DE2755803C2 - - Google Patents

Description

Im Hauptpatent wird ein Verfahren zur Bestimmung von α-Amylase durch enzymatische Spaltung eines Amylasesubstrats und Messung eines Spaltprodukts beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Substrat Maltoheptaose verwendet wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Spaltprodukte dieser Reaktion durch α-Glucosidase in Glucose überführt und letztere wird dann schließlich bestimmt.

In weiterer Ausbildung dieses Verfahrens wurde nunmehr gefunden, daß anstelle der Maltoheptaose selbst auch bestimmte Maltoheptaose-Derivate verwendet werden können, welche bei Einwirkung der beiden genannten Enzyme, also α-Amylase und α-Glucosidase ein derivatisiertes Spaltprodukt bilden, welches sich besonders vorteilhaft bestimmen läßt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung von α-Amylase durch enzymatische Spaltung eines α-Amylasesubstrats und Messung eines Spaltprodukts nach Patent Nr. 27 41 192, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Substrat ein enzymatisch hergestelltes Maltoheptaose-Derivat der Formel I

verwendet wird, in der R eine Phenylglucosid-, Mononitrophenylglucosid- oder Dinitrophenylglucosidgruppe darstellt.

Das gemäß der Erfindung verwendete enzymatisch hergestellte α-Amylase-Substrat ist einem entsprechenden chemisch hergestellten Substrat hinsichtlich seiner Brauchbarkeit für die α-Amylase-Bestimmung weit überlegen. Gemäß (1) (Abstract 117 zum 173. ACS-Meeting, New Orleans, Louisiana 3/1977) erfolgt die Herstellung der p-Nitrophenylderivate aus einer Oligosaccharidmischung mit einer Kettenlänge von 4 bis 10 Einheiten durch Acetylierung, gefolgt durch Umsetzung mit p-Nitrophenol in Gegenwart von Zinnchlorid und anschließende Deacetylierung mit Natriummethylat in Methanol. In der älteren DE-OS 28 22 364 wird dieses Verfahren von den drei Autoren, die in (1) angegeben sind, näher beschrieben. Im nachgereichten Beispiel 6 wird das nach dem Verfahren von Beispiel 1 der DE-OS 28 22 364 chemisch erhaltene Produkt mit der erfindungsgemäß verwendeten enzymatisch hergestellten und dadurch optisch reinen p-Nitrophenyl-α-Heptaose verglichen und gezeigt, daß mit dem erfindungsgemäßen, enzymatisch hergestellten Substrat die Extinktionsdifferenz gegenüber dem chemisch hergestellten Produkt bis zu sechsmal größer ist entsprechend einer Verbesserung der Empfindlichkeit um etwa 600%, wobei auch eine deutliche Verringerung der lag-phase erzielt wird.

Bei der Einwirkung der beiden Enzyme wird der Substituent, also eine Phenylgruppe, Mononitrophenylgruppe oder Dinitrophenylgruppe abgespalten und läßt sich leicht bestimmen. Die Phenylgruppen können in α- oder β-Stellung stehen. Handelt es sich um die a-Stellung, so erfolgt deren Abspaltung durch die Einwirkung von α-Amylase und α-Glucosidase alleine und die abgespaltenen, substituierten oder unsubstituierten Phenole lassen sich dann nach bekannten Farbreaktionen leicht bestimmen. Die Erfindung läßt sich aber auch bei β-ständigen Substituenten anwenden. Im letzteren Fall wird zusätzlich neben der α-Glucosidase auch noch β-Glucosidase verwendet.

Bei den Dinitrophenylresten können die beiden Nitrogruppen in beliebiger Stellung vorliegen, beispielsweise als 2,4-, 2,6- oder 3,5-Substituenten.

Die bei der Abspaltung der Nitrogruppen enthaltenden Substituenten freiwerdenden Nitrophenole bzw. Dinitrophenole sind selbst gefärbte Verbindungen, die sich ohne weiteres optisch bestimmen lassen. Wird Phenol selbst abgespalten, so läßt sich dieses nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung mit einem nucleophilen Agens, wie 3-Methyl-6-sulfonyl-benzthiazolon-hydrazon-(2) (HSK) in Gegenwart von Monophenoloxidase bestimmen. Bei dieser Reaktion wird ein roter Farbstoff gebildet, der gemessen werden kann.

Sämtlichen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist gemeinsam, daß überraschenderweise hierbei die bisher stets auftretende lag-phase praktisch völlig vermieden wird. Dies bedeutet einen entscheidenden Vorteil gegenüber allen bisher bekannten Verfahren, bei welchen zum Teil sehr erhebliche lag-phasen als unvermeidlich in Kauf genommen werden mußten.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind im allgemeinen pH-Werte zwischen 5 und 9 geeignet. Bevorzugt wird bei pH-Werten zwischen 7 und 7,5 gearbeitet, da hierbei die besten Resultate und die kürzeste Reaktionszeit erhalten werden. Werden erfindungsgemäß Nitrophenylverbindungen eingesetzt, so ist der Bereich der gut geeigneten pH-Werte etwas enger und liegt im allgemeinen zwischen pH 6 und pH 8,5.

Hinsichtlich der verwendbaren Puffer gelten die Ausführungen im Hauptpatent entsprechend. Bevorzugt werden also Phosphat, HEPES (N-(2-Hydroxyäthyl)-piperazin-N-2-äthansulfonsäure) und Glycylglycin. Auch die Konzentration der Puffer entspricht dem Hauptpatent, bevorzugte Konzentrationen liegen zwischen 10 und 200 mMol/l.

Die α-Glucosidase wird im allgemeinen in Mengen zwischen 0,1 und 5000 U/ml eingesetzt. Es ist ein besonderer Vorzug des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß relativ große Mengen dieses Enzyms verwendet werden können, so daß die α-Amylasespaltung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist. Es ist natürlich auch möglich, noch höhere Mengen an diesem Enzym einzusetzen, hierdurch werden jedoch keine weiteren Vorteile mehr erzielt.

Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen der allgemeinen Formel I werden im Test im allgemeinen in Mengen zwischen 0,1 und 250 mMol/l eingesetzt. Bevorzugt werden Mengen zwischen 0,5 und 100 mMol/l.

Außerdem wird zweckmäßig ein Aktivierungsmittel für die α-Amylase zugesetzt. Derartige Aktivierungsmittel sind bekannt. Bevorzugt wird Natriumchlorid oder Kaliumchlorid.

Die erfindungsgemäß verwendeten Maltoheptaose-Derivate können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden. Soweit es sich um die phenylierten Derivate handelt, lassen sich sowohl chemische als auch enzymatische Methoden anwenden. Die chemische Synthese basiert prinzipiell auf der Umsetzung von peracetylierter Maltoheptaose mit dem entsprechenden Phenol in Gegenwart eines Friedel-Crafts-Katalysators. Diese Methode eignet sich sowohl für Phenol selbst als auch für Mononitrophenol und Dinitrophenol. Alternativ ist es auch möglich, zuerst das Phenylderivat herzustellen und dieses anschließend zu nitrieren, z. B. mit dem in Bull. Chem. Soc. Japan 34, (1961), 718, beschriebenen Verfahren. Diese Methode eignet sich insbesondere für das Mononitro-Derivat, wobei unter Umständen eine Trennung der entstandenen o- und p-Nitrophenylderivate vorgenommen werden kann.

Vorzugsweise wird diese Umsetzung durch Schmelzen oder Kochen am Rückfluß in unpolarem Lösungsmittel mit ZnCl₂, SnCl₄ oder TiCl₄ als Friedel-Crafts-Katalysator durchgeführt. Nach der Einführung des Phenols bzw. Nitrophenols werden die Schutzgruppen in an sich bekannter Weise abgespalten, beispielsweise mit Natriummethylat, Ammoniak, KOH oder Bariummethoxid, jeweils in methanolischer Lösung, mit wäßriger Bariumhydroxidlösung usw.

Die enzymatische Herstellung der Phenylderivate erfolgt durch Transglucosidierung des Phenylglucosids bzw. der entsprechenden nitrierten Phenylglucoside mit α-Cyclodextrin, Amylase oder löslicher Stärke in Gegenwart einer spezifischen mikrobiellen Transferase. Bevorzugt wird hierzu eine Transferase aus Bacillus macerans verwendet. Dabei läßt sich für diese Transglucosidierung die bekannte Amylase von Bacillus macerans (E.C.2.4.1.19. DSM 24; Isolierung: J. A. de Pinto, L. L. Campbell, Biochemistry 7, (1968), 114; Transfer-Reaktion: Methods in Carbohydr. Chemistry, Vol. II, 347) verwenden, welche neben ihrer hydrolytischen und cyclisierenden Wirkung offenbar auch eine glucosyltransferierende Wirksamkeit aufweist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Bestimmung der α-Amylase, enthaltend ein α-Amylasesubstrat, α-Glucosidase und ein System zur Bestimmung eines aus dem Amylasesubstrat durch Einwirkung der α-Amylase und der α-Glucosidase gebildeten Spaltprodukts, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Substrat ein Maltoheptaose-Derivat der allgemeinen Formel I darstellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Reagens aus α-Glucosidase, KCl oder NaCl, Puffer und Substrat. Ein derartiges Reagens enthält insbesondere 10² bis 5×10⁶ U/l α-Glucosidase, 1 bis 100 mMol/l NaCl oder KCl, 10 bis 250 mMol/l Puffer, pH 5 bis 9 und 0,1 bis 250 mMol/l Maltoheptaose-Derivat der allgemeinen Formel I, bezogen auf die Konzentration im Test. Das Reagens kann in trockener, insbesondere lyophilisierter Form, oder in Form einer Lösung, als Mischung aller Bestandteile oder getrennt vorliegen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält ein erfindungsgemäßes Reagens der obigen Art zusätzlich noch β-Glucosidase oder/und Phenoloxidase und HSK.

Ein weiteres Reagens der Erfindung enthält:

0,1 bis 250 mMol/l α-Nitrophenyl-maltoheptaosid oder Dinitrophenyl-maltoheptaosid,
1×10² bis 2,5×10⁶ U/l α-Glucosidase,
1 bis 100 mM/l Natriumchlorid oder Kaliumchlorid und
10 bis 250 mM/l Phosphatpuffer, pH 7,0 bis 8,0.

Noch eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagens enthält:

0,1 bis 250 mMol/l α-Phenylmaltoheptaosid,
1×10² bis 1,5×10⁶ U/l α-Glucosidase,
10 bis 10⁵ U/l Monophenoloxidase,
0,1 bis 10 mMol/l HSK,
1 bis 100 mMol/l NaCl oder KCl und
10 bis 250 mMol/l Puffer.

Das erfindungsgemäße Reagens kann auch auf einem blattförmigen Träger imprägniert vorliegen, beispielsweise auf saugfähigem Papier, einer Kunststoffolie oder dergleichen.

Wie bereits erwähnt, wird durch die Erfindung nicht nur ein rasches und spezifisches Verfahren zur Bestimmung der α-Amylase geschaffen, sondern insbesondere wird die lag-phase ganz oder weitgehend beseitigt, was von besonderer Bedeutung bei der Anwendung des Verfahrens auf Analysenautomaten ist. Außerdem läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren in vielen Ausführungsformen ohne komplizierte Apparaturen für die Auswertung durchführen und eignet sich daher insbesondere für Schnelldiagnostica und zur optischen Bestimmung im sichtbaren Bereich. Gleichzeitig lassen sich die verschiedenen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens jedoch auch mit UV-Meßgeräten bestimmen. Weitere Vorteile sind strenge Proportionalität und keine Störung durch chemisch verwandte Inhaltsstoffe des Bluts.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1 Herstellung von α-Phenylmaltoheptaosid a) Tridecosacetyl-β-D-maltoheptaose

57,6 g (50 mM) Maltoheptaose und 41 g (500 mM) Natriumacetat wasserfrei werden in 543 ml (5,75 Mol) Essigsäureanhydrid suspendiert und 4 Stunden lang bei 100°C kräftig unter Feuchtigkeitsausschluß gerührt. Nach Abkühlung auf ca. 60°C wird in ca. 1 l Eiswasser eingerührt und über Nacht bei 4°C weitergerührt, wobei eine zähe, halbkristalline Masse ausfällt. Nach Abgießen des Überstands wird der Rückstand erneut mit Eiswasser verrührt. Dabei kristallisiert das Produkt durch. Es wird abgetrennt, gewaschen und getrocknet.

Ausbeute 80,7 g (76% d. Th.) farblose Kristalle
= +137,5° (c = 1,15 Chloroform) Fp. = 150° (unscharf)

Die Mutterlauge (das Dekantat) wird im Vakuum zur Trockne eingeengt und der Rückstand ebenfalls mit Eiswasser verrieben und zur Kristallisation gebracht.

Ausbeute 22,3 g
= +136° (c = 1 Chloroform) Fp. = 150°.
Gesamtausbeute 103 g 97% d. Th.

Das Produkt kann aus Äthanol umkristallisiert werden, wobei sich auch nach mehrmaligem Umkristallisieren Fp. und Drehwert nicht ändern. Das Produkt ist daher am C₁-Atom optisch einheitlich ( β ) konfiguriert.

b) Dodecosacetyl-α-phenyl-D-maltoheptaosid

9,54 g (4,5  mM) Tridecosacetyl-β-D-maltoheptaose, 0,61 g (4,5 mM) frisch geschmolzenes ZnCl₂ und 4,23 g (45 mM) destilliertes Phenol werden unter Feuchtigkeitsausschluß 2,5 Stunden lang bei 100°C gerührt. Dann wird noch warm in Äthylacetat gelöst und mit je 2×100 ml H₂O, 3×100 ml 1 N NaOH, 100 ml 1 N Essigsäure und 100 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die anfänglich braune Lösung wird dabei hellgelb. Nach Trocknen über MgSO₄ wird zur Trockne eingeengt und in warmem Methanol (30 ml) aufgenommen. Nach Stehen über Nacht scheidet sich ein sirupartiges Material ab, das aus Äthanol kristallisiert wird.

Ausbeute 8,7 g (90% d. Th.) Fp. = 155-165°C (Zersetzung)
= +147° (c = 8 in Chloroform)

c) Phenyl-α-D-maltoheptaosid

10,8 g (5 mM) Peracetyl-1-phenyl-α-D-maltoheptaosid werden warm in 200 ml absolutem Methanol gelöst und bei Raumtemperatur unter Zusatz von etwas Dioxan unter Rühren mit 30 ml 0,1 N Natriummethylat versetzt und 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach 20 Minuten beginnt sich das Produkt halbkristallin abzuscheiden. Schließlich wird mit 200 ml Aceton versetzt, auf 4°C abgekühlt und abgesaugt. Das Produkt wird in Wasser gelöst (160 ml), mit Aktivkohle entfärbt und mit Kationenaustauscher (Dowex 50 H⁺) im batch entsalzt.

Ausbeute 5,6 g (91% d. Th.) farbloses Lyophilisat
= +176° (c = 10 in H₂O)

Das Produkt enthält noch etwas freie Maltoheptaose und - nach HPLC-Analyse (Detektion bei 254 nm) - noch 2 UV-positive Verunreinigungen. Diese werden durch Chromatographie an vernetztem Dextran (Sephadex LH20) mit Wasser als Elutionsmittel abgetrennt.

Beispiel 2 Herstellung von p-Nitrophenyl-α-D-maltoheptaosid a) Peracetyl-p-nitrophenyl-α-D-maltoheptaosid

13,6 g (20 mM) Peracetyl-maltoheptaose, hergestellt nach Beispiel 1, a), werden mit 11,9 g (100 mM) p-Nitrophenol in 90 ml absolutem Benzol gelöst und unter Rühren und Feuchtigkeitsausschluß mit 10,4 g = 4,5 ml (40 mM) SnCl₄ versetzt. Dabei fällt eine voluminöse Masse aus, die sich jedoch beim Erwärmen wieder löst. Es wird 1 Stunde lang unter Rückfluß gekocht. Beim Abkühlen fällt eine zähe Masse aus, die nach Zusatz von 80 ml Äthylacetat wieder in Lösung geht. Beim Einrühren der Lösung in 180 ml 2 N Na₂CO₃-Lösung fällt SnCl₂ aus. Dieses wird unter Zusatz von etwas Aktivkohle abgetrennt. Die wäßrige Phase wird abgeschieden und die organische Phase gut gewaschen, zuletzt mit gesättigter NaCl-Lösung. Nach dem Trocknen und Einengen der Lösung erhält man ein harziges Produkt, das aus Äthanol kristallisiert.

Ausbeute 6,2 g (41% d. Th.) Fp. = 100°C (Zersetzung)
= +131° (c = 1 in Chloroform)

Das Produkt erhält man auch, wenn man den Ansatz in Chloroform oder mit TiCl₄ statt SnCl₄ durchführt.

b) p-Nitrophenyl-α-D-maltoheptaosid

5,5 g (7 mM) Peracetyl-p-nitrophenyl-maltoheptaosid wird in 100 ml absolutem Methanol aufgeschlämmt und mit 5 ml einer ca. 1 N Natriummethylat-Lösung versetzt. Das Ausgangsmaterial wird honigartig und löst sich langsam. Nach einiger Zeit beginnt die kristalline Abscheidung des entacetylierten Produkts, die nach Rühren über Nacht vollständig ist. Es wird abgesaugt, mit Methanol gewaschen und getrocknet.
Ausbeute 2,8 g (86% d. Th.)
= +124° (c = 0,6 in H₂O)

Das Produkt wird an vernetztem Dextran (Sephadex LH20) mit Wasser als Elutionsmittel gereinigt. Man erhält 1,2 g (45%) der oben beschriebenen Verbindung, die im enzymatischen Test aktiv ist. Außerdem wurde die Verbindung auch durch Nitrieren von α-Phenylmaltoheptaosid von Beispiel 1 mit Nitriersäure nach Bull. Chem. Soc. Japan 34 (1961), 718, beschrieben.

Unter Verwendung von Dinitrophenol anstelle von Mononitrophenol erhält man die entsprechenden Dinitrophenylverbindungen.

Beispiel 3

p-Nitrophenyl-α-D-maltooligosaccharide durch enzymatische Synthese mit Bacillus macerans-amylase (E.C.2.4.1.19 aus Bac. mac. DSM 24).

Bacillus macerans-amylase hat neben hydrolytischer und cyclisierender Wirkung auch Glycosyl-transferierende Eigenschaften, die zur Synthese von Oligosacchariden und -derivaten ausgenützt werden können (Methods in Carbohydrate Chemistry II, 347). Für die Synthese von p-Nitrophenyl-oligosacchariden wurde dieses Verfahren wie folgt optimiert:

680 mg Bacillus macerans-amylase (E.C.2.4.1.19 aus Bac. mac. DSM 24) (Lyophilisat) (0,46 U/mg Einwaage, Proteingehalt der Einwaage 28,5%, frei von p-Nitrophenyl-α-D-glucosid-spaltenden Aktivitäten), 400 mg α-D-p-Nitrophenylglucosid, 3,5 g α-Cyclodextrin, und 70 ml Soerensen Phosphat-Puffer, pH 6,2; 0,01 M werden gemischt. Der Ansatz wird 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Zur Aufreinigung wird dann α- und entstandenes β-Cyclodextrin zunächst über die Tetrachloräthylen-Einschlußverbindung abgetrennt. Nach Chromatographie an vernetztem Dextran (Sephadex LH20) erhält man 50 mg Lyophilisat von im Amylase-Test hochaktivem p-Nitrophenyl-maltoheptaosid.

Beispiel 4 Nachweis von α-Amylase mit Phenyl-α-maltoheptaosid als Substrat

Phenyl-α-maltoheptaosid wird von der a-Amylase in Phenyl-α-maltotriid oder -tetraid gespalten, welche durch α-Glucosidase zu Phenol und Glucose umgesetzt werden. Das freigesetzte Phenol wird durch Monophenoloxidase oxidativ mit dem nucleophilen Reagens 3-Methyl-6-sulfonyl-benzthiazolon-hydrazon-(2) (HSK) zu einem roten Farbstoff gekuppelt, dessen Bildungsgeschwindigkeit proportional zur Amylaseaktivität in der Probe ist und photometrisch verfolgt werden kann.

Testprinzip Meßbedingungen

25°C, Meßwellenlänge 492 nm, 1 cm Küvetten; die Reagenszusammensetzung zeigt folgende Tabelle.

Tabelle

Anstelle von Phosphatpuffer erwiesen sich auch Glycin-, Glycylglycin-, Hepes-, Tris-, Tra- und andere Puffer als brauchbar.

Beispiel 5 Bestimmung von α-Amylase mit p-Nitrophenyl-maltoheptaosid Testprinzip

Nach der Spaltung des Maltoheptaosids werden die Spaltprodukte zu Glucose und p-Nitrophenol abgebaut. Das p-Nitrophenolatanion ist in alkalischer Lösung gelb gefärbt und kann daher direkt optisch gemessen werden.

Testsystem

Reaktionsgemisch:
50 mM/l Phosphatpuffer, pH 7,4
50 mM/l Natriumchlorid
5 bis 50 U/ml α-Glucosidase
5 bzw. 10 mM/l p-Nitrophenyl-α-maltoheptaosid

Testansatz

1 ml Reaktionsgemisch + 50 µl Probe (Serum)
Temperatur: 30°C
Wellenlänge: 305 nm
Serumstart nach Erreichen der Meßtemperatur (10 Minuten Vorinkubation)

Beispiel 6 (nachgereicht) Synthese von α/β-(4-Nitrophenyl)-maltoheptaosid a) Peracetylierte Maltoheptaose

10 g (87 mMol) Maltoheptaose Ch. 39
10 g Pyridin
40 ml Essigsäureanhydrid
wurden zusammengegeben und 3 Stunden bei 95°C im Ölbad gerührt und dann auf ca. 1 l Eiswasser gegossen. Unter Rühren wurde das Produkt fest. Nach Absaugen, Waschen und Trocknen wird aus Ethanol umgefällt.

Ausbeute: 17,3 g = 81,6% d. Th.
Fp.: 131-135°C

b) Umsetzung von peracetylierter Maltoheptaose mit 4-Nitrophenol

16 g (7,5 mMol) peracetylierte Maltoheptaose
2,8 g (20 mMol) 4-Nitrophenol
50 ml Benzol
25 ml Chloroform (mit CaCl₂ ethanolfrei gemacht)
wurden mit 1,2 ml SnCl₄ zunächst 15 min lang am Rückfluß erhitzt, dann erneut mit 1,2 ml SnCl₄ versetzt und 15 min lang gekocht.

Die Mischung wurde nach Abkühlen mit Ethylacetat (100 ml) versetzt und zunächst mit Wasser, dann mit gesättigter NaHCO₃-Lösung erschöpfend extrahiert zur Entfernung des nicht umgesetzten 4-Nitrophenols.

Nach Trocknung der org. Phase über MgSO₄ wurde eingeengt der feste Rückstand über CaCl₂ getrocknet.

Ausbeute: 13 g ohne Säulenchromatograpie
DC (Kieselgel, Diisopropyläther, Chloroform, Eisessig 6 : 3 : 1) zeigt noch viel (ca. 70%) Ausgangsmaterial

Synthese von α/β-(4-Nitrophenyl)-maltoheptaosid gemäß Patent Driscoll

c) Abspaltung der Schutzgrupen

 3,5 g Produkt aus b)
30,0 ml Methanol abs
12,5 ml Dichlormethan abs
wurden mit 100 mg Natrium in 5 ml Methanol versetzt.

Nach ca. 10 min erschien ein Niederschlag. Nach 2 Stunden wurde dieser abzentrifugiert und 6mal mit Methanol/Dichlormethan gewaschen, zuletzt unter Zusatz von einigen Tropfen Essigsäure.

Schließlich wurde der Niederschlag mit Äther gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 2 g
DC: Kieselgel 60 F254 auf Glas, Merck Nr. 5729

freie Zucker/Heptaose, Hexaose, Pentaose) ca. 80%
kürzerkettige 4-Nitrophenylglycoside in Spuren.

Der Vergleich des enzymatisch hergestellten, optisch reinen pNP-α-G₇ mit dem chemisch hergestellten pNP-G₇ Racemat wurde im Amylasetest aufgrund der von Driscoll beschriebenen Bestimmungsmethode (Beispiel 2 der DE-OS 28 22 364) durchgeführt. Je nach Amylasegehalt der Probe beträgt die Extinktionsdifferenz nach 10 Min.:

Die Extinktionsdifferenz ist also für das enzymatisch hergestellte pNP-α-G₇ bis zu sechsmal größer als für das chemisch hergestellte pNP-G₇.

Ein weiterer Vorteil zeigt sich in der Verringerung der lag-phase (s. o.).

Claims (6)

1. Verfahren zur Bestimmung von α-Amylase durch enzymatische Spaltung eines α-Amylasesubstrats und Messung eines Spaltprodukts nach Patent Nr. 27 41 192, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat ein enzymatisch hergestelltes Maltoheptaose-Derivat der Formel I verwendet wird, in der R eine Phenylglucosid-, Mononitrophenylglucosid- oder Dinitrophenylglucosidgruppe darstellt.

2. Verfahren zur Bestimmung von α-Amylase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Maltoheptaose-Derivat hergestellt ist durch Umsetzung des jeweiligen Phenylglucosids bzw. nitrierten Phenylglucosids mit α-Cyclodextrin, Amylase oder löslicher Stärke in Gegenwart von Bacillus-macerans-amylase.

3. Reagens zur Bestimmung der α-Amylase, enthaltend ein α-Amylasesubstrat, α-Glucosidase und ein System zur Bestimmung eines aus dem Amylasesubstrat durch Einwirkung der α-Amylase und der α-Glucosidase gebildeten Spaltproduktes, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Maltoheptaose-Derivat nach einem der Ansprüche 1 und 2 darstellt.

4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß es 10² bis 5×10⁶ U/l α-Glucosidase,
1 bis 100 mMol/l NaCl oder KCl,
10 bis 250 mMol/l Puffer, pH 5 bis 9 und
0,1 bis 250 mMol/l Maltoheptaose-Derivat der allgemeinen Formel I, bezogen auf die Konzentration im Test, enthält.

5. Reagens nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich nach β-Glucosidase oder/und Phenoloxidase und 3-Methyl-6-sulfonyl-benzthiazolon-hydrazon-(2) enthält.

6. Reagens nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einem blattförmigen Träger imprägniert vorliegt.