DK167365B1 - Fremgangsmaade til fremstilling af maltoheptaosederivat - Google Patents

Description

i DK 167365 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde af den i patentkravet omhandlede art.

Bestemmelsen af or-amylasespejlet i serum er en vigtig klinisk parameter for bugspytkirtlens funktion. De i handelen værende 5 reagenser til bestemmelse af α-amylase er overvejende baseret på et system, ved hvilket stivelse nedbrydes af a-amylasen, og de dannede brudstykker bestemmes i det synlige område eller i UV-området, alt efter om man anvender farvet stivelse eller nativ stivelse som amylasesubstrat ved prøven. En væsentlig 10 ulempe ved denne fremgangsmåde eller dette reagens beror på, at stivelsen som makromolekyle kun kan karakteriseres og standardiseres utilstrækkeligt, således at omsætningsgraden af de enkelte partier falder meget forskelligt ud, og at der ved målingerne altid må medføres en standard. For at opnå bedre 15 resultater ville et mere ensartet substrat, som giver pålidelige resultater ved spaltningen, være nødvendigt.

Et skridt fremad i retning af et mere ensartet substrat gav anvendelsen af maltopentaose. Dette spaltes af a-arnylasen til en maltotriose og maltose, og maltotriose og maltose omdannes 20 af α-glucosidase til glucose, som så kan bestemmes efter ønskede metoder, f.eks. med den kendte hexokinasemetode.

Foruden maltopentaose er også maltotetraose og maltohexaose foreslået som substrat (amerikanske patenter nr. 3.879.263 og 4.000.042). Herved blev dog med tetraosen opnået tydeligt 25 dårligere resultater end med pentaosen, og med hexaosen endnu dårligere resultater end med tetraosen. Således angives for maltotetraose og -pentaose endnu en støkiometrisk reaktion, medens der for hexaosen blev konstateret lige netop tolerer-bare afvigelser fra den støkiometriske reaktion.

30 En ulempe ved maltopentaosen, der også forekommer ved tetraosen, er imidlertid, at der optræder en betydelig reagenstom-værdi, dvs. at målereaktionen forløber allerede før den prøve, som skal bestemmes, tilsættes. Hertil kommer, at også denne DK 167365 B1 2 reagens tomværdi ikke er konstant ved højere substratkoncentrationer, men forandrer sig i mere end 25 minutter, før der fås konstans af denne sidereaktion. Det har også vist sig, at den antagne forskellige spaltning af maltopentaosen med pankreas-5 cv-amylase og spyt-α-amylase, som havde muliggjort en adskillelse, faktisk ikke er til stede (J. BC, 1970, 245 3917 til 3927 J. Biochem. 51 p.XVIII 1952).

Det er derfor den foreliggende opfindelses opgave at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse, 10 der er velegnet som substrat til bestemmelse af a-amylase, som har en bedre renhed og ensartethed end de kendte substrater, er let tilgængeligt og med hensyn til tomværdi uden serum, varighed af LAG-fasen (dvs. den tid, der går før der optræder en lineær kinetik) og opnåelig maksimal aktivitet tilfreds-15 stiller kravene.

Ifølge opfindelsen løses denne opgave ved en fremgangsmåde til fremstilling af et maltoheptaosederivat med den almene formel I

CH2°h CH2OH

—o—i OH OH 5

HO

hvor R er en phenylglucosid-, mononitrophenylglucosid- eller 20 dinitrophenylglucosid-gruppe, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Phenyl grupperne kan stå i a- eller /3-stilling.

Hos dinitrophenylglucosidgruppeme kan de to nitrogrupper være DK 167365 B1 3 i vilkårlige stillinger, f.eks. som 2,4-, 2,6- eller 3,5-sub-stituenter.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af phenyl-derivater sker ved transglucosidering af phenylglucosidet 5 eller det tilsvarende nitrerede phenylglucosid med a-cyklodex-trin, amylose eller opløseligt stivelse i nærværelse af en specifik mikrobiel transferase. Hertil anvendes en transferase af Bacillus macerans, nemlig Bacillus macerans-amylase, f.eks. Bacillus macerans (E.C. 2.4.1.19. DSM 24; isolering: J. A. de 10 Pinto L.L. Campbell, Biochemistry 7, (1968) 114,- transfer reaktion: Methods in Carbohydr. Chemistry, bind II, 347), som ved siden af sin hydrolytiske og cykliserende virkning vitterlig også har en glucosyltransfererende virkning.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er analog med den fremgangs-15 måde, der er beskrevet i J. Amer. Chem. Soc. 76, 2387 ff (1954) , som beskriver omsætning af a-cyklodextrin med et phenylglucosid i nærværelse af Bacillus macerans-amylase. Ved denne kendte fremgangsmåde sker der en hurtig homologisering af det primære G7-produkt, hvilket fører til en blanding af 20 flere meget ensartede og dermed vanskeligt adskillelige oligo-merer. Det har overraskende vist sig, at en sådan homologisering ikke finder sted ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Med fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås således den ønskede forbindelse i en renhed på ca. 94 vægt%, mens der ved den 25 kendte metode kun opnås en renhed på 17 vægt% af den ønskede forbindelse.

Overraskende har det også vist sig, at de ifølge opfindelsen fremstillede maltoheptaosederivater har overlegne egenskaber som substrat for a-amylasen, selv om der hos de til dette 30 formål allerede foreslåede oligomaltoser kunne konstateres et væsentligt fald i egnethed fra maltopentaose til maltohexaose, da der med den opnås væsentligt dårligere resultater end med pentaosen. Man skulle derfor have ventet, at med en yderligere forlængelse af maltose-oligosaccharidkæden ville der optræde DK 167365 B1 4 fejl, som ikke mere kunne tolereres. Overraskende opnås imidlertid bedre resultater end med pentaosen. Således er reagens-tomværdien ved 0,02 ml prøve med maltopentaose som substrat 73%, med maltoheptaose derimod kun 13% beregnet på slutværdien 5 af bestemmelsen i normalområdet.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er således særligt velegnede til anvendelse ved den i DK fremlæggelsesskrift nr. 153.335 beskrevne fremgangsmåde til bestemmelse af oi-amylase.

10 De ifølge opfindelsen fremstillede substrater er med opfindelsen gjort let tilgængelige i høj renhed. De egner sig til bestemmelse af a-amylase i biologiske væsker, såsom serum, hepa-rinplasma, urin og lignende eller i andre flydende eller fast materialer.

15 Det følgende eksempel belyser opfindelsen.

Eksempel p-nitrophenyl-of-maltooligosaccharid ved enzymatisk syntese med Bacillus macerans-amylase (E.C.2.4.1.19 af Bac. mac. DSM 24).

Bacillus macerans-amylase har foruden hydrolytisk og cyklise-20 rende virkning også glucosyl-transfererende egenskaber, som kan udnyttes til syntese af oligosaccharider og -derivater (Methods in Carbohydrate Chemistry II, 347) . Til syntese af para-nitrophenyl-oligosaccharider blev denne fremgangsmåde optimeret som følger: 25 680 mg Bacillus macerans-amylase (E.C.2.4.1.19 af Bac. mac.

DSM 24) (lyofilisat) (0,46 U/mg afvejning, proteinindhold af afvejningen 28,5%, fri for p-nitrophenyl-a-D-glucosidspaltende aktivitet).

400 mg a-D-nitrophenylglucosid 30 3,5 g α-cyklodextrin, og

Claims (1)

10 Fremgangsmåde til fremstilling af maltoheptaosederivat med den almene formel I CH20H CH20H .—1 OH OH 5 HO hvor R er en phenylglucosid-, mononitrophenylglucosid- eller dinitrophenylglucosid-gruppe, kendetegnet ved, at det pågældende phenylglucosid eller nitreret phenylglucosid 15 omsættes med o!-cyklodextrin, amylose eller opløselig stivelse i nærværelse af Bacillus macerans-amylase, der er fri for p-nitrophenyl-a-D-glucosidspaltende aktivitet.