human genes 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FNZLKVNUWIIPSJ-UHFFFAOYSA-N Rbl5P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- VFRROHXSMXFLSN-VANKVMQKSA-N [(2s,3s,4r,5s)-2,3,4,5-tetrahydroxy-6-oxohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O VFRROHXSMXFLSN-VANKVMQKSA-N 0.000 description 1
- NMLQNVRHVSWEGS-UHFFFAOYSA-N [Cl].[K] Chemical compound [Cl].[K] NMLQNVRHVSWEGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZNMXOKPQPNMY-UHFFFAOYSA-N [Mg].[Cl] Chemical compound [Mg].[Cl] QGZNMXOKPQPNMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009954 braiding Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 235000011475 lollipops Nutrition 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 125000006501 nitrophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004203 pancreatic function Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 108091000115 phosphomannomutase Proteins 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/10—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases p-Nitrophenol derivatives
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/805—Test papers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás és reagens o(-amlláz meghatározására.
Az Oc-amlláztükör meghatározása a szérumban fontos klinit kai paraméter a hasnyálmirigymüködés szempontjából· Az o^-amiláfc meghatározására szolgáló kereskedelmi forgalomban levő reagensek túlnyomórészt egy olyan rendszeren alapulnak, amelyben az (X-amlláz keményítőt bont le, és a keletkezett töredékeket mérjük látható vagy ultraibolya tartományban aszerint, hogy a vizsgálatnál amiláz-szubsztrátként színezett keményítőt vagy natív keményítőt használunk. Ilyen eljárás illetve reagensek . lényeges hátránya, hogy a keményítő makromolekulaként csak kevéssé kielégítően jellemezhető és állandósítható, úgy hogy az egyea tételek átszámítási hányadosai nagyon eltérően szórnak, és a méréseknél mindig standardot kell alkalmazni, jobb eredmárnyék elérésére egységes szubsztrát lenne szükséges, amely a ha<sitáanál megbízható eredményeket szolgáltat.
Egységesebb szubsztrát irányába egy lépést a maltopenta*6z alkalmazása jelentett. Ezt az ftr-amlláz maltotriózra és maitózra hasítja, a maltotriózt és maltózt az o(-glükozldáz glükóz^· zá alakítja át, amelyet azután tetszés szerinti módszerekkel, például az ismert hexokináz-módsserrel határozunk meg.
A maltopentaóz mellett már a maltotetraózt és a maltohexaózt is javasolták szubsztrátnak /3 879 265 és 4 000 Ó42. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás/. A tetraózzal azonban lényegesen rosszabb eredményeket értek el, mint a pentaózzal, és a hexaózzal még rosszabb eredményeket, mint a tetraózzal. A maltotetraóz és -pentaóz esetében még sztöehiometrlkus reakció adható meg, a hexaóz esetében azonban már élt éré^ sek állapíthatók meg a sztöchiometrlkus reakciótól.
A maltopentaóz hátránya még, ami a tetraóznál is megállapítható, hogy jelentős reagens-vakért ék lép fel, azaz a mérőreakoió már fut, mielőtt a meghatározandó mintát hozzáadjuk.; Ehhez még hozzájön, hogy ez a reagens-vakérték nagyobb szubaztrátkonoentráclóknál nem állandó, hanem több mint 25 percig válK tozlk, Mielőtt ennek a meílékreakciónak a konstansát eléri. Az' is kiderült, hogy a maltopentaóz pankreász-<K-amiláz éa nyál-o(-‘ -amiláz által történő feltételezett eltérő hasítása, amely^megkülönböztetést tenne lehetővé* ténylegesen nem áll fenn. DVB/ 0. 245* 5917 - 5927 /1970/; J. Biochem* 51, p. MI /1952/7* | A találmány célkitűzése ezért az, hogy egy olyan eljárást és egy olyan reagenst szolgáltasson áz ŐC-amiláz meghatározására, amelynél olyan szubsztratot alkalmazunk, amely tisztább és egységesebb, mint az iBmert szubsztrátok. könnyen hozzáférj hető, és szérum nélküli vakérték, a lag-fázls időtartama és az elérhető maximális aktivitás tekintetében a követelményeknek megfelel* Továbbá egy egyszerű mérési módszer keli, amely drága éa komplikált berendezések nélkül megvalósítható, es gyora-diágnosztlkumokhOB, igy tesztcsíkokhoz megfelel. 8
A találmány szerint ezt a feladatot ©Cramiláznak egy ö(-amilázszubsztrát enzimes hasításával és az - adott esetben átalakított - hasítási termék mennyiségének a fotometriáé mérésére szolgáló olyan eljárással oldottuk meg* amelyre az jellemző, hogy szubsztrátként egy 1 általános képletü Vegyületet alkalmazunk, ahol R jelentése glükózld-* fenil-glükozid-j mpnonitro-íenil-glükozíd-i dlnltro-feníl-gíükozid-i szorbit- vagy glükonaavosoport.
-2182.005
Meglepően azt találtjuk, hogy a maltoheptaóz az ¢4-ami láz szubsztrátjaként kiemelkedő tulajdonságokkal rendelkezik, jóllehet az erre a óéira már javasolt oligomaltózoknál a maltopen)· taóztól a maltohexaóz felé haladva ás alkalmasság lényeges esőkkenését állapítottuk meg» mivel ezzel lényegesen xősszebb ered* ményeket értünk el, mint a pentaóazal, Ezért az volt várhaté, hogy a matlóz-olígoszaoharldláno további hosszabbításával már nem helyesbíthető hibák léphetnek fel. Meglepetésszerűen azonban még jobb eredményeket értünk el, mint a pentaózsal. így a reagens-vakérték 0,02 ml-es mintánál maltopentaóz-saubsztxat esetében 75 %, maltoheptaóaaal ellenben csak 15 % a normál körülmények között végzett meghatározás végértékére vonatkoztatva·
Ezenkívül még azt találtuk, hogy a maltoheptaóa helyett bizonyos maltoheptaőz-származékok la alkalmazhatók, amelyek az o(-amiláz működése kor meghatározott hasítási termeket adnak, amely különösen előnyösen határozható meg·
A találmány szerinti eljárás különösképpen az $$-glükoai* házzal vagy maltóz-íoazfoxllázzai kapott hasltasi termékek meg* t határozásánál megfelelő.
7........... Az oC-glükoaidágzal és egy I általános képletü vegyület* tel - ahol . R jelentése glükozid - végzett meghatározásnál a maltoheptaóz, maltotetraóz és maltotrióz hasítási termékei tovább hasadnak glükózzá, és az utóbbit mérjük azután önmagában ismert módon. A keletkezett glükóz mérésére az b(-glükozidáz jelenlétében különösen a hexokináz-el járás előnyös. A találmány szerinti eljárás ezen kiviteli formájának elvét a következő egyenletek szemléltetik! Ö(-amiláz maltohepbaóz + HgO ----—> maltotrióz + maltotetrhmaltotrióz + 2HgO tX~81ükozidá^ 5 glükóz maltotetraóz + 5Η2θ — —-0glükóz glükóz + 7 ATP 7 glükóz-6-foszfát glükóz-6-foszfát + 7 —>7 6-f oszfo-glükonsav + 7 NADH + 7 H+ találmány ezen kiviteli formájához különösen megfeleA találmány ezen kiviteli formájához különösen megfele·* lök a találmány szerint alkalmazott olyan maltoheptaóz-származékok is, tehát az olyan I általános képletü vegyületek is, amelyekben R jelentése nem glükozidosoport* A két enzim, az ov-a* miláz és az (x-glükozidáz, hatására a szubsztituens, tehát egy fenilcsoport, mononitro-fenlícsoport vagy dinitro-fenilcsoport illetve a láncvégi szerbit- vagy glükonsav-caopoxt hasad le, éb könnyen meghatározható. A fenilcsoportok lehetnek oó- vagy/|-téiállásuak. Ha az oC-t ér állási ól van szó, úgy ezek lehasitasa végbemegy csupán c<-ami láz éstfc-glükozidáz hatására, és a lehasitott, szubsztituált vagy szubsztituálatlan fenolok azután ismert szihreakolókkal könnyen meghatározhatók. A találmány alkalmazható ‘ azonban/^-térállású szubsztituensek esetében is. Az utóbbi esetben az of-glükozidáz mellett még -glükózidázt is használunk.
A dinitro-fenilcsoportok esetében a két nitrocsoport kívánt helyzetben lehet, például 2,4-, 2,6- vagy 5,5-szubsztitu-‘ ensekként.
-3182.005
A nitrocsoportokat tartalmazó szubsztituensek lehasltása-*kor szabaddá- váló nltxo-fenolok illetve dinltro-fenolok maguk színes vegyületek. amelyek minden további nélkül optikailag meghatározhatók. Amennyiben fenol maga hasad le, úgy ez ismert módszerek szerint, például valamilyen nukleofll ágenssal, igy
3-metil-6-szulfonil-benztiazolon-2-hldrazonnal /HSK/ monofenoloxidáz jelenlétében végzett reakcióval határozható meg. Énnél a reakciónál vörös színezék képződik, amely mérhető»
Szerbit lehasitásaker ez például szorbit-dehidrogenázzal fxuktózzá oxidálható; egyidejűleg a jelenlévő NAD NADH-vá re-.. dukálódik. Az utóbbi képződése ismert módon ultraibolya spektrofotométerben könnyen meghatározható. Ha ilyen nem áll rendelke4 Se, úgy valamilyen tetrazólium-sóval, Így például INT-vel p-jód-fenil/-J-/p-ni t r o-f en11/-5-Í en i1-1 e tr a-z óli um-klór 1ddiaforáz vagy valamilyen más elektronátvivő jelenlétében -áltatva is színes formazán képződik, amely látható tartományban mérhető.
Hasonló módon határozható meg a felszabaduló glükonsav az itt ismertetett módszerek szerint, például glükonát-kinázzal,
6-foszfo-glükonsav-deliidrogenázzal és HADP-vel, valamint adott esetben tetrazóllumsóval és elektronátvlvővel.
A találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez általában 5 és 9 közötti pH-értékek megfelelők. Előnyösen 7 és 7»5 közötti ^H-értéken dolgozunk, mivel itt érjük el a legjobb eredményeket es a legrövidebb reakcióidőt. Amennyiben a találmány szerint nitxo-fenll-vegyületeket használunk, úgy a megfelelő pH-értékek tartománya valamivel szűkebb, és általában 6 és 8,5 pH közé esik.
Pufferként olyanok felelnek meg, amelyek az alkalmazott enzimekbe aktivitási tartományában működnek. Előnyös a foszfát, 1JEPES ni-/2-hidroxi-etil/-pipexazin-N-2-etánszulfonsavj és glibll-glicln. Előnyös koncentráció» a 10 és 200 mmól/lltex közötti.
Az (/-glükóz idázt általában 0,1 és 5000 egység/ml közötti mennyiségben használjuk. A találmány szerinti eljárás különös előnye, hogy ezen enzim viszonylag nagy mennyiségei alkalmazhatók, úgy hogy a sebességmeghatáxozó lépés az p<-ami lázhasit ás* Természetesen lehetséges az is, hogy ebből az enzimből még nagyobb mennyiségeket használjunk, ezzel azonban már semmilyen további előnyt nem érünk el.
A találmány szerint alkalmazott I általános képletü vegyületeket a vizsgálatban általában 0,1 és 250 mmól/liter közötti mennyiségben használjuk. Előnyös a 0,5 és 100 mmól/liter közötti mennyiség.
Az ÓC-amlláz maltoheptaózzal való szubsztráttelitődése 8-10 mmól/liter koncentrációnál van. Ezért célszerűen legalább 8 mmól maltoheptaóz minimális koncentrációt alkalmazunk, mivel a szubsztráttelltettség körülményei között kell dolgozni, ami rendszerint fennáll.
Ezenkívül célszerűen az o(.-ami lázhoz még valamilyen aktlválószert is hozzáadunk. Ilyenfajta aktiválószerek ismertek. Előnyös nátrium-klorid vagy kálium-klorid.
A találmány szerinti eljárás egy további előnyös kivitelezési formájánál a hasítási termékek meghatározása maltóz-fosfcforilázzal végzett reagáltatással történik glükóz-l-foszfát keletkezése közben, amelyet azután önmagában ismert módon határozunk meg. Egy különösen előnyös kiviteli forma szerint a glükóz-1-foszfát meghatározása fó-foszío-glukomutázzal glükoz-6-fősz
-4182.005 fáttá történő átalakítással, a képződött glükóz-6-foszfát glükóz-6-fossfát-dehidrogenáz jelenlétében NAD-dal 6-foszfo-glüko4 náttá és NADH-vá történő oxidációjával történik, ahol az utóbbi ^képződése íotometriáaan könnyen követhető. .A mérőjel még továbp erősíthető 6-foazfo-glükonát-dehldrogenáz jelenlétében NAD-dal írlbulóz-5-foazfáttá éa egy további molekula NADH-vá történő to4 ivábboxldálásaal.
Ennek a kivitelezési formának az elvét a következő egyenletek szemléltetik:
maltoheptaóz + HgO maltotrióz + maltotetraóz maltóz + PoJ“ glükóz +/J-glükóz-l-foazfát * * fl-glükőz-l-foazfál; gIükóz-6-foazfát gIükóz-6-foazfát + MD+
6-foazío-glükonát + NADH + H+
- 6-foszfo-glükonát+ NAD+ribulóz-5-foazfát + NADH + H*
A találmány ezen kiviteli formájának előnye az. hogy a maltóz-íoszfoxiláz specifikusabb, mint az 0^-glükozldaz, és ezéxt endogén glükóz nem zavar.
A pufferre vonatkozólag a találmány szerinti eljárás kiviteli formájára ugyanaz érvényes, mint az QÓ-glükozidázos eljá·* rásra.
A találmány szerinti eljárás előbb felsorolt két kiviteli formáján kívül a maltoheptaóz keletkező töredékeinek,.agaz a maltotetraóznak» maltotrióznak és az ezekből képződő maltóznak a meghatározása más eddig ismert módszerekkel is történhet.
A találmány tárgya továbbá niég egy ÖC-amiláz meghatározására szolgáló reagens, amely egy CC-amiláz-azubsztrátot és egy az oó-amilaz-szubsztrátból oé-amiláz hatására keletkező hasítási termék meghatározására alkalmas rendszert tartalmaz, amelyre at jellemző, hogy a szubsztrát egy I általános képletü vegyület. i A hasítási termékek meghatározására előnyös rendszer az pt-glükozldáz-rendszer, amely o<-glükozidázt, alkáli-klór Időt és puffért tartalmaz. fia a szubsztrát ffiágfl ffisítöheptaóz, úgy enzimként még hexokináz /HK/ és glükóz-ö-foszfát-dehidrogenáz /G6PDH/, valamint NAD, ATP éa magnézium szükséges.
Egy Oó-glükozidáz-rendszeren alapuló reagens előnyösen a következőkből áll:
x 10* - 3 x lo4 egyaég/1 flí-glükozidáz,
10^ - 5 x 104 egység/l hexokináz»
10* - 5 x 104 egyaég/1 glüköz-6-foszfát-dehldrogenáz, 0J5 - 8 mmól/1 NAD;-------------------------'—-----~---------------0,5-5 mmól/1 ΑΤΡ»
1-3 mmól/1 Mg2+,
- 100 mmól/1 NaOl vagy Κ01»
- 200 mmól/1 6
- 100 mmól/1 ma
Eaetleg ennek többazötösét vagy törtrészét tartalmazza száraz vagy oldott formában.
»2 - 7*8 pfi-ju puffer ltoheptaóz.
-5182.005
Egy másik előnyös kivitelezési formában a reagens o(-glükozldázból, kálium- vagy nátrlum-kloridból, pufferból és azubdjatxátból áll. Ilyenfajta reagens a koncentrációkat a vizsgálati* oldatra számítva 102 - 5 x 10° egység/1 OC-glükozldázt, 1- 100 mmól/] NaCl-ot vagy KCl-ot, 10 - 250 mmó1/1 5-9 pH-ju puffért és 0,1 - 25O mmól/1 I általános képletü maltoheptaoz-származékot tartalmaz. A reagens lehet száraz, különösen liofilizált formában, vagy oldat formájában az összes alkotók elegyeként vagy külön-külön.
Egy további kivitelezési forma szerint a találmány szerinti előbbi fajta reagens még Λ-glükozidázt vagy/és fenol-oxlidázt és 3-metll-6-szulfonll-benztiazolon-2-hldrazont /HSK/ tartalmaz.
A találmány egy további kivitelezési formája szerint a találmány szerinti reagens (/-glükózidáz, nátrium-klorid vagy kálium-klór ld, puffer es szubsztrát mellett még szorbit-dehidrogenázt és NAD-t vagy glükonát-kinázt, ATP-t, 6-foszfo-glükonsav-dehldrogenázt és NADP-t valamint adott esetben valamilyen tetrazóliumsót és diaforázt illetve fenazin-metoszulfátot /TMS/ tartalmaz. 2 6
Egy ilyenfajta előnyös reagens 1 x 10^ - 3 x 10° egység/l O^rglükozidázt, 2 x 10^ - 5 x 104 egység/l szorbit-dehidrogenázt, 1 x 10? - 5 x IO4 egység/l hexokinazt, 0,5 - 50 mmól/1 ATP-t, 10 - 500 egység/l diaforázt /Chlostrldium Kluyveri/, 0,01-0,5 mmól/1 tetrazóliumsót, 0,1 - 10 mmól/1 NAD-t, 0,2 - 5 mmól/í magnézium-klór időt, 0,5 - 20 mmól/1 maltoheptitet, 1 - 100 mmol/1 NaCl-ot vagy Kcl-ot és 10 - 250 mmól/1 5»5 - 8,5 pH-ju puffért tartalmaz.
Adott esetben még egy nemionos felületaktív anyag is jelen van 5 és 50 mmól/1 közötti mennyiségben. fi
Egy szintén előnyös kiviteli forma 100 - 3 x 10° egység/l θζ-glükozidázt, 10 - IO*1- egység/l 6-foszf o-glükonát-dehldrogenázt, 20 - 2 x 10^ egység/l glükonát-kinázt, 0,5 - 25 mmól/1 ATP-t, 0,05 - 1,0 mmól/1 NADP-t, 1,0 - 20 mmól/1 maltoheptaglükonsavat, 0,5 - 5 mmól/1 magnézlum-kloridot, 1-100 mmol/1 nátrlum-kiőridót és 10 - 250 mmól/1 5,5 - 8,5 pH-ju puffért tartalmaz.
Egy találmány szerinti további reagens
0,1 - 250 mmól/1 (Z-/nitro-fenil/-maltoheptaozidot vagy /dinitro-fenil/-maltohepvaozidot, x 102 - 2,5 x 106 egység/l (Xr-glükozldázt,
- 100 mmól/1 nátrium-kloridőt vagy kálium-klór időt és
- 25O mmól/1 7,0 -.8,0 pH-ju foszfátpuffért tartalmaz.
A találmány szerinti reagens egy másik kiviteli formája a következőket tartalmazza:
0,1 - 250 mmól/1 b(-fenil-maltoheptaozid, x 102 - 1,5 x 10θ egység/l P(-glükozidáz,
- 10^ egység/l monofenoloxldáz,
0,1 - 10 mmól/1 3-metil-5-szulfonil-benztiazolon-2-hid-i xazon /112 K/,
- 100 mmól/1 NaCl vagy K01 és
- 25O minól/1 puffer.
-6182.005
Egy másik előnyös rendszer a hasadási termékek meghatároz zására a maltóz-foszforiláz-rendszer, amely lényegében maltóz-foazforilázból, A-foszfo-glükomutázból //1PMG/. glükóz-6-foszfát-dehldrogenázbol /G6PDH/, glükóz-l,6-dlfoszfátból /G1,6DP/, HAD-ból, pufféiból, maltoheptaózból és adott esetben 6-foszfo-glükonát-dehldxogenázból /6PGDH/ áll.
Egy ezen a meghatározási rendszeren alapuló különösen e-
x 1CT - 3 x ICr egység/l glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz!,
0,5 - 10 mmól/1 NAD,
0,001 - 1 mmól/1 glükóz-l,6-difoszfát,
A találmány szerinti reagens lehet száraz vagy oldott formában ,' lehet valamilyen lapformáju hordozón, például valamilyen fólián, szlvóképes papíron vagy hasonlón, amely impregnálva van vele. Az utóbbi esetben ez oélszerüen legalább három rétegből áll, ahol az első réteg a szubsztrátot tartalmazza, a második réteg záxóréteg, és a harmadik réteg tartalmazza a hasítási termékek meghatározására szolgáló rendszert. Ha egy ilyen többrétegű reagensanyagot, amely o^-amiláz egyszerű gyorsvizsfálatának kivitelezésére szolgál, egy cX-amllázt tartalmazó folyékony mintával hozzuk érintkezésbe, úgy az oUamlláz hasítja a szubsztrátot, és a töredékek átdiffundálnak a közbülső rétegen a harmadik, a mérőrendszert tartalmazó rétegbe. Kimutatási reakcióként ebben az esetben célszerűen valamilyen szlnképző reakciót alkalmazunk, hogy az o^-amlláz koncentrációját a fellépő elszíneződéssel láthatóvá tegyük, mivel a hasítási termékek maguk már nem színesek.
A találmány szerint alkalmazott maltoheptaóz-származékok, különböző módszerekekkel állíthatók elő. A fenllezett származék esetében mind kémiai mind enzimatikus módszerek alkalmazhatók.' A kémiai szintézis a peracetilezett maltoheptaóz és fenol Frledel-Orafts katalizátor jelenlétében végzett reagáltatásán alapszik, az enzimatikus módszer esetén a megfelelő fenil-glükozidot mlkrobiálls transzfexáz jelenlétében transzglükozilez-* zük. Az R helyén szoxbit- vagy glükonsavcsoportot tartalmazó I általános képletü vegyületeket maltoheptaóz redukálásával vagy oxidálásával állíthatjuk elő. Ezeket az eljárásokat magyar szabadalmi bejelentésünkben Írjuk le részletesen.
Amint mar említettük, a találmány által nemcsak egy gyors és specifikus eljárást nyerünk az Q(-amiláz kimutatására, hanem különösen a lag-rázist kerüljük el egészen vagy messzemenően, ami különösen jelentős az eljárás analizáló automatákra való alkalmazásakor. Azonkívül a találmány szerinti eljárás sok ki-* vitel! formájában a kiértékelésre szolgáló komplikált berendezések nélkül kivitelezhető, és ezért különösen gyorsdlagnosztlkumokhoz es látható tartományban történő optikai meghatározásra megfelelő. Egyidejűleg a találmány szerinti eljárás különböző kiviteli formái még ultraibolya-mérőkészülékekkel is mérhetők. További előny a szigorú arányosság, és az, hogy a
-7182.005 vér kémiailag rokon tartalmi anyagai semmilyen zavart nem okozónak.
A találmány szerint alkalmazott szubsztrátok jól és nagy tisztaságban hozzáférhetők. A maltoheptaóz egy egyszerű előállítását a 27 41 191. 2 sz. német szövetségi köztársasági szabadalmi leírásban közlik. Az eljárás megfelelő az o(-amiláz bio-jlóglai folyadékokban, igy szérumban, heparinplazmában, vizelet* ben és hasonlókban, vagy más folyékony vagy szilárd anyagokban’ történő meghatározására.
A következő példák szemléltetik á találmányt.
1. példa
Maltogén módszer /(X-glükozidáz-rendszer/.
Egy C4-glükozldázt, glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt, hexokinázt, NAD-ot, ATP-t, maltoheptaózt, Mg^+-t, nátrium-kloridot és foszfátpuffért tartalmazó reagenskeveréket oldunk 2,0 ml desztillált vízben. A reagens szobahőmérsékleten körülbelül 1 óráig, +8°0 alatti hőmérsékleten 6 óráig tárolható.
A kapott oldatban a reagensek koncentrációja a következői
| foszfátpuffer, pH 7»0 NaCl Mg2+ Maltoheptaóz ATP NAD hexokináz glükóz-6-foszfátydehidrogenáz Ö^-glükozidáz | 50 mmól/liter, 50 mmól/1, 2 mmól/1, 10 mmól/1, 1,2 mmól/1 2 mmól/1, ^2 egység/l, 2:2 egység/l, ÍSIO egység/l. |
Az oldatot 25°C-on 0,02 ml szérummintával elegyítjük, egy 1 cm rétegvastagságú küvettába töltjük, és utána megmérjük az extinkclót egy fotométeren Hg 365 nm-nel, 340 nm-nél vagy Hg 334 nm-nél. Az extinkclót 10 perc elteltevei olvassuk le, és utána a leolvasást egyperces Időközökben ötször megismételjük.
Az Így megállapított percenkénti extinkclókülönbségekből
A számítás a következőképpen történik:
egység/llter 25°C 4244 χΔΐϊ^θ^ nm/pero a 2290 nm/pero a 2335 χΔΕ^^ nm/pero.
Az 1. ábra humán szérum fiziológiás konyhasóoldattal való higitási sorozatának eredményeit mutatja, amelyeket ezzel a módszerrel kaptunk.
I-Ia a reagenst két részre osztjuk, amelyek közül az egyik^ a maltoheptaózt és a másik az összes többi reagens elegyét tar^· talmazza, úgy az ezzel készített oldatok tárolhatósága javíthat tó. A reagensek elegye +8°C alatti hőmérsékleten 30 órát, szó-’ hahóméraékleten körülbelül 8 órát tárolható. A maltoheptaóz oldat eltarthatósága a fenti körülmények között 6 hét illetve körülbelül 1 hét.
-8182.005
2. példa
Meghatározás a maltóz-foszforiláz rendszerrel.
Két reagenst készítünk, amiláz-szubsztrátból és a maltóz-f oszf or Ház-rendszerből. Az egyik reagens malto-heptaóz-szubsztrátot tartalmaz, a másik a technika állásának megfelelően oldható keményítőt. A reagens-koncentráció a vízben történő feloldás után a következő:
találmány összehasonlítás foszfátpuffer
NAD
Maltoheptaóz
Oldható keményítő
Glükóz-1,6-difoszfát
Maltóz-f oszf or Ház /mikroorganizmusból/ ft-Foszío-glükomutáz /mikroorganizmusból/ .........
G6PDH /Leuconostoc mesent./ 6PGDH /Leuconostoc mesent./ mmól5 pH 6,5 mmól mmól nyomnyi egység/ml egység/ml egység/ml egység/ml mmól; pH 6,5 mmól mg/ml nyomnyi egység/ml egység/ml egység/ml egység/ml
A kapott oldatot 30 °C-on inkubáljuk, és egy,fotométerben Hg 334 nm-nél elegyítjük a mintaoldeittalj és egy fotométerben Hg 334 nm-néí meghatározzuk az extinkciokülönbséget. Az extinkciókülönbséget 10 perces előinkubálás után 10 percen át mérjük.
2,0 ml reagens és 0,10 ml minta esetén a következő számi*tási képletet használjuk:
________________ . . 2,1 x 1000 .
AE/perc x 2 = ^E/perc x 1699 egyseg/1.
öt különböző*humán szirtim mérésekor a fenti reagensekkel a következő eredményeket kaptuk:
Szérum találmány
37,4 egység/1
61,2 egyseg/l
95,1 egység/1 114egység/1 374 egys ég/1 keményítő
15.3 egység/1
27.3 egyseg/l
39.1 egység/1
44.2 egység/1
161 egység/1
3· példa.
(X-Amlláz kimutatás fenll-04-maltoheptaozld szubsztráttal. Fenil-(Xrmaltoheptaozidot az (Xr-amiláz fenll-V^nialto-triiddé vagy -tetraiddá hasit, amelyeket O^-glükozidáz fenolra és glükózra bont le. A szabaddá vált fenolt monofenoloxidázzal oxidálva a 3-metil-6-szulfonll-benztiazolon-2-hldrazon'/HSK/ nukleofll reagenssel vörös színezékké kapcsoljuk, amelynek képződési sebessége arányos a minta amiláz-aktivitásával, és foto— metriásan nyomonkövetkező.
A vizsgálat elve:
l.a/ fenll-O^-maltoheptaozld + HgO fenll-o(-D- 1 -tri-/tetra/-glükoplranozid + maltotetra-/tri/-óz
-9182.005 b/ f enil-OC-D-tri-/tetra/-glükoplranozid + 5/4/H20 fenol + 5 /4/ glükós c/ fenol + HSK + 02 monofenol^idáz^ azinezék + 2 HgO Mérési körülmények:
°0, hullámhossz 492 nm, 1 cm-ea küvettaj a reagensösszetételt a következő táblázat mutatja.
Reagens
Foszfátpuffer, pH = 7,4 Nátrium-klorid
Fen 11-P^-D-ma 11 ohept aoz i d
HSK
Monofenoloxldáz p4-Glükozidáz
Koncentráció a vizsgálatnál
0,05 mól/liter,
0,05 mól/1, nmól/1, mmól/1, egység/ml;
egység/ml.
_________________Vizsgálati térfogat: 2,0 ml, __ _______ . _______________________________ Foszfátpuffer helyett glicin-, glicil-gllcin-, HEPES-, trisz-, tra- éa egyéb puffer ia használhatónak bizonyult.
4. példa.
Dí-Amiláz meghatározása p-nltro-íenil-maltoheptaoziddal.
A vizsgálat elve: , /p-n itro-feni l/-0^-mal t ohepta ο z1 d--—— >/ g lükóz / + /p-nitro-fenilZ-O^/glükóz/^^^^i^- n glükóz + p-nitro-fenol.
A maltoheptaozid hasítása után a hasítási termékek glükózra éa p-nitro-fenolra hasadnak. A p-nltro-fenolát anion lúgos oldatban sárga szinü, és ezért optikai utón közvetlenül mérhető.
Vizsgálati rendszer:
Reakcióelegy: 50 mmól/1 foazfátpuffer, pH = 7»4 mmól/1 nátrium-klorid,
5-50 egyaég/1 oí-glükozidáz, ill. 10 mmól/1 /p-nitro-fenil/-ö£-maltoheptaozid.
Vizsgálati elegy:
ml reakcióelegy + 50 /il minta /szérum/. Hőmérséklet: 50 °0.
Hullámhossz: 405 nni. ...........
Szérum hozzáadása a mérési hőmérséklet elérése után /10 pero elolnkubácló/.
5. példa
O(-Amiláz-ineghatározás maltoheptaittel.
-10182.005
A vizsgálat elve:
maltoheptait + H2O maltotxilt + maltotetraóz maltotriit + H20 azorbit + maltóz azorbit. + NAD+ SDH ^fruktóz + NADH + H+
NADH + INT + H+ ΖάΙ^£.°£ίξ> formázán + NAD+
SDH » szorbitdehidrogenáz
INT = 2-/p-jód-f enll/-5-/p-nitro-fenil/-5-f enil-tetrazólium-f klórid.
Mérési rendszer:
| Reakcióelegy összetevői | ml | koncentráció a vizsgálat- |
| ———TTár---— | ||
| Na-/K-PCk-pufféi, 0,02 mól/1 | 1,92 | 12,8 mmól/1 PO., |
| + Triton X100 2 ml/100 ml | ||
| +NaCl 10 mmól/1, pH = 6,9 | - .... 6,4 mmól/1 ---------------------- | |
| Magnézium-klórid 0,5 mól/1 | 0,01 | 1,0 mmól/1 |
| Maltoheptait 100 mmól/1 | 0,10 | 5,5 mmól/1 |
| NAD c =, 40 mg/ml | o,C5 | 1,0 mmól/1 |
| INT c = 0,6 mg/ml | 0,20 | 0,09 mmól/1 |
| Diaforáz /Cloatr.Kluyverl/ | 0,05 | 167 egység/1 |
| 5 mg/ml+ | ||
| ATP c = 50 mg/ml | 0,10 | 5,29 mmól/1 |
| Hexokináz 280 egység/ml+......- | 0,05 | 4666 egység/1 - |
| SDH 180 egység/ml+ | 0,50 | 18000 egység/1 |
| PÖ-Glükozidáz 1120 egység/ml4’ | 0,20 | 74670 egység/1 |
| Minta /szérum./ | 0,02 |
+ pufféiban
Indulás a minta hozzáadásakor; a mérés 492 nm-en történik. Hőmérséklet: 25 °c.
6. példa.
O^rAmiláz-meghatározás maltoheptaglükonsavval.
A vizsgálat elve:
maltoheptaglükonaav + H^O maltot rloglükonsav + maltotetraóz.
maltotrioglükonsav + HP0 O^glükosXdá.z^ giükonsav + mai........tÓZ . . .. .. ' ;..... '..........
giükonsav + ATP gbükonát-kináz>;>fi_.f oszf o-glükonsav + ADP
6-foszfo-glükonsav + NADP+ S-fossfoglukonsav-dehiaro£22Í£5»rlbulóz-5-toszfát + NADPH + C02 + H+
-11182.005
Vizsgálati rendszer:
| Boakclóelegy összetevői | iái | koncentráció a vizs latnál |
| Na-/K~Pp?|-puffer 0,02 mól/1 | 2,19 | 14,6 mmól/1 foszfát |
| + NaCl 1Ó mmól/1, pH =6,9 | 7,5 mmól/1 NaCl | |
| Magnézium-klorId 1 mól/1 | 0,01 | 5,5 mraól/1 |
| Halt o Léptug1ük on s av | 0,10 | 5 mmól/1 |
| 150/mmól/l | ||
| NADP c = 10 mg/ml | 0,10 | 0,58 mmól/1 |
| ΛΤΡ c = 50 mg/ml | 0,10 | 2,7 mmól/1 |
| Glükonálí-kináz 40 egység/ml | 0,05 | 1066 egység/1 |
| 6-Fos zfo-glükonsav-dehidxo- | ||
| genáz 24 egység/ml | 0,10 | 800 egvség/l |
| -Glükozldáz 1120 egység/ml | 0,50 | 11,2x10^ egység/l |
| Minta /szérum/ | 0,02 |
Indulás a minta hozzáadásakor, a mérés 540 vagy 565 nm-en történik.
Hőmérséklet: 25 °C.
Vizsgálati térfogat: 5,00 ml.
7. példa
Megfelelő műanyag vliest. például Linzer VS 552 jelű ilyen anyagot /vagy más szivókepes alapanyagot, például papirt/ az alábbi komponenseket tartalmazó oldattal impregnálunk, majd körülbelül 50 percen át 50 °c hőmérsékleten szárítjuk:
7,4 pH-értékü foszfát-puffer 0,05 mol/llter nátrium-klorid 0,05 mol/llter fenil-O^-D-maltoheptaozid 10 mol/llter
HSK 1 mmol/liter monofenoloxidáz 1000-5000 egyaég/liter
04glükozidáz 10.000-50.000 egység/liter
Ezután az impregnált anyagból 6 mm-es csíkokat vágunk és megfelelő hordozóiollara erősítjük ezeket, majd 6 mm szeles tesztcsíkokat vágunk ki belőlük. Ezek a tesztcsíkok körülbelül 10 /uliter szérum felvitele után különböző intenzitású vörös elszíneződést ZAnlQY körülbelül 500 nm/ mutatnak, amelynek az alapján meghatározhatjuk a szérum Λ-ami láz-tart almát. A kiértékelést vizuálisan végezhetjük például színskálával történő öszszehasonlitással, remisszlo méréssel.
8. példa
Az előző példában alkalmazott anyagot az 5· példában .szereplő oldattal impregnáljuk, amelynek a diaforáz-tartalmát azonban 2000 egység/literre növeltük. Az Impregnált anyagot 50 percen át 50 ö0 hőmérsékleten szárítjuk, majd a 7· példában leírt módon járunk el. 10yulitex szérum felcseppentése után itt Is vörös elszíneződés jelentkezik /<Lax 500 nm/, amelyet a 7· példában említett módokon értékelhetünk ki.
Claims (3)
- Szabadalmi igénypontok1. (X-Amiláz szubsztrátot és az amiláz szubsztrátból az (X-amiláz hatáaáxa keletkező hasitásl termék meghatározására szolgáló rendszert tartalmazó reagens cX-amiláz meghatározására, az-4 zal [jellemezve, hogy j a/ szubaztrátként. 0,1-250 mmol/liter /1/ általános képle- ’tü vegyületet - az /1/ általános képletbenR jelentése glükozid-. fenil-glükozid-, mononitro-íenll-glüi kozid-, dinitro-fenil-glükozid-, szorbit- vagy glükonsav-oso- .v&xcuuxuv 4.V — J · XV χινσχ (/V— £ χ IáILVú Λ U.CkZi U * í 1-100 mmol/liter nátrium- vagy kállum-kloridőt, i 10-250 mmol/liter 5-9 pH-értékü puffért, adott esetben ^-glükozidázt és1/ olyan /1/ általános képletű szubsztrát esetén, amelyben R glükozldcsoportot jelent, hexokinázt, glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt, NAD-t, ATP-t és MG2* iont szolgáltató vegyületet,11/ olyan /1/ általános képletű szubsztrát esetén, amelyben I? fenil-glükozld-csoportot jelent, monofenol-oxidázt és egy nukleofil ágenst, előnyösen 3-metil-6-szulfonil-benztiazolon-2-hidrazont, j 111/ olyan /1/ általános képletű szubsztrát esetén, amelyben R szorbitcsoportot jelent, szorbit-dehidrogenázt, NAD-t, ATP-t, Mg2+~iont szolgáltató vegyületet és adott esetben valamilyen tetrazólium-sót és egy elektronátvivőt, előnyösen diaforázt, valamint adott esetben felületaktív anyagot, iv/ olyan /1/ általános képletű szubsztrát esetén, amelyben R glükonsav-csoportot jelent, glükonát-kinázt, ATP-t, 6-foszfo-glükonsav-dehidxogenázt, NADP-t, Mg2+-iont szolgáltató vegyületet és adott esetben valamilyen tetrazóliumsót és egy élektronátvivőt, előnyösen dlaforázt, valamint adott esetben felületaktív anyagot, vagy b/ azubsztrátként 5-50 mmol/liter olyan /1/ általános képletű vegyületet, amelyben R glükozldcsoportot jelent, valamint 0,5*105-2’10^ egység/liter maltóz-foszforilázt és 0,5-100 mmol/liter 6,0-7,5 pH-értókü puffért éa a hasítási termék fotometrias mérésének a lehetővé tételére ty-íoszío-glüko-mutázt, glükóz-6-foszfát-dehldrogenázt, NAD-t, glükóz-1.6-dlfoszfátot es adott esetben 6-foazfo-glükonát-dehldrogenazt tartalmaz, adott esetben valamilyen lapalaku hordozóanyagba felszivatva vagy beépítve. /Elsőbbsége: 1977· december u./Ϊ 2. Az 1. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja azzal jellemezve, hogy5x10* - 3x10^ egység/liter c£glükozidázt,10* - 5x10^ egység/liter hexokinázt,105 - 5xlcA egyaég/llter glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt,0,5-θ mmol/liter NAD-t,-13182.0050,5-5 mmol/liter ATP-t,1-3 mmol/liter Mg2+__^25-100 mmol/liter NaCl-ot vagy KCl-ot,5-100 inraol/lltér maltoheptaózt vagy ezek többszörös ót vagy törtrészét tartalmazza oldott vagy oldat készítésére alkalmas száraz formában. /Elsőbbségei 1977· szeptember 13·/J. Az 1. Igénypont szer inti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy0,5*10^ - 2x10^ egység/liter maltóz-foszforilázt, p Zl
- 2x10 - JxlO egység/liter glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt,0,5-10 mmol/liter ITAD-t,0,001-1 mmol/liter glükóz-l,6-difoszfátot,0,5-100 mmol/liter 6,0-7,5 pH-ju puffért,5-50 mmol/liter maltoheptaózt, és adott esetben1x10^ - lxlO4 egység/liter 6-foszfo-glükönát-dehldrogenázt tartalmaz. /Elsőbbségei 1977- szeptember 13./
- 4. Eljárás θζ-amiláz meghatározására, azzal jellemezve* hogy az O^-amiláztartalmu próbához szubsztrátként 5 és 9 közötti pH-értéken O?l-25O mmol/liter /1/ általános képletü vegyületet - az I általános képletbenR jelentése glükozid-, fenil-glükozid-, mononitro-fenll-glükozid-, dinitro-fenil-glükozid-, szorbit- vagy glükonsav-csoport -, vagy előnyösen 0,1-250 mmol/liter /1/ általános képletü vegyületet tartalmazó, 1. igénypont szerinti reagenst adunk és a kapott hasítási termék mennyiségét fotometriásan meghatározzuk. /Elsőbbsége: 1977· december 14./
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2741192A DE2741192C2 (de) | 1977-09-13 | 1977-09-13 | Verfahren zur Bestimmung von alpha- Amylase |
| DE19772755803 DE2755803A1 (de) | 1977-12-14 | 1977-12-14 | Verfahren und reagens zur bestimmung von alpha-amylase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU182005B true HU182005B (en) | 1983-12-28 |
Family
ID=25772710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU78BO1734A HU182005B (en) | 1977-09-13 | 1978-09-12 | Method and reagent for determining alpha-amylase |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4544631A (hu) |
| JP (1) | JPS5451892A (hu) |
| AR (1) | AR217476A1 (hu) |
| AT (1) | AT362526B (hu) |
| AU (1) | AU521908B2 (hu) |
| CA (1) | CA1120836A (hu) |
| CH (1) | CH651590A5 (hu) |
| CS (1) | CS236765B2 (hu) |
| DD (1) | DD138921A5 (hu) |
| DK (1) | DK153335C (hu) |
| ES (2) | ES473296A1 (hu) |
| FI (1) | FI61916C (hu) |
| FR (1) | FR2402872A1 (hu) |
| GB (2) | GB2058780B (hu) |
| HK (1) | HK54785A (hu) |
| HU (1) | HU182005B (hu) |
| IE (1) | IE47953B1 (hu) |
| IL (2) | IL55408A (hu) |
| IT (1) | IT1099451B (hu) |
| LU (1) | LU80213A1 (hu) |
| MY (1) | MY8600101A (hu) |
| NL (1) | NL190818C (hu) |
| SE (2) | SE433857B (hu) |
| SG (1) | SG21085G (hu) |
| YU (1) | YU44180B (hu) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2741192C2 (de) * | 1977-09-13 | 1982-07-01 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von alpha- Amylase |
| JPS60997B2 (ja) * | 1978-01-31 | 1985-01-11 | 東洋紡績株式会社 | アミラ−ゼ活性測定法 |
| EP0048035B1 (en) * | 1978-06-06 | 1983-12-07 | Flow General, Inc. | Maltodextrin phosphorylase limit dextrin and method of producing it |
| JPS5768798A (en) * | 1980-10-14 | 1982-04-27 | Toyo Jozo Co Ltd | Novel measurement of amylase activity |
| US4622295A (en) * | 1982-09-16 | 1986-11-11 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Modified oligosaccharides used as substrate for measuring α-amylase activity |
| DE3323245A1 (de) * | 1983-06-28 | 1985-01-10 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren und reagenz zur bestimmung von (alpha)-amylase |
| DE3328616A1 (de) * | 1983-08-08 | 1985-02-28 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Oligoglucosidderivate |
| JPS60114193A (ja) * | 1983-11-22 | 1985-06-20 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規なマルトースデヒドロゲナーゼおよびその製法それを用いる分析法 |
| US4649108A (en) * | 1984-07-26 | 1987-03-10 | Genzyme Corporation | Alpha amylase assay |
| US4794078A (en) * | 1984-07-26 | 1988-12-27 | Genzyme Corporation | Alpha amylase assay |
| JPS6183195A (ja) * | 1984-08-24 | 1986-04-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 新規なオリゴサツカライド誘導体、及びこれを基質として用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 |
| JPS61124397A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Toyobo Co Ltd | α−アミラ−ゼの活性測定用試薬 |
| DE3508384A1 (de) * | 1985-03-08 | 1986-11-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Hemmung humaner speichel- und pankreasamylase durch monoklonale antikoerper |
| SE451849B (sv) * | 1985-12-11 | 1987-11-02 | Svenska Sockerfabriks Ab | Sett att syntetisera glykosidiska bindningar samt anvendning av pa detta sett erhallna produkter |
| US4782018A (en) * | 1986-01-17 | 1988-11-01 | Eastman Kodak Company | Detection of hydrolyzing enzymes |
| DE3621271A1 (de) * | 1986-06-25 | 1988-01-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung von alpha-amylase |
| US4963479A (en) * | 1986-10-07 | 1990-10-16 | Hoechst Celanese Corporation | Reagent system for an alpha-amylase assay containing aromatic substituted glycoside |
| US5158872A (en) * | 1986-10-07 | 1992-10-27 | Hoechst Celanese Corporation | Aromatic substituted glycoside |
| WO1989000600A1 (en) * | 1987-07-17 | 1989-01-26 | Ivan Endre Modrovich | Stable, single-liquid alpha-amylase reagent |
| US4932871A (en) * | 1987-11-20 | 1990-06-12 | Miles Inc. | Rapid method for preparing chromogenic alpha-amylase substrate compounds at high preparative yields |
| DE3743908A1 (de) * | 1987-12-23 | 1989-07-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue oligoglucoside |
| DE3929355A1 (de) * | 1989-09-04 | 1991-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen bestimmung von pankreas-(alpha)-amylase |
| JP2576910B2 (ja) * | 1990-04-13 | 1997-01-29 | 富士写真フイルム株式会社 | 免疫分析要素および免疫分析方法 |
| US5300634A (en) * | 1991-05-07 | 1994-04-05 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for producing maltooligosaccharide derivative |
| JP3075377B2 (ja) * | 1991-11-06 | 2000-08-14 | 東洋紡績株式会社 | α−アミラーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬 |
| KR100308524B1 (ko) * | 1998-07-24 | 2001-09-26 | 박영구 | 광학적으로 순수한 (ｓ)-3-히드록시-감마-부티로락톤의 제조방법 |
| KR100374358B1 (ko) * | 2000-07-13 | 2003-03-04 | 주식회사 코메드 | 미생물 동정을 위한 비피검사법과 구연산염 검사법을대체하는 글루코시드 분해검사배지와 셀로비오스분해검사배지 및 그 검사법 |
| US20040096948A1 (en) * | 2002-11-15 | 2004-05-20 | Yunping Huang | Glycoprotein cleavage protocol for oligosaccharide analysis |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT986838B (it) * | 1972-05-12 | 1975-01-30 | Sclavo Inst Sieroterapeut | Complesso di reagenti per la deter minazione enzimatica del glucosio sistema glucosio ossidasi perossi dasi con metodo manuale e automati co con lettura a termine o in cinetica |
| US3879263A (en) * | 1973-09-06 | 1975-04-22 | Du Pont | Method for the determination of amylase |
| US4000042A (en) * | 1973-09-06 | 1976-12-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Diagnostic reagent for the determination of amylase |
| US3867259A (en) * | 1973-11-08 | 1975-02-18 | American Cyanamid Co | Lactate dehydrogenase test material |
| DE2600526C3 (de) * | 1976-01-08 | 1981-06-19 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung H↓2↓O↓2↓ bildenden Substanzen und Reagens zu seiner Durchführung |
| US4036697A (en) * | 1976-02-13 | 1977-07-19 | Beckman Instruments, Inc. | Kinetic assay for alpha-amylase |
| US4097336A (en) * | 1976-02-13 | 1978-06-27 | Beckman Instruments, Inc. | Reagent system for beta-amylase assay |
| US4059407A (en) * | 1976-04-14 | 1977-11-22 | Becton, Dickinson And Company | Disposable chemical indicators |
| CA1096376A (en) * | 1976-07-13 | 1981-02-24 | William B. Farnham | Process for preparing nitroaromatic glycosides |
| NL179399C (nl) * | 1976-07-13 | 1986-09-01 | Du Pont | Werkwijze voor de bepaling van het amylase-gehalte van een monster en reagens-proefpakket daarvoor. |
| US4081326A (en) * | 1976-10-07 | 1978-03-28 | The Board Of Trustees Of The University Of Alabama | A method for removing maltotetraose and lower saccharides from solution |
| US4071407A (en) * | 1976-11-16 | 1978-01-31 | The Board Of Trustees Of The University Of Alabama | Novel maltase enzyme produced by a new yeast strain |
| US4102747A (en) * | 1977-07-28 | 1978-07-25 | American Hospital Supply Corporation | Amylase determination |
| DE2748036C2 (de) * | 1977-10-26 | 1986-08-21 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase oder/und β-Phosphoglucose-mutase und Verwendung derselben |
| US4233403A (en) * | 1978-02-27 | 1980-11-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Amylase assay |
| US4219571A (en) * | 1978-06-15 | 1980-08-26 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for producing a sweetener |
| US4225672A (en) * | 1979-02-27 | 1980-09-30 | Hall Leo M | Method for producing maltooligosaccharide glycosides |
| US4932871A (en) * | 1987-11-20 | 1990-06-12 | Miles Inc. | Rapid method for preparing chromogenic alpha-amylase substrate compounds at high preparative yields |
-
1978
- 1978-08-14 AT AT589778A patent/AT362526B/de not_active IP Right Cessation
- 1978-08-16 CA CA000309495A patent/CA1120836A/en not_active Expired
- 1978-08-17 NL NL7808528A patent/NL190818C/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-08-22 IL IL55408A patent/IL55408A/xx active IP Right Grant
- 1978-08-23 DK DK372178A patent/DK153335C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-08-29 AR AR273483A patent/AR217476A1/es active
- 1978-08-30 IT IT27180/78A patent/IT1099451B/it active
- 1978-09-04 SE SE7809278A patent/SE433857B/sv not_active IP Right Cessation
- 1978-09-06 GB GB8033088A patent/GB2058780B/en not_active Expired
- 1978-09-06 GB GB7835813A patent/GB2004646B/en not_active Expired
- 1978-09-08 FR FR7825964A patent/FR2402872A1/fr active Granted
- 1978-09-11 LU LU80213A patent/LU80213A1/de unknown
- 1978-09-11 CH CH9494/78A patent/CH651590A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-09-11 DD DD78207746A patent/DD138921A5/xx unknown
- 1978-09-11 AU AU39750/78A patent/AU521908B2/en not_active Expired
- 1978-09-12 IE IE1838/78A patent/IE47953B1/en not_active IP Right Cessation
- 1978-09-12 HU HU78BO1734A patent/HU182005B/hu unknown
- 1978-09-12 FI FI782789A patent/FI61916C/fi not_active IP Right Cessation
- 1978-09-12 YU YU2162/78A patent/YU44180B/xx unknown
- 1978-09-13 JP JP11183678A patent/JPS5451892A/ja active Granted
- 1978-09-13 ES ES473296A patent/ES473296A1/es not_active Expired
-
1979
- 1979-04-27 ES ES480028A patent/ES480028A1/es not_active Expired
- 1979-11-29 CS CS798241A patent/CS236765B2/cs unknown
-
1981
- 1981-05-21 IL IL62923A patent/IL62923A0/xx unknown
- 1981-10-16 US US06/311,856 patent/US4544631A/en not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-01-17 SE SE8400206A patent/SE454357B/sv not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-03-21 SG SG210/85A patent/SG21085G/en unknown
- 1985-07-18 HK HK547/85A patent/HK54785A/xx not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-12-30 MY MY101/86A patent/MY8600101A/xx unknown
-
1990
- 1990-06-27 US US07/545,092 patent/US5108913A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU182005B (en) | Method and reagent for determining alpha-amylase | |
| US4847196A (en) | Stabilized composition of tetrazolium salts | |
| JPS6365314B2 (hu) | ||
| US4857640A (en) | Process and reagent for the determination of α-amylase | |
| CS273162B2 (en) | Diagnostic agent for glicosidases activity determination | |
| US6448029B1 (en) | Method and reagent for quantitative determination of 1,5-anhydroglucitol | |
| EP0173255A2 (en) | Oligosaccharide derivatives and their use as substrate for measuring alpha-amylase activity | |
| US5962248A (en) | Quantitative determination method for chloride ions | |
| US4012286A (en) | Determination of creatine phosphokinase in body fluids | |
| US4794078A (en) | Alpha amylase assay | |
| US5350678A (en) | Method of differential assay for α-amylase isozymes and a kit for the same | |
| GB2200989A (en) | Method and agent for detection of thiols | |
| JPS63109798A (ja) | α−アミラ−ゼの定量法及び定量用試薬 | |
| JP3124435B2 (ja) | α‐アミラーゼアイソザイム活性の分別定量法 | |
| CS236758B2 (en) | Method of determining of alpha-amylase | |
| JPS6317895A (ja) | 新規なオリゴサツカライド誘導体、及びこれを用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 | |
| JP2000189194A (ja) | α―アミラ―ゼ活性測定試薬及び測定方法 | |
| JP2000300293A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法および定量試薬 | |
| JPH0532687A (ja) | アルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体、これを有効成分とするα‐アミラーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα‐アミラーゼ活性の測定方法 | |
| JPS63305000A (ja) | α−アミラ−ゼ活性の測定試薬 | |
| JPH0646895A (ja) | α‐アミラーゼ活性の測定方法 | |
| JPS6365313B2 (hu) | ||
| SI7812162A8 (sl) | Postopek za določitev alfa-amilaze | |
| JPH08291A (ja) | α−アミラーゼ活性の測定方法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬 | |
| JPH09322798A (ja) | α−アミラーゼ活性の測定方法及び測定試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 |