DD247284A5 - In Vitro diagnostic agent for the detection of beta-D-galactosidase - Google Patents
In Vitro diagnostic agent for the detection of beta-D-galactosidaseInfo
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Abstract
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung diagnostischer In-vitro-Mittel, mit denen b-D-Galactosidase auf einfache, schnelle und zuverlaessige Weise bestimmt werden kann. Die erfindungsgemaessen diagnostischen Mittel enthalten als chromogene Substrate Phenolsulfonphthaleinyl-b-D-galactoside der allgemeinen Formel I, in der beispielsweise bedeuten: R1 bis R4, die gleich oder verschieden sein koennen, jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Nitro- oder eine Aminogruppe R5 bis R12, die gleich oder verschieden sein koennen, jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Niederalkyl-, eine Hydroxy-, eine Niederalkoxy-, eine Carboxyl- oder eine Nitrogruppe M ein Proton, ein Alkali-, ein Erdalkali- oder ein Ammoniumion. Formel (I)The aim of the invention is to provide diagnostic in vitro means by which b-D-galactosidase can be determined in a simple, rapid and reliable manner. The diagnostic agents according to the invention contain, as chromogenic substrates, phenolsulphonphthaleinyl-bD-galactosides of the general formula I in which, for example: R1 to R4, which may be identical or different, are each hydrogen, halogen, a nitro or an amino group R5 to R12, which may be the same or different, each hydrogen, halogen, a lower alkyl, a hydroxy, a lower alkoxy, a carboxyl or a nitro group M is a proton, an alkali, an alkaline earth or an ammonium ion. Formula (I)
Description
in derin the
R1 bis R4, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, Halogen, ein Nitro-oder eine Aminogruppe R5bis R12, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Niederalkyl-, eine Hydroxy-, eine Niederalkoxy-, eine Carboxyl- oder eine NitrogruppeR 1 to R 4 , which may be identical or different, each represents hydrogen, halogen, a nitro or an amino group R 5 to R 12 , which may be identical or different, in each case hydrogen, halogen, a lower alkyl, a hydroxy, a lower alkoxy, a carboxyl or a nitro group
M+ ein Proton, ein Alkali-, ein Erdalkali-oder ein Ammoniumion bedeuten, eingesetzt werden.M + represents a proton, an alkali, an alkaline earth or an ammonium ion.
2. Diagnostisches in-vitro-Mittel gemäß Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß als zusätzliche Hilfsmittel Netzmittel, Oxidationsmittel, galenische Zusatzstoffe oder/und Gerüstbildner verwendet werden.2. In vitro diagnostic agent according to item!, Characterized in that wetting agents, oxidizing agents, galenic additives and / or scaffold builders are used as additional aids.
Die Erfindung betrifft ein diagnostisches in-vitro-Mittel zum Nachweis des Enzyms /3-D-Galactosidase.The invention relates to an in vitro diagnostic agent for detecting the enzyme / 3-D-galactosidase.
Oligo- oder Polysaccharide, die D-Galactose mit /3-glycosidischer Bindung enthalten, kommen in fast allen Organismen vor.Oligo- or polysaccharides containing D-galactose with / 3-glycosidic linkage are found in almost all organisms.
Demgemäß sind auch die entsprechenden /3-D-Galactosidasen (EC 3.2.1.23) weit verbreitet und können in zahlreichen Mikroorganismen, Tieren und Pflanzen nachgewiesen werden.Accordingly, the corresponding / 3-D-galactosidases (EC 3.2.1.23) are also widespread and can be detected in numerous microorganisms, animals and plants.
Eine vielfache physiologische Funktion erfüllt die /3-D-Galactosidase im Säugetierbereich: Sie spielt eine gewichtige Rolle im Kohlenhydratstoffwechsel, da durch sie die Hydrolyse der Lactose erfolgt. Darüber hinaus stellt die /3-D-Galactosidase das Schlüsselenzym beim Abbau von Glycolipiden, Mucopolysacchariden und Glycoproteinen dar.A multiple physiological function fulfills the / 3-D-galactosidase in the mammalian area: It plays an important role in the carbohydrate metabolism, since it causes the hydrolysis of lactose. In addition, / 3-D-galactosidase is the key enzyme in the degradation of glycolipids, mucopolysaccharides and glycoproteins.
Über ihren physiologischen Stellenwert hinaus hat die /3-D-Galactosidase in den letzten Jahren im diagnostischen Bereich an Bedeutung gewonnen. So wird beispielsweise dieses Enzym in zunehmendem Maße als Indikator-Enzym für Enzymimmunoassays eingesetzt (siehe beispielsweise Annals of Clinical Biochemistry 16,221-224 [1979]).In addition to its physiological significance, / 3-D-galactosidase has gained in importance in recent years in the diagnostic field. For example, this enzyme is increasingly being used as an indicator enzyme for enzyme immunoassays (see, for example, Annals of Clinical Biochemistry 16,221-224 [1979]).
Die Bestimmung der Aktivität der ß-D-Galactosidase spielt demnach sowohl in der klinischen Chemie als auch in der Diagnostik eine zunehmende Rolle. Hierzu wird ganz allgemein die galactosidasehaltige Probe mit einem geeigneten /3-D-Galactosidase-Su bstrat versetzt. Das Substrat wird von dem Enzym gespalten. Eines der Spaltprodukte wird in geeigneter Weise nachgewiesen.The determination of the activity of β-D-galactosidase thus plays an increasing role in both clinical chemistry and in diagnostics. For this purpose, the galactosidasehaltige sample is generally mixed with a suitable / 3-D-galactosidase Su bstrat. The substrate is cleaved by the enzyme. One of the cleavage products is suitably detected.
Es kann entweder das durch Einwirkung des Enzyms freigesetzte Glycon oder das Aglycon gemessen werden. In der Regel wird letzteres bestimmt. Als Substrat eignen sich das natürliche Substrat Lactose sowie insbesondere ein chromogenes Galactosid.Either the glycine released by the action of the enzyme or the aglycone can be measured. As a rule, the latter is determined. Suitable substrates are the natural substrate lactose and in particular a chromogenic galactoside.
So sind in Biochem. Z. 333,209 (1960) Phenyl-/3-D-Galactosid sowie einige weitere am aromatischen Ring substituierte DerivateSo are in Biochem. Z. 333,209 (1960) phenyl / 3-D-galactoside as well as some other aromatic ring-substituted derivatives
(z. B. o-Nitrophenyl- und p-Nitrophenyl-ß-D-galactosid) als Substrate der /3-D-Galactosidase beschrieben. Die durch Hydrolyse freigesetzten Phenole werden photometrisch im UV-Bereich bzw. bei den Nitrophenolen im kurzwelligen sichtbaren Wellenlängenbereich bestimmt. Auch kann als Indikatorreaktion eine oxidative Kupplung mit Aminoantipyrin angeschlossen werden (Analytical Biochem. 40,281 [1971]).(eg, o-nitrophenyl and p-nitrophenyl-.beta.-D-galactoside) as substrates of / 3-D-galactosidase. The phenols liberated by hydrolysis are determined photometrically in the UV range or in the case of the nitrophenols in the short-wave visible wavelength range. Also, an oxidative coupling with aminoantipyrine can be connected as an indicator reaction (Analytical Biochem., 40, 281 [1971]).
Für histochemische Untersuchungen werden zum einen Naphthyl-/3-D-Galactoside verwendet: So z.B. die 1-Naphthyl-Verbindung in Histochemie 35,199 (1973), das 6-Brom-2-naphthyl-Derivat in J. Biol. Chem. 195,239 (1952) oder das Naphthol-AS-BI-/3-D-galactosid (Histochemie 37,89 [1973]). Zur Visualisierung werden dabei die entsprechenden Naphthole mit verschiedenen Diazoniumsalzen zu Azo-Farbstoffen umgesetzt.For histochemical studies, on the one hand, naphthyl / 3-D-galactosides are used: e.g. the 1-naphthyl compound in histochemistry 35, 99 (1973), the 6-bromo-2-naphthyl derivative in J. Biol. Chem. 195, 239 (1952), or the naphthol AS-BI / 3-D galactoside (histochemistry 37.89 [1973]). For visualization, the corresponding naphthols are reacted with various diazonium salts to form azo dyes.
-I--I-
Ferner ist S-Brom^-chlor-indoxyl-ß-D-galactosid als Substrat der /3-Galactosidase bekannt. Indikator-Reaktion ist hier die oxidative Dimerisierung des entstehenden Indoxylszu Indigo (Histochemie23, 266 [1970]) oder Kupplung mit Diazoniumsalzen zu Indoxyl-Azo-Farbstoffen (Histochemistry 57,323 [1978]).Further, S-bromo ^ -chloro-indoxyl-.beta.-D-galactoside is known as a substrate of / 3-galactosidase. Indicator reaction here is the oxidative dimerization of the resulting indoxyl to indigo (Histochemie23, 266 [1970]) or coupling with diazonium salts to indoxyl azo dyes (Histochemistry 57, 323 [1978]).
Die vorgestellten Bestimmungsmethoden weisen erhebliche Nachteile auf: Zum einen sind sie zu unempfindlich. Darüber hinaus sind die in den histochemischen Nachweisen eingesetzten Substrate sehr schlecht löslich.The methods of determination presented have considerable disadvantages: on the one hand, they are too insensitive. In addition, the substrates used in the histochemical detection are very poorly soluble.
Wesentlich empfindlichere Teste entstehen, wenn als Substrate Galactoside eingesetzt werden, deren Aglykon fluorometrisch nachgewiesen werden kann. So ist in Proc. Nat. Acad. Sei. U. S. 47,1981 (1961) Fluorescein-di-ß-D-galactosid als Substrat beschrieben. Außerdem werden 2-Naphthyl-/3-D-galactosid (Analytical Biochem. 42,275 [1971]) oder 4-Methyl-umbelliferyi-ß-D-galactosid (Biochem. J. 102,525 [1967]) verwendet.Significantly more sensitive tests arise when the substrates used are galactosides whose aglycone can be detected fluorometrically. So in Proc. Nat. Acad. Be. U.S. Pat. No. 47,1981 (1961) discloses fluorescein-di-.beta.-D-galactoside as a substrate. In addition, 2-naphthyl / 3-D-galactoside (Analytical Biochem 42,275 [1971]) or 4-methyl-umbelliferyi-β-D-galactoside (Biochem J. 102,525 [1967]) are used.
Der Nachteil derfluorometrischen IVlethoden besteht darin, daß hierein erheblicher apparativer Aufwand betrieben werdenThe disadvantage of the fluorometric IVlethoden is that hierein a considerable amount of equipment is operated
Durch die Bereitstellung eines neuartigen diagnotischen in-vitro-Mittels kann das Enzym /3-D-Galactosidase auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise bestimmt werden.By providing a novel in vitro diagnostic agent, the enzyme / 3-D-galactosidase can be determined in a simple, rapid and reliable manner.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues diagnostisches in-vitro-Mittel zu finden, welches die Bestimmung der Aktivität von /3-D-Galactosidasen ermöglicht.The invention has for its object to find a new diagnostic in vitro agent, which allows the determination of the activity of / 3-D-galactosidases.
Es wurde nun gefunden, daß ein diagnostisches in-vitro-Mittel, welches als chromogenes Enzymsubstrat ein Phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid enthält, hierfür besonders geeignet ist.It has now been found that an in vitro diagnostic agent which contains a phenolsulfonephthaleinyl-β-D-galactoside as a chromogenic enzyme substrate is particularly suitable therefor.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein diagnostisches in-vitro-Mittel, das neben einem oder mehreren Substraten der allgemeinen Formel IThe present invention accordingly provides an in vitro diagnostic agent which, in addition to one or more substrates of the general formula I
(I)(I)
in derin the
R1 bis R4, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Nitro- oder eine Aminogruppe R5 bis R12, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Niederalkyl-, eine Hydroxy-, eine Niederalkoxy-, eine Carboxyl-oder eine Nitrogruppe M+ ein Proton, ein Alkali-, ein Erdalkali- oder ein AmmoniumionR 1 to R 4 , which may be identical or different, each represent hydrogen, halogen, a nitro or an amino group R 5 to R 12 , which may be identical or different, in each case hydrogen, halogen, a lower alkyl, a hydroxy, a lower alkoxy, a carboxyl or a nitro group M + a proton, an alkali, an alkaline earth or an ammonium ion
bedeuten,mean,
ein geeignetes Puffersystem sowie gegebenenfalls weitere geeignete, üblicherweise für solche Reagenzien verwendete Zusatzstoffe, wie beispielsweise Netzmittel, Stabilisatoren usw. enthält.a suitable buffer system and optionally further suitable, commonly used for such reagents additives, such as wetting agents, stabilizers, etc. contains.
Unter Halogen in der Definition von R1 bis R12 ist Fluor, Chlor, Brom und Jod, vorzugsweise Fluor, Chlor und Brom zu verstehen.By halogen in the definition of R 1 to R 12 is meant fluorine, chlorine, bromine and iodine, preferably fluorine, chlorine and bromine.
Die „Niederalkylgruppe" in der Definition von R5 bis R12 enthält 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatome, wobei die Methyluiid die Isopropylgruppe ganz besonders bevorzugt sind. Die „Niederalkoxygruppe" in der Definition von R5 bis R12 enthält 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 Kohlenstoffatome, wobei die Methoxygruppe ganz besonders bevorzugt ist.The "lower alkyl group" in the definition of R 5 to R 12 contains 1 to 5, preferably 1 to 3, carbon atoms, with the methylidene and the isopropyl group being particularly preferred The "lower alkoxy group" in the definition of R 5 to R 12 contains 1 to 5, preferably 1 to 3 carbon atoms, wherein the methoxy group is very particularly preferred.
Unter „Alkalimetallion" in der Definition von M+ ist das Lithium-, Natrium- und Kaliumion zu verstehen, wobei das Lithium- und Natriumion bevorzugt sind.By "alkali metal ion" in the definition of M + is meant the lithium, sodium and potassium ion, with the lithium and sodium ions being preferred.
Das „Erdalkaliion" in der Definition von M+ bedeutet Magnesium-, Calcium- und Bariumion, wobei das Calciumion bevorzugtThe "alkaline earth ion" in the definition of M + means magnesium, calcium and barium ions, with calcium ion being preferred
Unter „Ammoniumion" in der Definition von M+ ist [N R14 R15 R16 R17]+ zu verstehen, wobeiBy "ammonium ion" in the definition of M + is meant [NR 14 R 15 R 16 R 17 ] + , where
R14 bis R17, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, eine Niederalkylgruppe mit 1 bis 4, vorzugsweise mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen oder eine Benzylgruppe bedeuten.R 14 to R 17 , which may be the same or different, each represents hydrogen, a lower alkyl group having 1 to 4, preferably having 1 or 2 carbon atoms or a benzyl group.
-J--J-
Das diagnostische in-vitro-Mittel kann in Form einer Lösung, als Lyophilisat, als Pulvergemisch, Reagenztablette oder auf einem saugfähigen Träger aufgezogen, vorliegen.The in vitro diagnostic agent may be in the form of a solution, lyophilisate, powder mix, reagent tablet, or coated on an absorbent carrier.
Das erfindungsgemäße diagnostische Mittel in Form einer Lösung enthält vorzugsweise sämtliche für den Test benötigten Reagenzien. Als Lösungsmittel kommen Wasser oder Gemische von Wasser mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methanol, Ethanol, Aceton oder Dimethylformamid in Frage. Aus Haltbarkeitsgründen kann es vorteilhaft sein, die für den Test benötigten Reagenzien auf zwei oder mehr Lösungen zu verteilen, die erst bei der eigentlichen Untersuchung vermischt werden.The diagnostic agent in the form of a solution according to the invention preferably contains all the reagents required for the test. As the solvent, water or mixtures of water with a water-soluble organic solvent such. As methanol, ethanol, acetone or dimethylformamide in question. For reasons of durability, it may be advantageous to distribute the reagents required for the test to two or more solutions that are mixed only during the actual examination.
Zur Herstellung des diagnostischen Mittels in Form eines Lyophilisatsim Gesamtgewicht von jeweils etwa 5 bis 20 mg, vorzugsweise etwa 10mg, wird eine Lösung getrocknet, die neben sämtlichen für den Test benötigten Reagenzien übliche Gerüstbildner, wie z. B. Polyvinylpyrolidon und eventuell weitere Füllstoffe, wie z. B. Mannit, Sorbit oder Xylit enthält. Ein diagnostisches Mittel in Form von Pulvermischungen oder Reagenztabletten läßt sich herstellen, indem die Bestandteile des Testes mit üblichen galenischen Zusatzstoffen versetzt und granuliert werden. Zusatzstoffe dieser Art sind z.B. Kohlenhydrate, wie z. B. Mono-, Oligo- oder Polysaccharide, oder Zuckeralkohole, wie z. B. Mannit, Sorbit oder Xylit, oder andere lösliche inerte Verbindungen, wie Polyethylenglykole oder Polyvinylpyrrolidon. Die Pulvermischung oder Reagenztabletten weisen im allgemeinen ein Endgewicht von ungefähr 30 bis 200mg, vorzugsweise 50 bis 80mg, auf.For the preparation of the diagnostic agent in the form of a lyophilizate in the total weight of about 5 to 20 mg, preferably about 10mg, a solution is dried, which in addition to all the reagents required for the test usual scaffolding, such as. As polyvinylpyrrolidone and possibly further fillers, such as. As mannitol, sorbitol or xylitol contains. A diagnostic agent in the form of powder mixtures or reagent tablets can be prepared by adding and granulating the ingredients of the test with conventional galenic additives. Additives of this kind are e.g. Carbohydrates, such as. As mono-, oligo- or polysaccharides, or sugar alcohols, such as. Mannitol, sorbitol or xylitol, or other soluble inert compounds such as polyethylene glycols or polyvinylpyrrolidone. The powder mixture or reagent tablets generally have a final weight of about 30 to 200 mg, preferably 50 to 80 mg.
Zur Herstellung des diagnostischen Mittels in Form eines Teststreifens wird ein saugfähiger Träger, vorzugsweise Filterpapier, Cellulose oder Kunstfaservlies mit Lösungen der erforderlichen, üblicherweise zur Herstellung von Teststreifen verwendeten Reagentien in leichtflüchtigen Lösungsmitteln, wie z. B. Wasser, Methanol, Äthanol oder Aceton imprägniert. Dies kann in einem Imprägnierungsschritt erfolgen. Oft ist es jedoch zweckmäßig, die Imprägnierung in mehreren Schritten durchzuführen, wobei Lösungen eingesetzt werden, die jeweils einen Teil der Bestandteile des diagnostischen Mittels erhalten. So kann beispielsweise in einem ersten Schritt mit einer wäßrigen Lösung, die den Pufferund andere wasserlösliche Zusatzstoffe enthält, und dann in einem zweiten Schritt mit einer Lösung, die die /3-D-Galactosidase-Substrate enthält, imprägniert werden. Die fertigen Testpapiere können als solche verwendet werden oder in an sich bekannter Weise an Griffe angeklebt oder vorzugsweise zwischen Kunststoffen und feinmaschigen Netzwerken gemäß DBP 2118455 eingesiegelt werden.For the preparation of the diagnostic agent in the form of a test strip is an absorbent carrier, preferably filter paper, cellulose or synthetic fiber fleece with solutions of the necessary reagents commonly used for the production of test strips in volatile solvents such. As water, methanol, ethanol or acetone impregnated. This can be done in an impregnation step. Often, however, it is expedient to carry out the impregnation in several steps, using solutions which each receive a part of the components of the diagnostic agent. For example, in a first step, it may be impregnated with an aqueous solution containing the buffer and other water-soluble additives and then in a second step with a solution containing the / 3-D-galactosidase substrates. The finished test papers can be used as such or adhered to handles in a manner known per se or preferably sealed between plastics and fine-mesh networks in accordance with DBP 2118455.
Die Verwendung der Sulfonphthaleinyl-ß-D-galactoside der allgemeinen Formel I als Substrate für die /3-D-Galactosidase führt zu deutlich empfindlicheren /3-D-Galactosidase-Testsystemen, als sie bisher bekannt sind. Die neuen Substrate können zur in-vitro-Bestimmung der Aktivität von /3-D-Galactosidasen mit Vorteil sowohl im biochemischen als auch im klinisch-chemischen Bereich eingesetzt werden. Sie sind empfindlicher. Daraus ergeben sich mehrere Vorteile:The use of the sulfonphthaleinyl-β-D-galactosides of the general formula I as substrates for / 3-D-galactosidase leads to significantly more sensitive / 3-D-galactosidase test systems than hitherto known. The new substrates can advantageously be used for in vitro determination of the activity of / 3-D-galactosidases in both the biochemical and the clinical-chemical fields. They are more sensitive. This results in several advantages:
a) Es können geringere ß-D-Galactosidase-Aktivitäten gemessen werden.a) Lower β-D-galactosidase activities can be measured.
b) Es können kleinere Probemengen eingesetzt werden.b) Smaller sample quantities can be used.
c) Die Bestirpmung der ß-D-Galactosidase-Aktivität kann in erheblich kürzerer Zeit erfolgen.c) The Bestirpmung the ß-D-galactosidase activity can be done in a much shorter time.
d) Der geringe Probeneinsatz und die günstige Meßwellenlänge vermindern außerdem die Störanfälligkeit der Methode durch andere Probenbestandteile.d) The low sample use and the favorable measuring wavelength also reduce the susceptibility of the method by other sample components.
Es hat sich gezeigt, daß das beanspruchte diagnostische in-vitro-Mittel zur Bestimmung der Aktivität von /3-D-Galactosidasen jeglicher Herkunft, die sich durchaus in ihrem optimalen pH-Wert unterscheiden können, geeignet ist. Auch insolchen Fällen reagieren diagnostische in-vitro-Mittel mit Substraten der allgemeinen Formel I deutlich empfindlicher als die bisher bekannten Testmittel.It has been found that the claimed in vitro diagnostic instrument is useful for determining the activity of / 3-D-galactosidases of any origin, which may well differ in their optimal pH. Even in such cases, diagnostic in vitro agents react with substrates of the general formula I much more sensitive than the previously known test agents.
Geeignet sind die Sulfonphthaleinyl-ß-D-galactoside der Formel I auch für immunologische Bestimmungsmethoden, bei denen ß-D-Galactosidase als Indikator-Enzym verwendet wird, dessen Aktivität nach Durchführung der immunologischen Reaktion ermittelt werden muß. Solche immunologische Bestimmungsmethoden mit enzymatischer Indikatorreaktion sind dem Fachmann als Enzymimmunoassays bekannt. Diese Methoden dienen zur Bestimmung der Konzentration von Proteinen, Polysacchariden, Hormonen, Arzneistoffen und anderen nieder-molekularen Substanzen im Bereich von 10~5 bis 10~12mol/l. Je nach Erfordernis von Phasentrennschritten unterscheidet man zwischen homogener und heterogenerTestführung. Eine weitere Unterteilung kann in kompetitive und nicht-kompetitive Testprinzipien erfolgen.The sulfonphthaleinyl-β-D-galactosides of the formula I are also suitable for immunological determination methods in which β-D-galactosidase is used as an indicator enzyme whose activity must be determined after the immunological reaction has been carried out. Such immunological detection methods with enzymatic indicator reaction are known in the art as enzyme immunoassays. These methods are used to determine the concentration of proteins, polysaccharides, hormones, drugs and other low-molecular substances in the range of 10 ~ 5 to 10 ~ 12 mol / l. Depending on the requirement of phase separation steps, a distinction is made between homogeneous and heterogeneous test procedure. Further subdivision can be done in competitive and non-competitive test principles.
Alle Testprinzipien arbeiten jedoch mit Enzym-Antigen- bzw. Enzym-Antikörper-Konjugaten. Die enzymatische Indikatorreaktion ist allen Enzymimmunoassays gemeinsam.All test principles, however, work with enzyme-antigen or enzyme-antibody conjugates. The enzymatic indicator reaction is common to all enzyme immunoassays.
Ein für solche Zwecke geeignetes Indikatorenzym ist die /3-D-Galactosidase. Die Bestimmung der /3-D-Galactosidase in solchen Enzymimmunoassays erfolgt üblicherweise, in dem ein geeignetes/3-D-Galactosidase-Substrat zugesetzt wird, das enzymatisch gespalten und in üblicher Weise photometrisch vermessen wird.An indicator enzyme useful for such purposes is / 3-D-galactosidase. The determination of / 3-D-galactosidase in such enzyme immunoassays usually takes place in which a suitable / 3-D-galactosidase substrate is added, which is enzymatically cleaved and measured photometrically in a conventional manner.
Eine Verbesserung des /3-D-Galactosidase-Testsystems führt demnach ebenfalls zu erheblichen Vorteilen bei solchen Enzymimmunoassays:An improvement of the / 3-D-galactosidase test system thus also leads to considerable advantages in such enzyme immunoassays:
1. Die höhere Empfindlichkeit ermöglicht auch hier eine weitere Erniedrigung der Nachweisgrenzen, kürzere Reaktionszeiten und geringeren Probeneinsatz und damit auch geringere Störungen durch andere Probenbestandteile.1. The higher sensitivity also allows a further reduction of the detection limits, shorter reaction times and lower sample use and thus also lower interference by other sample components.
2. Die günstigere Meßwellenlänge vermindert bei bestimmten Reaktionsführungen die Störanfälligkeit der Methode durch unlösliche Bestandteile, beispielsweise durch Trübungen.2. The more favorable measuring wavelength reduces the susceptibility of the method by insoluble constituents, for example by turbidity in certain reactions.
Ausführungsbeispielembodiment
Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet:The following abbreviations are used:
HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinyl]-ethansulfonsäureHEPES 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid
BSA Rinderserum-Albumin, (bovineserum-albumin)BSA bovine serum albumin, (bovineserum albumin)
Tween-20 Polyoxyethylen(20)sorbitanmonolauratTween-20 polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate
Tricin [N-Tris(hydroxymethyl)]methyl-glycinTricine [N-tris (hydroxymethyl)] methyl-glycine
-4- Z47Z84-4- Z47Z84
In der vorstehend beschriebenen Pufferlösung werden 5mmol/l Phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid-natriumsalz gelöst.In the buffer solution described above, 5 mmol / L of phenolsulfonephthaleinyl-β-D-galactoside sodium salt is dissolved.
Der pH-Wert wird mit Natronlauge auf pH 8,5 (37°C) eingestellt.The pH is adjusted to pH 8.5 (37 ° C) with sodium hydroxide solution.
In dervorstehend beschriebenen Pufferlösung werden 5mmoi/l S^'-Di-fluor-phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosidnatriumsalz gelöst. Der pH-Wert wird mit Natronlauge auf pH 7,5 (37°C) eingestellt.In the buffer solution described above, 5 mmol / l of S ^ '- di-fluorophenolsulfonphthaleinyl-β-D-galactoside sodium salt is dissolved. The pH is adjusted to pH 7.5 (37 ° C) with sodium hydroxide solution.
In dervorstehend beschriebenen Pufferlösung werden 5mmol/l S^'-Dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosidnatriumsalz gelöst. Der pH-Wert der Pufferlösung von 7,3 (370C) wird beibehalten.In the above-described buffer solution, 5 mmol / l of S'-dichlorophenolsulfonphthaleinyl-β-D-galactoside sodium salt is dissolved. The pH of the buffer solution of 7.3 (37 0 C) is maintained.
In dervorstehend beschriebenen Pufferlösung werden 5 mmol/l 3,3',5,5'-Tetrachlorphenol-3",4",5",6"-tetrabromsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid-natriumsalz gelöst. Der pH-Wert der Pufferlösung von 7,3 (37°C) wird beibehalten.In the buffer solution described above, 5 mmol / l of 3,3 ', 5,5'-tetrachlorophenol-3 ", 4", 5 ", 6" -tetrabromosulfonphthaleinyl-β-D-galactoside sodium salt are dissolved. The pH of the buffer solution of 7.3 (37 ° C) is maintained.
Die Substratkonzentration und pH-Werte sind für jedes eingesetzte Substrat zu optimieren. Es können daher ganz bewußt unterschiedliche Werte für Substratkonzentrationen bzw. pH-Werte bei den einzelnen Reagenzlösungen auftreten.The substrate concentration and pH values are to be optimized for each substrate used. It is therefore quite possible for different values for substrate concentrations or pH values to occur in the individual reagent solutions.
Handelsübliche /3-D-Galactosidase aus Escherichia coli wird in der vorstehend genannten Pufferlösung gelöst. Die Aktivität dieser Lösung beträgt ca. 0,08 U/ml (bezogen auf die Hersteller-Angaben).Commercially available / 3-D-galactosidase from Escherichia coli is dissolved in the above-mentioned buffer solution. The activity of this solution is about 0.08 U / ml (based on the manufacturer's instructions).
b) Durchführung der Messungen Die Messung erfolgt photometrisch bei der jeweils unten angegebenen Wellenlänge.b) Carrying out the measurements The measurement is carried out photometrically at the wavelength specified below.
950μΙ Reagenz werdeii in einer 1-cm-Küvette bei 37°C mit 50μΙ Enzymlösung vermischt. Als Maß für die Reaktion wird der Extinktionsanstieg pro Zeiteinheit in [mExt/min] ermittelt. Er wird berechnet aus der gemessenen Extinktion durch Division mit der Reaktionszeit.950μΙ reagent should be mixed with 50μΙ enzyme solution in a 1 cm cuvette at 37 ° C. As a measure of the reaction, the increase in extinction per unit time in [mExt / min] is determined. It is calculated from the measured absorbance by division with the reaction time.
In der folgenden Tabelle sind die gefundenen Meßwerte aufgeführt:The following table lists the measured values found:
Reagenzlösung 1:Reagent solution 1:
In vorstehend beschriebener Pufferlösung werden 5mmol/l S^'-Di-methyl-phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid gelöst.In the buffer solution described above, 5 mmol / l of S ^ '- di-methyl-phenolsulfonphthaleinyl-β-D-galactoside are dissolved.
In vorstehend beschriebener Pufferlösung werden 5mmol/l 3,3'-Di-hydroxy-phenolsulfonphthaleinyl-/3-D-galactosid gelöst.In the above-described buffer solution, 5 mmol / l of 3,3'-di-hydroxy-phenolsulfonphthaleinyl / 3-D-galactoside is dissolved.
Handelsübliche /3-D-Galactosidase aus Escherichia coli wird in der vorstehend genannten Pufferlösung gelöst. Die Aktivität dieser Lösung beträgt ca. 0,08U/ml (bezogen auf die Hersteller-Angaben).Commercially available / 3-D-galactosidase from Escherichia coli is dissolved in the above-mentioned buffer solution. The activity of this solution is about 0.08U / ml (based on the manufacturer's instructions).
b) Durchführung der Messungenb) carrying out the measurements
950μΙ Reagenz werden in einer 1-cm-Küvette bei 37°C mit 50μΙ Enzymlösung vermischt. Nach 10 Minuten Reaktionszeit wird mit Natronlauge auf pH 10 eingestellt und die Extinktion gemessen. Mit einer Blindprobe mit Puffer anstelle von Enzymlösung wird in gleicher Weise verfahren. Die Temperatur wird während der Reaktion und der Messung auf 37°C gehalten. Aus den ermittelten Extinktionen der Ansätze mit und ohne Enzym wird die Extinktionsdifferenz errechnet. Durch Division dieser Extinktionsdifferenz durch die.Reaktionszeit ergibt sich als Maß für die Reaktion der Extinktionsanstieg pro Zeiteinheit in [mExt/min].950μΙ reagent are mixed in a 1 cm cuvette at 37 ° C with 50μΙ enzyme solution. After a reaction time of 10 minutes, the pH is adjusted to 10 with sodium hydroxide solution and the extinction is measured. A blank test with buffer instead of enzyme solution is used in the same way. The temperature is maintained at 37 ° C during the reaction and measurement. The extinction difference is calculated from the extinctions of the mixtures with and without enzyme. By dividing this absorbance difference by the reaction time, the extinction increase per unit time in [mExt / min] is obtained as a measure of the reaction.
In derfolgenden Tabelle sind die gefundenen Meßwerte aufgeführt:The following table shows the measured values found:
Reagenz Nr. Meßwellenlänge ReaktionReagent No. Meas. Wavelength Reaction
[nm] [mExt/min][nm] [mext / min]
1 578 981 578 98
2 593 62 593 6
Verwendet werden handelsübliche ß-D-Galactosidase-Präparate unterschiedlicher Herkunft. Diese entfalten als charakteristisches Merkmal ihre max. Aktivität bei unterschiedlichen pH-Werten. Angaben der Hersteller:Commercially available β-D-galactosidase preparations of different origin are used. These unfold as a characteristic feature their max. Activity at different pH values. Information from the manufacturer:
Es werden Lösungen obiger Zusammensetzung mit unterschiedlichen pH-Werten gemäß den pH-Optima der β-Ό-Galactosidasen hergestellt (pH3,5/4,0/6,9/7,3). Die Einstellung der pH-Werte erfolgt mit NaOH bzw. HCI bei 37°C.Solutions of the above composition with different pH values are prepared according to the pH optima of the β- galactosidases (pH 3.5 / 4.0 / 6.9 / 7.3). The pH values are adjusted with NaOH or HCl at 37.degree.
In den vorstehend genannten Pufferlösungen mit den unterschiedlichen pH-Werten 3,5/4,0/6,9/7,3 werden jeweils 5 mmol/l S^'-Dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid-natriumsalz gelöst.In the abovementioned buffer solutions having the different pH values of 3.5 / 4.0 / 6.9 / 7.3, 5 mmol / l S''-dichlorophenolsulfonphthaleinyl-β-D-galactoside sodium salt are dissolved in each case.
Die 0-D-Galactosidäsen werden in den Puffern mit den jeweils optimalen pH-Werten gelöst:The 0-D-galactosidases are dissolved in the buffers with the optimal pH-values:
aus Bohnen (Jack Beans) inPufferpH3,5from beans (Jack Beans) in buffer pH3.5
ausAspergillusniger inPufferpH4,0from Aspergillus niger in buffer pH4.0
ausEscherichiacoli in Puffer pH 6,9from Escherichia coli in buffer pH 6.9
aus Rinderleber in Puffer pH 7,3from bovine liver in buffer pH 7.3
Die Aktivität dieser Lösungen beträgt ca. 0,08 U/ml (bezogen auf die Hersteller-Angaben).The activity of these solutions is about 0.08 U / ml (based on the manufacturer's instructions).
b) Durchführung der Messungen:b) carrying out the measurements:
Die Enzym reaktion erfolgt während einer definierten Reaktionszeit bei dem für das jeweilige Enzym optimalen pH-Wert. Es werden 1000μΙ Reagenz in einer 1-cm-Küvette bei 370C mit 30μ.Ι einer Enzymlösung versetzt. Nach 15 Minuten Reaktionszeit wird mit Natronlauge auf pH8,5 eingestellt und die Extinktion bei 578 nm ermittelt. Die Temperatur wird während der Reaktion und der Messung bei 37 0C konstant gehalten. In gleicherweise wird zu jeder Messung eine Blindprobe durchgeführt. Hierzu wird statt der Enzymlösung 30μΙ Pufferlösung eingesetzt.The enzyme reaction takes place during a defined reaction time at the optimum pH for the particular enzyme. There are displaced 1000μΙ reagent in a 1 cm cuvette at 37 0 C with 30μ.Ι an enzyme solution. After a reaction time of 15 minutes, the pH is adjusted to 8.5 with sodium hydroxide solution and the extinction is determined at 578 nm. The temperature is kept constant during the reaction and the measurement at 37 0 C. In the same way, a blank is performed for each measurement. For this purpose, instead of the enzyme solution 30μΙ buffer solution is used.
c) Auswertung:c) Evaluation:
Zunächst wird die Differenz zwischen Meßwert und Enzym und Meßwert der Blindprobe gebildet. Durch Division dieser Differenz durch die Reaktionszeit wird als Maß für die Reaktion der. Extinktionsanstieg pro Zeiteinheit in [mExt/min] ermittelt. Meßwert (mit Enzym) — Meßwert (Blindprobe) = Δ-MeßwertFirst, the difference between measured value and enzyme and measured value of the blank is formed. By dividing this difference by the reaction time is used as a measure of the reaction of. Extinction increase per unit of time determined in [mExt / min]. Measured value (with enzyme) - measured value (blank) = Δ measured value
Δ-Meßwert „..._,., ·-= Reaktion [mExt/min]Δ-measured value "..._,., · - = reaction [mExt / min]
Reaktionszeit Die gefundenen Meßwerte für die Reaktion der einzelnen Enzyme sind derfolgenden Zusammenstellung zu entnehmen:Reaction time The measured values found for the reaction of the individual enzymes are shown in the following list:
Enzym aus pH-Wert ReaktionsgeschwindigkeitEnzyme from pH reaction rate
[mExt/min][MExt / min]
Bohnen (Jack Beans) 3,5 71Beans (Jack Beans) 3,5 71
Aspergillus Niger 4,0 112Aspergillus Niger 4.0 112
Escherichiacoli 6,9 74Escherichia coli 6.9 74
Rinderleber 7,3 32Beef liver 7.3 32
Vorstehend beschriebene Versuchsergebnisse zeigen, daß die Sulfonphthaleinyl-ß-D-Galactoside als Substrate für /3-D-Galactosidasen jeder Herkunft geeignet sind.The experimental results described above show that the sulfonphthaleinyl-β-D-galactosides are suitable as substrates for / 3-D-galactosidases of any origin.
a) Herstellung der verwendeten Lösungena) Preparation of the solutions used
In vorstehend beschriebener Pufferlösung werden 5mmol/l S^'-Dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactosid-natriumsalz gelöst. Der pH-Wert der Pufferlösung mit 7,3 (37°C) wird beibehalten.In the above-described buffer solution, 5 mmol / l of S'-dichlorophenolsulfonphthaleinyl-β-D-galactoside sodium salt is dissolved. The pH of the buffer solution at 7.3 (37 ° C) is maintained.
Handelsübliche 0-D-Galactosidase aus Escherichia coli wird in Puffer gelöst. Die Aktivität dieser Lösung beträgt ca. 0,08 U/ml (bezogen auf die Hersteller-Angaben).Commercially available Escherichia coli 0-D-galactosidase is dissolved in buffer. The activity of this solution is about 0.08 U / ml (based on the manufacturer's instructions).
Verwendet wird ein ß-D-Galactosidase-Antikörper-Präparat. Die Herstellung solcher Enzym-Antikörper-Konjugate ist bekannt.A beta-D-galactosidase antibody preparation is used. The preparation of such enzyme-antibody conjugates is known.
Sie ist beispielsweise in Biochem. Biophys. Acta 612,40-49 (1980) beschrieben. Das Präparat wird in Puffer so verdünnt, daß sich eine mit der oben beschriebenen Enzymlösung ungefähr vergleichbare Aktivität ergibt.She is in Biochem, for example. Biophys. Acta 612, 40-49 (1980). The preparation is diluted in buffer to give an approximately comparable activity to the enzyme solution described above.
b) Durchführung der Messung: .b) Performance of the measurement:.
Die Messung erfolgt photometrisch bei 578ηm. 950μΙ Reagenzlösung werden jeweils in einer 1-cm-Küvette bei 370C mit 50μ\ Enzymlösung bzw. mit 50μΙ Enzym-Konjugat-Lösung vermischt. Als Maß für die Reaktion wird der Extinktionsanstieg pro Zeiteinheit in [mExt/min] ermittelt.The measurement is carried out photometrically at 578 μm. 950μΙ reagent solution are each mixed in a 1 cm cuvette at 37 0 C with 50 μ \ enzyme solution or with 50μΙ enzyme-conjugate solution. As a measure of the reaction, the increase in extinction per unit time in [mExt / min] is determined.
Für die Reaktion mit der freien /3-D-Galactosidase werden 124mExt/min; für die Reaktion mitß-D-Galactosidase-Antikörper-Konjugat 120mExt/min gemessen.For the reaction with the free / 3-D-galactosidase 124mExt / min; measured for the reaction with β-D-galactosidase antibody conjugate 120mExt / min.
Beide Meßwerte zeigen, daß sowohl mit freier als auch mit konjugierter /3-D-Galactosidase ein sehr gut meßbarer Extinktionsunterschied gefunden wird. Daraus ergibt sich, daß die Sulfonphthaleinyl-ß-D-galactoside als Substrate sowohl für freie /3-D-Galactosidase als auch für /3-D-Galactosidase-Konjugate in gleicher Weise geeignet sind. Die neuen Substrate können somit nicht nur als diagnostische Mittel für die Bestimmung freier/3-D-Galactosidasen eingesetzt werden. Sie sind in vorteilhafter Weise auch bei Enzymimmunoassays einsetzbar, bei denen /3-D-Galactosidase als Indikator-Enzym verwendet wird.Both measurements show that a very well-measurable extinction difference is found with both free and conjugated / 3-D-galactosidase. As a result, the sulfonphthaleinyl-β-D-galactosides are equally suitable as substrates for both free / 3-D-galactosidase and / 3-D-galactosidase conjugates. The new substrates can thus not only be used as diagnostic agents for the determination of free / 3-D-galactosidases. They are also advantageously used in enzyme immunoassays in which / 3-D-galactosidase is used as an indicator enzyme.
Claims (1)
Phenolsulfonphthaleinyl-ß-D-galactoside der allgemeinen Formel I ,,An in vitro diagnostic agent for detecting / 3-D-galactosidase containing one or more chromogenic substrates, a suitable buffer substance and optionally other commonly used excipients, characterized in that as chromogenic substrates
Phenolsulfonphthaleinyl-β-D-galactosides of general formula I
Family
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