DD247284A5 - Diagnostisches In-Vitro-Mittel zum Nachweis der Beta-D-Galactosidase - Google Patents
Diagnostisches In-Vitro-Mittel zum Nachweis der Beta-D-GalactosidaseInfo
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Abstract
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung diagnostischer In-vitro-Mittel, mit denen b-D-Galactosidase auf einfache, schnelle und zuverlaessige Weise bestimmt werden kann. Die erfindungsgemaessen diagnostischen Mittel enthalten als chromogene Substrate Phenolsulfonphthaleinyl-b-D-galactoside der allgemeinen Formel I, in der beispielsweise bedeuten: R1 bis R4, die gleich oder verschieden sein koennen, jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Nitro- oder eine Aminogruppe R5 bis R12, die gleich oder verschieden sein koennen, jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Niederalkyl-, eine Hydroxy-, eine Niederalkoxy-, eine Carboxyl- oder eine Nitrogruppe M ein Proton, ein Alkali-, ein Erdalkali- oder ein Ammoniumion. Formel (I)
Description
in der
R1 bis R4, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, Halogen, ein Nitro-oder eine Aminogruppe R5bis R12, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Niederalkyl-, eine Hydroxy-, eine Niederalkoxy-, eine Carboxyl- oder eine Nitrogruppe
M+ ein Proton, ein Alkali-, ein Erdalkali-oder ein Ammoniumion bedeuten, eingesetzt werden.
2. Diagnostisches in-vitro-Mittel gemäß Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß als zusätzliche Hilfsmittel Netzmittel, Oxidationsmittel, galenische Zusatzstoffe oder/und Gerüstbildner verwendet werden.
Die Erfindung betrifft ein diagnostisches in-vitro-Mittel zum Nachweis des Enzyms /3-D-Galactosidase.
Oligo- oder Polysaccharide, die D-Galactose mit /3-glycosidischer Bindung enthalten, kommen in fast allen Organismen vor.
Demgemäß sind auch die entsprechenden /3-D-Galactosidasen (EC 3.2.1.23) weit verbreitet und können in zahlreichen Mikroorganismen, Tieren und Pflanzen nachgewiesen werden.
Eine vielfache physiologische Funktion erfüllt die /3-D-Galactosidase im Säugetierbereich: Sie spielt eine gewichtige Rolle im Kohlenhydratstoffwechsel, da durch sie die Hydrolyse der Lactose erfolgt. Darüber hinaus stellt die /3-D-Galactosidase das Schlüsselenzym beim Abbau von Glycolipiden, Mucopolysacchariden und Glycoproteinen dar.
Über ihren physiologischen Stellenwert hinaus hat die /3-D-Galactosidase in den letzten Jahren im diagnostischen Bereich an Bedeutung gewonnen. So wird beispielsweise dieses Enzym in zunehmendem Maße als Indikator-Enzym für Enzymimmunoassays eingesetzt (siehe beispielsweise Annals of Clinical Biochemistry 16,221-224 [1979]).
Die Bestimmung der Aktivität der ß-D-Galactosidase spielt demnach sowohl in der klinischen Chemie als auch in der Diagnostik eine zunehmende Rolle. Hierzu wird ganz allgemein die galactosidasehaltige Probe mit einem geeigneten /3-D-Galactosidase-Su bstrat versetzt. Das Substrat wird von dem Enzym gespalten. Eines der Spaltprodukte wird in geeigneter Weise nachgewiesen.
Es kann entweder das durch Einwirkung des Enzyms freigesetzte Glycon oder das Aglycon gemessen werden. In der Regel wird letzteres bestimmt. Als Substrat eignen sich das natürliche Substrat Lactose sowie insbesondere ein chromogenes Galactosid.
So sind in Biochem. Z. 333,209 (1960) Phenyl-/3-D-Galactosid sowie einige weitere am aromatischen Ring substituierte Derivate
(z. B. o-Nitrophenyl- und p-Nitrophenyl-ß-D-galactosid) als Substrate der /3-D-Galactosidase beschrieben. Die durch Hydrolyse freigesetzten Phenole werden photometrisch im UV-Bereich bzw. bei den Nitrophenolen im kurzwelligen sichtbaren Wellenlängenbereich bestimmt. Auch kann als Indikatorreaktion eine oxidative Kupplung mit Aminoantipyrin angeschlossen werden (Analytical Biochem. 40,281 [1971]).
Für histochemische Untersuchungen werden zum einen Naphthyl-/3-D-Galactoside verwendet: So z.B. die 1-Naphthyl-Verbindung in Histochemie 35,199 (1973), das 6-Brom-2-naphthyl-Derivat in J. Biol. Chem. 195,239 (1952) oder das Naphthol-AS-BI-/3-D-galactosid (Histochemie 37,89 [1973]). Zur Visualisierung werden dabei die entsprechenden Naphthole mit verschiedenen Diazoniumsalzen zu Azo-Farbstoffen umgesetzt.
-I-
Ferner ist S-Brom^-chlor-indoxyl-ß-D-galactosid als Substrat der /3-Galactosidase bekannt. Indikator-Reaktion ist hier die oxidative Dimerisierung des entstehenden Indoxylszu Indigo (Histochemie23, 266 [1970]) oder Kupplung mit Diazoniumsalzen zu Indoxyl-Azo-Farbstoffen (Histochemistry 57,323 [1978]).
Die vorgestellten Bestimmungsmethoden weisen erhebliche Nachteile auf: Zum einen sind sie zu unempfindlich. Darüber hinaus sind die in den histochemischen Nachweisen eingesetzten Substrate sehr schlecht löslich.
Wesentlich empfindlichere Teste entstehen, wenn als Substrate Galactoside eingesetzt werden, deren Aglykon fluorometrisch nachgewiesen werden kann. So ist in Proc. Nat. Acad. Sei. U. S. 47,1981 (1961) Fluorescein-di-ß-D-galactosid als Substrat beschrieben. Außerdem werden 2-Naphthyl-/3-D-galactosid (Analytical Biochem. 42,275 [1971]) oder 4-Methyl-umbelliferyi-ß-D-galactosid (Biochem. J. 102,525 [1967]) verwendet.
Der Nachteil derfluorometrischen IVlethoden besteht darin, daß hierein erheblicher apparativer Aufwand betrieben werden
Durch die Bereitstellung eines neuartigen diagnotischen in-vitro-Mittels kann das Enzym /3-D-Galactosidase auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise bestimmt werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues diagnostisches in-vitro-Mittel zu finden, welches die Bestimmung der Aktivität von /3-D-Galactosidasen ermöglicht.
Es wurde nun gefunden, daß ein diagnostisches in-vitro-Mittel, welches als chromogenes Enzymsubstrat ein Phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid enthält, hierfür besonders geeignet ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein diagnostisches in-vitro-Mittel, das neben einem oder mehreren Substraten der allgemeinen Formel I
CH2OH HO L O O, | r· | Rf R?J^ | β |
\L/ τ. | |||
OH | Rf | 2 | |
R4. | ^ SO3" | ||
RV | ^R' | ||
<RS | |||
Ύ | |||
Λ1 | |||
R1 |
(I)
in der
R1 bis R4, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Nitro- oder eine Aminogruppe R5 bis R12, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Niederalkyl-, eine Hydroxy-, eine Niederalkoxy-, eine Carboxyl-oder eine Nitrogruppe M+ ein Proton, ein Alkali-, ein Erdalkali- oder ein Ammoniumion
bedeuten,
ein geeignetes Puffersystem sowie gegebenenfalls weitere geeignete, üblicherweise für solche Reagenzien verwendete Zusatzstoffe, wie beispielsweise Netzmittel, Stabilisatoren usw. enthält.
Unter Halogen in der Definition von R1 bis R12 ist Fluor, Chlor, Brom und Jod, vorzugsweise Fluor, Chlor und Brom zu verstehen.
Die „Niederalkylgruppe" in der Definition von R5 bis R12 enthält 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatome, wobei die Methyluiid die Isopropylgruppe ganz besonders bevorzugt sind. Die „Niederalkoxygruppe" in der Definition von R5 bis R12 enthält 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatome, wobei die Methoxygruppe ganz besonders bevorzugt ist.
Unter „Alkalimetallion" in der Definition von M+ ist das Lithium-, Natrium- und Kaliumion zu verstehen, wobei das Lithium- und Natriumion bevorzugt sind.
Das „Erdalkaliion" in der Definition von M+ bedeutet Magnesium-, Calcium- und Bariumion, wobei das Calciumion bevorzugt
Unter „Ammoniumion" in der Definition von M+ ist [N R14 R15 R16 R17]+ zu verstehen, wobei
R14 bis R17, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, eine Niederalkylgruppe mit 1 bis 4, vorzugsweise mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen oder eine Benzylgruppe bedeuten.
-J-
Das diagnostische in-vitro-Mittel kann in Form einer Lösung, als Lyophilisat, als Pulvergemisch, Reagenztablette oder auf einem saugfähigen Träger aufgezogen, vorliegen.
Das erfindungsgemäße diagnostische Mittel in Form einer Lösung enthält vorzugsweise sämtliche für den Test benötigten Reagenzien. Als Lösungsmittel kommen Wasser oder Gemische von Wasser mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methanol, Ethanol, Aceton oder Dimethylformamid in Frage. Aus Haltbarkeitsgründen kann es vorteilhaft sein, die für den Test benötigten Reagenzien auf zwei oder mehr Lösungen zu verteilen, die erst bei der eigentlichen Untersuchung vermischt werden.
Zur Herstellung des diagnostischen Mittels in Form eines Lyophilisatsim Gesamtgewicht von jeweils etwa 5 bis 20 mg, vorzugsweise etwa 10mg, wird eine Lösung getrocknet, die neben sämtlichen für den Test benötigten Reagenzien übliche Gerüstbildner, wie z. B. Polyvinylpyrolidon und eventuell weitere Füllstoffe, wie z. B. Mannit, Sorbit oder Xylit enthält. Ein diagnostisches Mittel in Form von Pulvermischungen oder Reagenztabletten läßt sich herstellen, indem die Bestandteile des Testes mit üblichen galenischen Zusatzstoffen versetzt und granuliert werden. Zusatzstoffe dieser Art sind z.B. Kohlenhydrate, wie z. B. Mono-, Oligo- oder Polysaccharide, oder Zuckeralkohole, wie z. B. Mannit, Sorbit oder Xylit, oder andere lösliche inerte Verbindungen, wie Polyethylenglykole oder Polyvinylpyrrolidon. Die Pulvermischung oder Reagenztabletten weisen im allgemeinen ein Endgewicht von ungefähr 30 bis 200mg, vorzugsweise 50 bis 80mg, auf.
Zur Herstellung des diagnostischen Mittels in Form eines Teststreifens wird ein saugfähiger Träger, vorzugsweise Filterpapier, Cellulose oder Kunstfaservlies mit Lösungen der erforderlichen, üblicherweise zur Herstellung von Teststreifen verwendeten Reagentien in leichtflüchtigen Lösungsmitteln, wie z. B. Wasser, Methanol, Äthanol oder Aceton imprägniert. Dies kann in einem Imprägnierungsschritt erfolgen. Oft ist es jedoch zweckmäßig, die Imprägnierung in mehreren Schritten durchzuführen, wobei Lösungen eingesetzt werden, die jeweils einen Teil der Bestandteile des diagnostischen Mittels erhalten. So kann beispielsweise in einem ersten Schritt mit einer wäßrigen Lösung, die den Pufferund andere wasserlösliche Zusatzstoffe enthält, und dann in einem zweiten Schritt mit einer Lösung, die die /3-D-Galactosidase-Substrate enthält, imprägniert werden. Die fertigen Testpapiere können als solche verwendet werden oder in an sich bekannter Weise an Griffe angeklebt oder vorzugsweise zwischen Kunststoffen und feinmaschigen Netzwerken gemäß DBP 2118455 eingesiegelt werden.
Die Verwendung der Sulfonphthaleinyl-ß-D-galactoside der allgemeinen Formel I als Substrate für die /3-D-Galactosidase führt zu deutlich empfindlicheren /3-D-Galactosidase-Testsystemen, als sie bisher bekannt sind. Die neuen Substrate können zur in-vitro-Bestimmung der Aktivität von /3-D-Galactosidasen mit Vorteil sowohl im biochemischen als auch im klinisch-chemischen Bereich eingesetzt werden. Sie sind empfindlicher. Daraus ergeben sich mehrere Vorteile:
a) Es können geringere ß-D-Galactosidase-Aktivitäten gemessen werden.
b) Es können kleinere Probemengen eingesetzt werden.
c) Die Bestirpmung der ß-D-Galactosidase-Aktivität kann in erheblich kürzerer Zeit erfolgen.
d) Der geringe Probeneinsatz und die günstige Meßwellenlänge vermindern außerdem die Störanfälligkeit der Methode durch andere Probenbestandteile.
Es hat sich gezeigt, daß das beanspruchte diagnostische in-vitro-Mittel zur Bestimmung der Aktivität von /3-D-Galactosidasen jeglicher Herkunft, die sich durchaus in ihrem optimalen pH-Wert unterscheiden können, geeignet ist. Auch insolchen Fällen reagieren diagnostische in-vitro-Mittel mit Substraten der allgemeinen Formel I deutlich empfindlicher als die bisher bekannten Testmittel.
Geeignet sind die Sulfonphthaleinyl-ß-D-galactoside der Formel I auch für immunologische Bestimmungsmethoden, bei denen ß-D-Galactosidase als Indikator-Enzym verwendet wird, dessen Aktivität nach Durchführung der immunologischen Reaktion ermittelt werden muß. Solche immunologische Bestimmungsmethoden mit enzymatischer Indikatorreaktion sind dem Fachmann als Enzymimmunoassays bekannt. Diese Methoden dienen zur Bestimmung der Konzentration von Proteinen, Polysacchariden, Hormonen, Arzneistoffen und anderen nieder-molekularen Substanzen im Bereich von 10~5 bis 10~12mol/l. Je nach Erfordernis von Phasentrennschritten unterscheidet man zwischen homogener und heterogenerTestführung. Eine weitere Unterteilung kann in kompetitive und nicht-kompetitive Testprinzipien erfolgen.
Alle Testprinzipien arbeiten jedoch mit Enzym-Antigen- bzw. Enzym-Antikörper-Konjugaten. Die enzymatische Indikatorreaktion ist allen Enzymimmunoassays gemeinsam.
Ein für solche Zwecke geeignetes Indikatorenzym ist die /3-D-Galactosidase. Die Bestimmung der /3-D-Galactosidase in solchen Enzymimmunoassays erfolgt üblicherweise, in dem ein geeignetes/3-D-Galactosidase-Substrat zugesetzt wird, das enzymatisch gespalten und in üblicher Weise photometrisch vermessen wird.
Eine Verbesserung des /3-D-Galactosidase-Testsystems führt demnach ebenfalls zu erheblichen Vorteilen bei solchen Enzymimmunoassays:
1. Die höhere Empfindlichkeit ermöglicht auch hier eine weitere Erniedrigung der Nachweisgrenzen, kürzere Reaktionszeiten und geringeren Probeneinsatz und damit auch geringere Störungen durch andere Probenbestandteile.
2. Die günstigere Meßwellenlänge vermindert bei bestimmten Reaktionsführungen die Störanfälligkeit der Methode durch unlösliche Bestandteile, beispielsweise durch Trübungen.
Ausführungsbeispiel
Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinyl]-ethansulfonsäure
BSA Rinderserum-Albumin, (bovineserum-albumin)
Tween-20 Polyoxyethylen(20)sorbitanmonolaurat
Tricin [N-Tris(hydroxymethyl)]methyl-glycin
-4- Z47Z84
Beispiel 1 | 100mmol/l |
Bestimmung der Aktivität der /3-D-Galactosidase | 154mmol/l |
a) Zubereitung der verwendeten Lösungen: | 2mmol/l |
Pufferlösung: HEPES | IOq/I |
Natriumchlorid | 0,5 g/l |
Magnesium-L-Aspartat | 7,3 |
BSA | |
Tween-20 | (37 0C) |
pH-Wert (mit | |
Natronlauge | |
eingestellt) | |
In der vorstehend beschriebenen Pufferlösung werden 5mmol/l Phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid-natriumsalz gelöst.
Der pH-Wert wird mit Natronlauge auf pH 8,5 (37°C) eingestellt.
In dervorstehend beschriebenen Pufferlösung werden 5mmoi/l S^'-Di-fluor-phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosidnatriumsalz gelöst. Der pH-Wert wird mit Natronlauge auf pH 7,5 (37°C) eingestellt.
In dervorstehend beschriebenen Pufferlösung werden 5mmol/l S^'-Dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosidnatriumsalz gelöst. Der pH-Wert der Pufferlösung von 7,3 (370C) wird beibehalten.
In dervorstehend beschriebenen Pufferlösung werden 5 mmol/l 3,3',5,5'-Tetrachlorphenol-3",4",5",6"-tetrabromsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid-natriumsalz gelöst. Der pH-Wert der Pufferlösung von 7,3 (37°C) wird beibehalten.
Die Substratkonzentration und pH-Werte sind für jedes eingesetzte Substrat zu optimieren. Es können daher ganz bewußt unterschiedliche Werte für Substratkonzentrationen bzw. pH-Werte bei den einzelnen Reagenzlösungen auftreten.
Handelsübliche /3-D-Galactosidase aus Escherichia coli wird in der vorstehend genannten Pufferlösung gelöst. Die Aktivität dieser Lösung beträgt ca. 0,08 U/ml (bezogen auf die Hersteller-Angaben).
b) Durchführung der Messungen Die Messung erfolgt photometrisch bei der jeweils unten angegebenen Wellenlänge.
950μΙ Reagenz werdeii in einer 1-cm-Küvette bei 37°C mit 50μΙ Enzymlösung vermischt. Als Maß für die Reaktion wird der Extinktionsanstieg pro Zeiteinheit in [mExt/min] ermittelt. Er wird berechnet aus der gemessenen Extinktion durch Division mit der Reaktionszeit.
In der folgenden Tabelle sind die gefundenen Meßwerte aufgeführt:
Reagenz Nr. | Meßwellenlänge | Reaktion |
[nm] | [mExt/min] | |
1 | 560 | 9 |
2 | 578 | 71 |
3 | 578 | 123 |
4 | 578 | 121 |
Beispiel 2 | 50 mmol/l |
Bestimmung der Aktivität der /3-D-Galactosidase | 50 mmol/l |
a) Zubereitung der verwendeten Lösungen | 50 mmol/l |
Pufferlösung: HEPES | 154mmol/l |
Citronensäure | 1 mmol/l |
Tricin | 10 g/l |
Natriumchlorid | 6,9(370C) |
Magnesium-L-Aspartat | |
BSA | |
pH-Wert (mit Natron | |
lauge eingestellt) | |
Reagenzlösung 1:
In vorstehend beschriebener Pufferlösung werden 5mmol/l S^'-Di-methyl-phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid gelöst.
In vorstehend beschriebener Pufferlösung werden 5mmol/l 3,3'-Di-hydroxy-phenolsulfonphthaleinyl-/3-D-galactosid gelöst.
Handelsübliche /3-D-Galactosidase aus Escherichia coli wird in der vorstehend genannten Pufferlösung gelöst. Die Aktivität dieser Lösung beträgt ca. 0,08U/ml (bezogen auf die Hersteller-Angaben).
b) Durchführung der Messungen
950μΙ Reagenz werden in einer 1-cm-Küvette bei 37°C mit 50μΙ Enzymlösung vermischt. Nach 10 Minuten Reaktionszeit wird mit Natronlauge auf pH 10 eingestellt und die Extinktion gemessen. Mit einer Blindprobe mit Puffer anstelle von Enzymlösung wird in gleicher Weise verfahren. Die Temperatur wird während der Reaktion und der Messung auf 37°C gehalten. Aus den ermittelten Extinktionen der Ansätze mit und ohne Enzym wird die Extinktionsdifferenz errechnet. Durch Division dieser Extinktionsdifferenz durch die.Reaktionszeit ergibt sich als Maß für die Reaktion der Extinktionsanstieg pro Zeiteinheit in [mExt/min].
In derfolgenden Tabelle sind die gefundenen Meßwerte aufgeführt:
Reagenz Nr. Meßwellenlänge Reaktion
[nm] [mExt/min]
1 578 98
2 593 6
Verwendet werden handelsübliche ß-D-Galactosidase-Präparate unterschiedlicher Herkunft. Diese entfalten als charakteristisches Merkmal ihre max. Aktivität bei unterschiedlichen pH-Werten. Angaben der Hersteller:
aus Bohnen (Jack Beans) pH 3,5 | 50mmol/l |
ausAspergillusniger pH 4,0 | 50mmol/l |
ausEscherichiacoli pH 6,9 | 50mmol/l |
aus Rinderleber pH 7,3 | 154mmol/l |
ung der verwendeten Lösungen: | 1 mmol/l |
Pufferlösungen: HEPES | 10 g/l |
Citronensäure | |
Tricin - | |
Natriumchlorid | |
Magnesium-L-Aspartat | |
BSA | |
Es werden Lösungen obiger Zusammensetzung mit unterschiedlichen pH-Werten gemäß den pH-Optima der β-Ό-Galactosidasen hergestellt (pH3,5/4,0/6,9/7,3). Die Einstellung der pH-Werte erfolgt mit NaOH bzw. HCI bei 37°C.
In den vorstehend genannten Pufferlösungen mit den unterschiedlichen pH-Werten 3,5/4,0/6,9/7,3 werden jeweils 5 mmol/l S^'-Dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid-natriumsalz gelöst.
Die 0-D-Galactosidäsen werden in den Puffern mit den jeweils optimalen pH-Werten gelöst:
aus Bohnen (Jack Beans) inPufferpH3,5
ausAspergillusniger inPufferpH4,0
ausEscherichiacoli in Puffer pH 6,9
aus Rinderleber in Puffer pH 7,3
Die Aktivität dieser Lösungen beträgt ca. 0,08 U/ml (bezogen auf die Hersteller-Angaben).
b) Durchführung der Messungen:
Die Enzym reaktion erfolgt während einer definierten Reaktionszeit bei dem für das jeweilige Enzym optimalen pH-Wert. Es werden 1000μΙ Reagenz in einer 1-cm-Küvette bei 370C mit 30μ.Ι einer Enzymlösung versetzt. Nach 15 Minuten Reaktionszeit wird mit Natronlauge auf pH8,5 eingestellt und die Extinktion bei 578 nm ermittelt. Die Temperatur wird während der Reaktion und der Messung bei 37 0C konstant gehalten. In gleicherweise wird zu jeder Messung eine Blindprobe durchgeführt. Hierzu wird statt der Enzymlösung 30μΙ Pufferlösung eingesetzt.
c) Auswertung:
Zunächst wird die Differenz zwischen Meßwert und Enzym und Meßwert der Blindprobe gebildet. Durch Division dieser Differenz durch die Reaktionszeit wird als Maß für die Reaktion der. Extinktionsanstieg pro Zeiteinheit in [mExt/min] ermittelt. Meßwert (mit Enzym) — Meßwert (Blindprobe) = Δ-Meßwert
Δ-Meßwert „..._,., ·-= Reaktion [mExt/min]
Reaktionszeit Die gefundenen Meßwerte für die Reaktion der einzelnen Enzyme sind derfolgenden Zusammenstellung zu entnehmen:
Enzym aus pH-Wert Reaktionsgeschwindigkeit
[mExt/min]
Bohnen (Jack Beans) 3,5 71
Aspergillus Niger 4,0 112
Escherichiacoli 6,9 74
Rinderleber 7,3 32
Vorstehend beschriebene Versuchsergebnisse zeigen, daß die Sulfonphthaleinyl-ß-D-Galactoside als Substrate für /3-D-Galactosidasen jeder Herkunft geeignet sind.
a) Herstellung der verwendeten Lösungen
Pufferlösung: | HEPES | 100mmol/l |
Natriumchlorid | 154mmol/l | |
Magnesium-L-Aspartat | 2mmol/l | |
BSA | 10 g/l | |
Tween-20 | 0,5 g/l | |
pH-Wert (mit Natron | 7,3 | |
lauge eingestellt) | (370C) |
In vorstehend beschriebener Pufferlösung werden 5mmol/l S^'-Dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid-natriumsalz gelöst. Der pH-Wert der Pufferlösung mit 7,3 (37°C) wird beibehalten.
Handelsübliche 0-D-Galactosidase aus Escherichia coli wird in Puffer gelöst. Die Aktivität dieser Lösung beträgt ca. 0,08 U/ml (bezogen auf die Hersteller-Angaben).
Verwendet wird ein ß-D-Galactosidase-Antikörper-Präparat. Die Herstellung solcher Enzym-Antikörper-Konjugate ist bekannt.
Sie ist beispielsweise in Biochem. Biophys. Acta 612,40-49 (1980) beschrieben. Das Präparat wird in Puffer so verdünnt, daß sich eine mit der oben beschriebenen Enzymlösung ungefähr vergleichbare Aktivität ergibt.
b) Durchführung der Messung: .
Die Messung erfolgt photometrisch bei 578ηm. 950μΙ Reagenzlösung werden jeweils in einer 1-cm-Küvette bei 370C mit 50μ\ Enzymlösung bzw. mit 50μΙ Enzym-Konjugat-Lösung vermischt. Als Maß für die Reaktion wird der Extinktionsanstieg pro Zeiteinheit in [mExt/min] ermittelt.
Für die Reaktion mit der freien /3-D-Galactosidase werden 124mExt/min; für die Reaktion mitß-D-Galactosidase-Antikörper-Konjugat 120mExt/min gemessen.
Beide Meßwerte zeigen, daß sowohl mit freier als auch mit konjugierter /3-D-Galactosidase ein sehr gut meßbarer Extinktionsunterschied gefunden wird. Daraus ergibt sich, daß die Sulfonphthaleinyl-ß-D-galactoside als Substrate sowohl für freie /3-D-Galactosidase als auch für /3-D-Galactosidase-Konjugate in gleicher Weise geeignet sind. Die neuen Substrate können somit nicht nur als diagnostische Mittel für die Bestimmung freier/3-D-Galactosidasen eingesetzt werden. Sie sind in vorteilhafter Weise auch bei Enzymimmunoassays einsetzbar, bei denen /3-D-Galactosidase als Indikator-Enzym verwendet wird.
Claims (1)
- Erfindungsanspruch:1. Diagnostisches in-vitro-Mittel zum Nachweis der/3-D-Galactosidase, enthaltend ein oder mehrere chromogene Substrate, einegeeignetePuffersubstanzsowie gegebenenfalls weitere üblicherweise verwendete Hilfsstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß als chromogene Substrate
Phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactoside der allgemeinen Formel I ,,CHaOH
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