DK155751B - Fremgangsmaade og forsoegsudstyr til bestemmelse af amylaseindholdet af en proeve - Google Patents
Fremgangsmaade og forsoegsudstyr til bestemmelse af amylaseindholdet af en proeve Download PDFInfo
- Publication number
- DK155751B DK155751B DK315777A DK315777A DK155751B DK 155751 B DK155751 B DK 155751B DK 315777 A DK315777 A DK 315777A DK 315777 A DK315777 A DK 315777A DK 155751 B DK155751 B DK 155751B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- substrate
- solution
- sample
- maltase
- test equipment
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/10—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases p-Nitrophenol derivatives
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
DK 155751 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af amylaseindholdet af en prøve under anvendelse af et oligosaccharidsubstrat samt et reagensforsøgsudstyr til brug ved denne fremgangsmåde.
5 a-Amylase er et enzym, som hydrolyserer a[l-»4]-bin dingerne mellem glycoseenhederne i stivelse og de lavere polymere og oligomere af glycose. Enzymet dannes i menneskets krop, først og fremmest i bugspytkirtlen og i spytkirtlerne, og dets koncentration i forskellige legemsvæsker er et nyt-10 tigt diagnoseredskab for læger. F.eks. er serum a-amylase-niveauet relativt konstant hos sunde mennesker, men det stiger som svar på patologiske betingelser, f.eks. akut pancreatitis.
USA-patentskrift nr. 3.879,263 udstedt den 22. april 15 1975 og USA-patentskrift nr. 4.000.042 udstedt den 8. decem ber 1976 beskriver en fremgangsmåde og et reagensforsøgsudstyr til anvendelse ved bestemmelsen af a-amylaseindholdet af en prøve under anvendelse af de nærmere angivne oligosac-charider, maltotetraose, maltopentaose eller maltohexaose 20 som amylasesubstrat. Omsætningen mellem a-amylase og disse substrater, fortrinsvis i nærværelse af en maltase, giver en bestemt mængde glucose, som kan måles ved hjælp af ethvert glucosedetectionsystem. Det yderligere glucosedetektionstrin er en ulempe. Hvis glucosen er til stede i prøven, skal den 25 desuden fjernes, eller der skal kompenseres herfor. Skønt dette kan ske ved konventionel teknik, er det et ekstra trin i processen, hvilket er en ulempe.
A.P. Jansen og P.G.A.B. Wydeveld, Nature, bind 182, side 525 (1958) angiver, at a-(p-nitrophenyl)-maltotriosid 30 kan være et substrat for en amylaseanalyse. Dette litteratursted viser imidlertid, at forfatterne aldrig har identificeret det aktive middel, der har været genstand for deres observationer. De angiver: (1) Inkubation af urin- eller spytprøver fra mennesker med a-(p-nitrophenyl)maltotriosid 35 ved 37°C i 16 timer giver 4-nitrophenol, spektrophotometrisk identificeret ved at blande hydrolysatet med 0,02N natrium- 2
DK 155751B
hydroxid. (2) Hydrolysen forhindres af proteinudfældende midler, f.eks. 10% trichloreddikesyre og 0,5N sølvnitrat.
(3) Hydrolysen er pH-afhængig, idet den er mest effektiv ved en pH-værdi på 5,9 til 7,0. De angiver, at dette var et 5 tegn på "den mulige eksistens af en uidentificeret carbo-hydrase".
I den nævnte reference anføres altså, at maltotriose er et forbedret substrat i forhold til amylose og amylopec-tin, som er naturlige substrater for amylase, idet den væ-10 sentligste fordel er det nævnte substrats ensartethed. Selv om der i referencen beskrives anvendelse af a-(4-nitrophe-nyl)-maltotriosid som potentielt egnet substrat til bestemmelse af a-amylaseaktivitet, er mange spørgsmål efterladt ubesvarede. For eksempel anføres i to referencer nævnt af 15 Jansen et al., at hydrolysen af maltotriose til glucose og maltose er meget langsom, medens der i to yderligere referencer anføres, at maltotriose slet ikke nedbrydes af spyt--amylase. Grunden til, at Jansen et al. valgte det chromo-phore maltotriosid, var i det væsentlige dels, at selv en 20 svag nedbrydning ville være påviselig, og dels, at en let nedbrydning af det nævnte substrat ikke ville bevirke væsentlig akkumulering af maltose, som er en amylase-inhibitor.
Der sker imidlertid kun en spektralt målelig hydrolyse i løbet af 16 timer ved 37°c under de beskrevne reaktionsbe-25 tingelser. Selv om denne spektrale ændring var specifik for amylaseaktivitet, vil bestemmelsen være for tidskrævende til at have nogen praktisk værdi i kliniske laboratorier, og, hvad der er endnu værre, muligheden for ikke-specifik hydrolyse pga. carbohydrase-kontaminering af prøverne kan 3 0 ikke udelukkes.
Det er formålet med opfindelsen at overvinde disse begrænsninger og tilvejebringe en hurtig bestemmelse af amylase på en støkiometrisk måde.
Det nævnte formål opfyldes ifølge opfindelsen med en 35 fremgangsmåde af den i indledningen nævnte art, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man
. DK 155751 B
3 (a) til en opløsning indeholdende en afmålt mængde af prøven sætter et oligosaccharidsubstrat, hvori mindst 90% af oligo-saccharidet har en bestemt kædelængde og har formlen 5 p “
CH20H CH20H CH20H
A H/~v 10 k OH A__0 _K OH /1__o —λ OH. /
ho\| [/ \|_j/ \|__Y OR
OH OH OH
J n 15 hvori n er et helt tal mellem 2 og 8, og R er en substitueret aromatisk gruppe, der som fraskilt aglycon udviser en spek-20 tral absorption forskellig fra substratet, (b) sætter en maltase til opløsningen, og (c) bestemmer opløsningens spektrale absorption.
I en foretrukken udførelsesform er n 2, 3 eller 4, og R er en substitueret aromatisk gruppe valgt fra gruppen 25 bestående af Λ VyM r^V^- 30 X —- — Y, t and
Y Y
35 4
DK 155751B
hvori X og Y hver især er valgt blandt H, N02/ halogen, alkyl med 1-4 carbonatomer, OR' og C02R', hvori R' er alkyl med 1-6 carbonatomer, og mindst den ene af grupperne X og Y er N02.
5 I de foretrukne udførelsesformer er substraterne glycosider af maltotetraose, maltopentaose eller maltohexa-ose, hvori slutglycosidenheden har en aromatisk gruppe knyttet dertil. I den mest foretrukne udførelsesform er slutgly-cosidenheden et a-(4-nitrophenyl)glycosid.
10 Opfindelsen angår også et reagensforsøgsudstyr til brug ved den omhandlede fremgangsmåde. Dette forsøgsudstyr er ejendommeligt ved, at det omfatter særskilte portioner af (a) et bestemt oligosaccharidsubstrat som ovenfor defineret 15 og (b) en maltase.
De anvendte substrater er oligomere af glucose, som er α [l-*4 ] -bundet, og som har en substitueret aromatisk gruppe knyttet til den endestillede (reducerende) glucoseenhed.
20 De har som nævnt formlen ch2oh ch2oh ch2oh J~\h h/ \h hJ~°\h 25 Koh yi-o Jf(oH X^o—KoH )
Ho\| V Y / \| / OR
OH OH OH
_ Jn 30
Heri er R en substitueret aromatisk gruppe, og den resterende del af forbindelsen er en glycosylrest. Fraspaltet fra gly-cosylresten ved hydrolyse bliver gruppen R en phenol, ROH, 35 eller en anion af phenolen, RO-' (afhængigt af betingelserne i opløsningen) og begge normalt betegnes en aglycon.
5
DK 155751B
Denne forbindelse, som fungerer som et substrat for amylase, betegnes et "bestemt" oligosaccharid.
α-Amylase optræder som katalysator ved hydrolysen af polysaccharider til kortkædede polysaccharider og eventuelt 5 til maltose. Det har vist sig, og er angivet i de ovenfor nævnte patenter, at blandt alle polysaccharider foretrækkes maltotetraose (G4), maltopentaose (G5) og maltohexaose (Gg) til anvendelse som et substrat i en amylaseanalyse. Gn-no-menklaturen er en hensigtsmæssig forkortelse for η a[l-»4] 10 bundne glucoseenheder.
Disse tre substrater foretrækkes af kinetiske og støkiometriske grunde. Bindingskonstansen af α-amylase til polysaccharider stiger, når antallet af α[l-»4]-bindinger stiger, indtil ca. Gg, hvor den ud jævnes. For homologe lavere 15 end G4 er bindingskonstansen for lille til at give rimelige reaktionshastigheder. For homologe højere end Gg, skønt reaktionen går hurtigt frem, er resultaterne ikke støkiometriske. Uproduktive reaktioner sker således, at n glucoseenheder ikke dannes, når α-amylase reagerer med Gn. Desuden 20 nedsættes den maksimale hastighed af substratfrigørelsen af α-amylase med aftagende n. Hvor påvisningssystemet medfører glucose, og Gn anvendes som substrat, skulle der inden for et rimeligt tidsrum produceres n glucoseenheder for hver reaktion af α-amylase med Gn· Ellers skal procentdelen af 25 de totale glucoseenheder, der er fraspaltet, sammenlignet med de i alt tilgængelige glucoseenheder, anslås, og dette medfører fejl. Disse faktorer gør G4, G5 og Gg til foretrukne substrater.
I det foreliggende system, hvor påvisningssystemet 30 afhænger af frigørelsen af en substitueret phenol ROH og ikke glucosedannelse, er støkiometriske overvejelser ikke helt så kritiske, n kan derfor være 2-8.
Anvendelsen af en maltase forøger reaktionshastigheden. Det er især fordelagtigt at opnå en virkelig støkiome-35 trisk reaktion, fordi reaktionshastigheden af maltase med lave oligosaccharider er større end reaktionshastigheden af 6
DK 155751B
α-amylase med disse substrater. a-Amylase hydrolyserer substratet i lavere fraktioner, og maltasen fuldstændiggør hydrolysen til glucoseenheder, således at frigivelsen af den substituerede phenol sker støkiometrisk. Derfor er oligo-5 saccharider med den ovenfor angivne formel, hvori n = 2,3 eller 4 de mest foretrukne substrater for den her omhandlede opfindelse. Den følgende diskussion er derfor begrænset til disse substrater, især de substrater, hvor n er 2 eller 3.
Når der anvendes en maltase, f.eks. α-glucosidase, 10 opstår der en sidereaktion, som forårsager en blindhastighed på grund af maltasens reaktivitet med substratet. Dette betyder, at endog i fraværelse af α-amylase vil der forekomme frigørelse af phenolen. Da den maksimale hastighed for produktfrigørelsen med maltase nedsættes med stigende n, er 15 udviklingen af en blindhastighed langsommere, når n stiger.
Man kunne derfor forvente, at blindhastigheden for G5 ville være mindre end hastigheden for G4. Dette bekræftes ved eksperimenter. En yderligere faktor er imidlertid involveret i valget mellem højere og lavere oligosaccharider (dvs. G4 20 eller G5) som substratet. I alle reaktioner af substratet med amylase og reaktioner af maltase med substratet stiger hastigheden som en funktion af substratkoncentrationen til et optimalt punkt, ved hvilket den aftager. Substratkoncentrationen, ved hvilken det optimale punkt fremkommer, 25 viser sig at stige med stigende n, således at der skal anvendes mere substrat (og maltase) for at opnå det optimale (lineære) punkt for standardkurven. I tilfælde af kostbare kemikalier er dette en vigtig overvejelse.
Substraterne, som anvendes ifølge den foreliggende 30 opfindelse, er bestemte oligosaccharider med den ovenfor angivne formel, hvori n er et helt tal mellem 2 og 8, og R er en substitueret aromatisk gruppe, som fraspaltet fra polysaccharidet i form af en phenol eller en phenolatanion, udviser en spektralabsorption forskellig fra substratet.
35 Der findes et stort antal af sådanne grupper. De vigtigste
DK 155751 B
7 blandt dem er imidlertid de grupper, der er valgt fra gruppen bestående af X —- —- Y, J , og S/
Y Y
10 hvori X og Y hver især er valgt fra gruppen bestående af H, N02, halogen, alkyl med 1-4 carbonatomer, OR' eller C02R', 15 hvori R' er alkyl med 1-6 carbonatomer, og mindst en af grupperne X og Y er N02. Anionerne af phenolerne, der dan-nels, når disse grupper fraspaltes fra glycosylresten, har en maksimal absorption Xmax mellem ca. 290 og ca. 600 nm.
Detaljer for fremgangsmåderne til fremstilling af 20 disse foretrukne forbindelser angives i USA-patentskrift nr. 4.145.527 (udstedt den 20. marts 1979) og 4.147.860 (udstedt den 3. april 1979).
Blandt de foretrukne udførelsesformer foretrækkes især to forbindelser, de forbindelser, hvori n er 2 eller 25 3, og R er 4-nitrophenyl. Disse forbindelser, a-(4-nitrophe- nyl)maltotetraosid (G4pNp) og a-(4-nitrophenyl)maltopen-taosid (G5pNp), anvendes til bestemmelse af amylaseindholdet af en prøve, f.eks. blodserum eller urin, ifølge de følgende reaktionsskemaer 30 35
DK 155751B
8
ch2oh - CH20H CH20H
OH OH OH
L -in λ max 290—305 nm R = 4-0 NC Η. n = 2 a-(4-nitrophenyl)maltotetraosid 2 6 4 n = 3 a-(4-nitrophenvl)maltopentaosid a-amylase S r ch2oh ch2oh ch2oh G2ellerG3+ -°Χ|" /*- ,/j
* OH [ 1 OH Jn OH
R = 4~02NCgH4 n = 0 a-(4-nitrophenyl)maltosid ot-maltase 4 eller 5 G^ + HO—^ N02 4-nitrophenol OH" ”0—^—N02 4-nitrophenolatanion Λ max 410 nm
DK 155751 B
9
Det bestemte oligosaccharidsubstrat sættes til en opløsning indeholdende en afmålt mængde af den prøve, der skal undersøges, og spektralabsorptionen af opløsningen undersøges, enten som en slutpunktbestemmelse eller en ha-5 stighedsbestemmelse under anvendelse af konventionel teknik. Sædvanligvis holdes reaktionsopløsningen, som i alle enzymreaktioner, ved en i det væsentlige konstant pH-værdi og en i det væsentlige konstant temperatur. Når disse stoffer anvendes, er det ønskeligt at gennemføre analysen i en opløs-10 ning, hvis pH-værdi er indstillet til det basiske område for at forhøje absorptionen ved 410 nm. G4pNp og G5pNp (Amax 290 ti! 305 nm) og 4-nitrophenol (Xmax 313 nm) har f.eks. en lav ekstinktionskoefficient ved 410 nm sammenlignet med 4-nitrophenolatanion (Xmax 410 nm).
15 For bedst at gennemføre dette, anvendes et reagens forsøgsudstyr indeholdende det bestemte substrat angivet ovenfor og en maltase. Et forsøgsudstyr, der kan tjene som eksempel, er angivet i USA-patentskrift nr. 3.476.515. Dette forsøgsudstyr kan anvendes i den i USA-patentskrift nr.
20 3.770.382 beskrevne analysator.
Eksempel 1
En prøve af a-(4-nitrophenyl)-maltotetraosid (G4pNp), fremstillet i overensstemmelse med eksempel IH i USA-patent-25 skrift nr. 4.145.527, opløses i 66,7 mM natriumphosphatpuf-fer, pH-værdi 6,5, til tilvejebringelse af forskellige substratkoncentrationer i området fra 2 til 8 mg/3 ml. Som beskrevet i USA-patentskriftet er denne substratprøve blevet renset under anvendelse af Sephadex ® LH-20 Chromatografi-30 søjle. α-Glucosidase af forskellige koncentrationer i området fra 2,5 til 12,5 International Units pr. 3 ml opløsning (IU/3 ml) sættes til substratopløsningen, og opløsningens volumen bringes op til 3,0 ml. Opløsningen inkuberes ved 37°C i 1-10 minutter.
35 Efter at blindhastigheden er målt ved 410 nm under anvendelse af et Gilford spektrophotometer, sættes reaktionen 10
DK 155751B
i gang under tilsætning af 0,1 il af et Elevated Enzym Control Product, som sælges af E.I. du Pont de Nemours and Company (1150 Somogyi Units per dl (SU/dl) amylase) fortyndet 1:1 med Du Pont Enzyme fortyndingsmiddel. Dette niveau af 5 amylase er ca. 6 gange af det normale største serumniveau.
Den totale reaktionshastighed måles derpå under anvendelse af et Gilford spektrophotometer og ved at substrahere blindhastigheden fra den totale hastighed, opnår man nettoreak-tionshastigheden.
10 En to-variabel statisk optimering for substratet og α-glucosidasen gennemføres. Resultaterne af denne vurdering er angivet i tabel I i arbitrære absorptionsenheder (A) pr. minut.
15 Tabel I
_ 0,0051 0,012 0,018 S 12,5 0,0912 0,113 0,110 20 £· 0,0863 0,101 0,092
H
g 0,004 0,008 0,011 •8 7,5 0,090 0,110 · 0,109 •Η § 0,086 0,102 0,098 25 g
H
f 0,001 0,008 0,002 ° 2,5 0,079 0,091 0,080 0,078 0,083 0,078 30 2,0 5,0 8,0 G^pNp mg/3 ml 1. Blindhastighed (A/min) 35 2. Total hastighed (A/min) 3. Netto hastighed (A/min)
DK 155751 B
11
Fra denne vurdering ses det, at blindhastigheden stiger, når koncentrationerne af både G4pNp og a-glucosidase stiger, at den optimale koncentration af G4pNp er ca.
4,0 mg/3 ml, og at den optimale koncentration af a-glucosi-5 dase er ca. 7,5 IU/3 ml.
Ved anvendelse af disse optimale værdier for G4pNp og α-glucosidase i en reaktionsopløsning på 3 ml måles reaktionshastighederne for forskellige amylaseprøvekoncentra-tioner, og en standardkurve fremstilles. Fra denne kurve 10 måles sensitiviteten i mA/min/SU/dl. Standardkurven for denne prøve angives i fig. l. Blindhastigheden og sensitiviteten gives for denne og andre prøver i tabel II.
Tabel II
15 Eksempel Blindhastiqhed Sensitivitet (mA/min) (mA/Min/SU/dl) 1 5,0 0,115 2 ikke målt 0,231 3 10,3-13,3 0,110 20 4 3,0 0,116
Eksempel 2
En lille mængde af substratprøven anvendt i eksempel 1 renses yderligere ved High Performance Liquid Chromato-25 graphy (HPLC) som er en standardrenseteknik, velkendt af eksperter. Ved at anvende de optimale værdier for G4pNp og α-glucosidase opnået i eksempel 1 og amylaseprøven i eksempel 1 fremstilles en standardkurve under anvendelse af dette rensede substrat. Sensitiviteten opnås også som beskrevet i 30 eksempel 1. Standardkurven angives i figur 1, sensitiviteten angives i tabel II. Som det fremgår af tabel II, stiger sensitiviteten af prøven bemærkelsesværdigt ved rensning, hvilket viser, at substratprøven i eksempel 1 indeholder nogen inhibitor.
35 12
DK 155751B
Eksempel 3 a-(4-nitrophenyl)maltotetraosid (G4pNp)-prøven anvendt i dette eksempel opnås ved deacetylering af HPLC renset acetat fra eksempel ID i USA-patentskrift nr. 4.145.527.
5 Til en prøve af dette acetat sættes således en opløsning af natriummethoxid og methanol, og opløsningen omrøres ved stuetemperatur i en lukket beholder i 18 timer. Methanolen fjernes derpå under formindsket tryk.
Den således dannede G4pNp opløses i 66,7 mM natrium-10 phosphatpuffer, pH-værdi 6,5, til tilvejebringelse af en substratkoncentration på 4 mg/3ml. Derpå sættes 7,5 IU/3 ml α-glucosidase til substratopløsningen, og opløsningens volumen bringes op til 3,0 ml. Opløsningen inkuberes ved 37°C i 1-10 minutter.
15 Efter at blindhastigheden er målt, som beskrevet ovenfor i eksempel 1, inkuberes reaktionen ved tilsætning af 0,1 ml Du Pont Elevated Enzyme Control Product, fortyndet 1:1 med Du Pont Enzyme fortyndingsmiddel. Reaktionshastighederne for forskellige amylaseprøvekoncentrationer måles 20 som ovenfor angivet i eksempel 1, og en standardkurve fremstilles. Fra denne kurve måles sensitiviteten i mA/min/SU/dl. Standardkurven for dette substrat angives i figur 1, blindhastigheden og sensitiviteten angives i tabel II.
Dette er en råprøve, en prøve, som ikke er renset 25 ved chromatografisk fraskillelsesteknik. Som resultat er blindhastigheden meget høj, i området fra 10,3 til 13,3 mA/min, men sensitiviteten er ækvivalent med sensitiviteten af substratet beskrevet i eksempel 1, hvor den indledende rensning gennemføres under anvendelse af en Sephadex ® 30 LH-20 søjle.
En anden serie reaktioner gennemføres ved at anvende de ovenfor beskrevne betingelser, undtagen at reaktionen, fem minutter efter dens påbegyndelse, afbrydes ved tilsætning af en 1,5 ml aliquot af prøveopløsningen i enten 1,5 ml 35 0,2 M Na2C03 eller 5 ml 0,002 N NaOH. Ved en pH-værdi på 6,5 er ekstinktionskoefficienten af 4-nitrophenol relativt
DK 155751 B
13 lav, fordi 4-nitrophenolen overhovedet ikke er ioniseret. Forøgelse af pH-værdien forårsaget af afbrydelsen er tilstrækkelig til fuldstændigt at ionisere 4-nitrophenolen til 4-nitrophenylatanionen, hvorved ekstinktionskoefficienten 5 forøges. Dette giver anledning til en "end point"-bestemmelse, for hvilken standardkurverne er ikke-lineære, sandsynligvis fordi systemet gøres optimalt for en hastighed-og ikke en "end-point"-tilnærmelse. Der konstateres imidlertid en 5 til ti gange forøgelse i sensitiviteten.
10
Eksempel 4
En prøve af a-(4-nitrophenyl) maltotetraosid, fremstillet i overensstemmelse med eksempel 1G i USA-patentskrift nr. 4.145.527 opløses i 66,7 mM natriumphosphatpuffer, pH-15 -værdi 6,5, til tilvejebringelse af en substratkoncentration af 4 mg/3 ml. Derpå sættes 7,5 IU/3 ml α-glucosidase til substratopløsningen, og opløsningens volumen bringes op til 3,0 ml. Opløsningen inkuberes ved 37°C i 1-10 minutter.
Efter at blindhastigheden er målt i et Gilford spek-20 trophotometer ved 410 nm, påbegyndes reaktionen ved tilsætning af 0,1 ml Du Pont Elevated Enzyme Control Product, fortyndet 1:1 med Du Pont Enzyme Diluent. Reaktionshastighederne for de forskellige amylaseprøvekoncentrationer måles ved anvendelse af et Gilford spektrophotometer, og en stan-25 dardkurve fremstilles. Ud fra denne kurve måles sensitiviteten i mA/min/SU/dl. Standardkurven for denne kurve angives i figur 1, blindhastigheden og sensitiviteten angives i tabel II.
Dette er atter et substrat, som renses ved at anvende 30 en Sephadex ® LH-20 søjle. Sensitiviteten af analysen ved at anvende substratet ifølge dette eksempel er ækvivalent med sensitiviteten af analysen angivet i eksempel 1 og 3. Blindhastigheden er imidlertid noget lavere end hastigheden i eksempel 1 og betydelig lavere end hastigheden i eksempel 35 3.
14
DK 155751B
Eksempel 5
En prøve af a-(4-nitrophenyl)-maltopentaosid (GspNp), fremstillet ifølge eksempel 2E i USA-patentskrift nr.
4.145.527 opløses i 66,7 mM natriumphosphatpuffer, pH-værdi 5 6,5, til tilvejebringelse af forskellige substratkoncentra tioner i området fra 4,0 til 12,0 mg/3 ml. α-Glucosidase af forskellig aktivitet i området fra 15 til 45 IU/3 ml sættes derpå til substratopløsningen, og opløsningens volumen bringes op til 3,0 ml. Opløsningen inkuberes ved 37°C i 1-10 10 minutter.
Indledende forsøg gennemføres ved at anvende 4.0 mg/3 ml G5pNp og tre a-glucosidasekoncentrationer, 7,0, 14.0 og 28,0 IU/3 ml. For hver af disse tre koncentrationer, som angivet i eksempel 1, fremstilles standardkurverne under 15 anvendelse af amylaseprøven beskrevet i eksempel 1. I hvert tilfælde er blindhastigheden 3,0 mA/min. Standardkurven for de tre α-glucosidasekoncentrationer er angivet i figur 2.
Alle kurver er ikke-lineære, hvilket gør en bestemmelse af sensitiviteten vanskelig. Sensitiviteten anslås imidlertid 20 at være større end 0,160 mA/min/IU/dl. Lineariteten forøges ved forøgelse af α-glucosidasekoncentrationen, hvilket angiver, at α-glucosidasekoncentrationen er næsten optimal.
En to-variabel optimering gennemføres som beskrevet i eksempel 1. Resultaterne af denne optimering angives i 25 tabel III.
Tabel III
15
DK 155751 B
5 H 0,0031 0,004 0,005 g 45 0,1282 0,139 0,145 \ 0,1253 0,135 0,140
H
g 0,003 0,004 0,012 10 3 30 0,122 0,135 0,133 g 0,119 0,131 0,121
O
H
&> g 0,003 0,005 0,007 15 0,110 0,119 0,114 15 0,107 0,114 0,107 4,0 8,0 12,0
GgpNp mg/3ml 1, 2, 3 se tabel I
20 25 Af denne vurdering fremgår, at der er en lille stig ning i blindhastigheden, når G5PNP forøges. Dette er i overensstemmelse med situationen for G5 som ovenfor beskrevet.
Denne analyse angiver også, at den optimale værdi for enten G5PNP eller α-glucosidase ikke er nået ved 12,0 mg/3 ml 30 eller 45 IU/3 ml.
For så vidt som G5pNp har en lavere eller i det mindste en stabil blindhastighed som en funktion af substrat og α-glucosidasekoncentrationer, er det et foretrukket substrat»
De store koncentrationer af GspNp og α-glucosidase, der er 35 nødvendige for analysen, nedsætter imidlertid dets foretrukne status.
Claims (14)
1 X /X 30 x — 4— ' 09 * y Y 35 hvori X og Y hver især er valgt blandt Η, NO2/ halogen, alkyl med 1-4 carbonatomer, OR· og C02R', hvori R' er alkyl DK 1557518 med 1-6 carbonatomer, og mindst den ene af grupperne af x og Y er NO2·
1. Fremgangsmåde til bestemmelse af amylaseindholdet af en prøve under anvendelse af et oligosaccharidsubstrat, kendetegnet ved, at man 5 (a) til en opløsning indeholdende en afmålt mængde af prøven sætter et oligosaccharidsubstrat, hvori mindst 90% af oli-gosaccharidet har en bestemt kædelængde og har formlen ch2oh ch2oh ch2c-h ΛΛ- /S '/"Af ΗθΤγ·-°-Υ^·0Λρΐ/θΗ ' OH OH OH 15 |__ n hvori n er et helt tal mellem 2 og 8, og R er en substitueret aromatisk gruppe, der som fraskilt aglycon udviser en spek-tral absorption forskellig fra substratet, 20 (b) sætter en maltase til opløsningen, og (c) bestemmer opløsningens spektrale absorption.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at n er 2, 3 eller 4.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendete g- 25 net ved, at R er en substitueret aromatisk gruppe valgt blandt
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendeteg net veel, at R er A Ά' 10 hvori X og Y har den i krav 3 nævnte betydning.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at maltasen er a-glueosidase.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendete g- 15 net ved, at R er 4-nitrophenyl.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendeteg net ved, at opløsningen holdes ved en i det væsentlige konstant pH-værdi i det basiske område og i det væsentlige en konstant temperatur.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg net ved, at opløsningen holdes ved en i det væsentlige konstant pH-værdi i det basiske område og ved en i det væsentlige konstant temperatur.
9. Reagensforsøgsudstyr til brug ved fremgangsmåden 25 ifølge krav 1-8, kendetegnet ved, at det omfatter særskilte portioner af (a) et oligosaccharidsubstrat, hvori mindst 90% af oligo-saccharidet har en bestemt kædelængde og har formlen 30 ch2oh ch2oh ch2oh A A A OH OH OH Jn DK 155751B hvori n er et helt tal mellem 2 og 8, og R er en substitueret aromatisk gruppe, der som fraskilt aglycon udviser en spek-tral absorption forskellig fra substratet, og (b) en maltase.
10. Forsøgsudstyr ifølge krav 9, kendeteg net ved, at n er 2, 3 eller 4.
11. Forsøgsudstyr ifølge krav 10, kendetegnet ved, at R er en substitueret aromatisk gruppe valgt blandt 10 Λ X-- —J- — Y / / og
12. Forsøgsudstyr ifølge krav 11, kendetegnet ved, at maltasen er a-glucosidase.
13. Forsøgsudstyr ifølge krav 11, kendete g-25 net ved, at R er Λ
30 X-----Y hvori X og Y har den i krav 11 angivne betydning.
13. Y hvori X og Y hver især er valgt blandt H, N02, halogen, alkyl med 1-4 carbonatomer, OR' og C02R'/ hvori R' er alkyl 20 med 1-6 carbonatomer, og mindst den ene af grupperne X og Y er N02.
14. Forsøgsudstyr ifølge krav 11, kendeteg net ved, at R er 4-nitrophenyl.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70497676A | 1976-07-13 | 1976-07-13 | |
| US70497676 | 1976-07-13 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK315777A DK315777A (da) | 1978-01-14 |
| DK155751B true DK155751B (da) | 1989-05-08 |
| DK155751C DK155751C (da) | 1989-10-23 |
Family
ID=24831606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK315777A DK155751C (da) | 1976-07-13 | 1977-07-12 | Fremgangsmaade og forsoegsudstyr til bestemmelse af amylaseindholdet af en proeve |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5311092A (da) |
| BE (1) | BE856737A (da) |
| CA (1) | CA1104912A (da) |
| CH (1) | CH633582A5 (da) |
| DE (1) | DE2731421A1 (da) |
| DK (1) | DK155751C (da) |
| FR (1) | FR2358660A1 (da) |
| GB (1) | GB1571642A (da) |
| IE (1) | IE45395B1 (da) |
| IT (1) | IT1114891B (da) |
| LU (1) | LU77751A1 (da) |
| NL (1) | NL179399C (da) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4102747A (en) * | 1977-07-28 | 1978-07-25 | American Hospital Supply Corporation | Amylase determination |
| DE2741192C2 (de) * | 1977-09-13 | 1982-07-01 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von alpha- Amylase |
| DE2755803A1 (de) * | 1977-12-14 | 1979-06-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung von alpha-amylase |
| AT362526B (de) * | 1977-09-13 | 1981-05-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung von alpha- -amylase |
| DE2752501A1 (de) * | 1977-11-24 | 1979-05-31 | Kurt Prof Dr Wallenfels | Mit indikatorgruppen substituierte alpha-d-maltodextrine, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung zur bestimmung von glukosidasen und amylasen |
| JPS5768798A (en) * | 1980-10-14 | 1982-04-27 | Toyo Jozo Co Ltd | Novel measurement of amylase activity |
| DE3328616A1 (de) * | 1983-08-08 | 1985-02-28 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Oligoglucosidderivate |
| US4649108A (en) * | 1984-07-26 | 1987-03-10 | Genzyme Corporation | Alpha amylase assay |
| US4963479A (en) * | 1986-10-07 | 1990-10-16 | Hoechst Celanese Corporation | Reagent system for an alpha-amylase assay containing aromatic substituted glycoside |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2094693A (en) * | 1935-06-17 | 1937-10-05 | Trojan Powder Co | Nitration of sugars and their glycosides |
| GB1167083A (en) * | 1966-01-20 | 1969-10-15 | Warner Lambert Pharmaceutical | Assay Method for Amylase |
| FR1508496A (fr) * | 1966-01-20 | 1968-01-05 | Warner Lambert Pharmaceutical | Produit et procédé pour le dosage de l'amylase |
| SE336915B (da) * | 1968-01-15 | 1971-07-19 | Pharmacia Ab | |
| GB1366342A (en) * | 1970-07-28 | 1974-09-11 | Hayashibara Co | Process for the preparation of amylose |
| US3879263A (en) * | 1973-09-06 | 1975-04-22 | Du Pont | Method for the determination of amylase |
| JPS5185790A (en) * | 1975-01-24 | 1976-07-27 | Ono Pharmaceutical Co | Hitononyooyobitaiekinogurukoamiraazenobiryoteiryoho |
| CA1096376A (en) * | 1976-07-13 | 1981-02-24 | William B. Farnham | Process for preparing nitroaromatic glycosides |
-
1977
- 1977-07-11 CA CA000282419A patent/CA1104912A/en not_active Expired
- 1977-07-11 NL NL7707682A patent/NL179399C/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-07-12 DE DE19772731421 patent/DE2731421A1/de active Granted
- 1977-07-12 BE BE179280A patent/BE856737A/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-07-12 FR FR7721470A patent/FR2358660A1/fr active Granted
- 1977-07-12 IT IT2565377A patent/IT1114891B/it active
- 1977-07-12 DK DK315777A patent/DK155751C/da not_active IP Right Cessation
- 1977-07-12 CH CH864077A patent/CH633582A5/de not_active IP Right Cessation
- 1977-07-13 GB GB2950477A patent/GB1571642A/en not_active Expired
- 1977-07-13 IE IE145577A patent/IE45395B1/en not_active IP Right Cessation
- 1977-07-13 JP JP8400177A patent/JPS5311092A/ja active Granted
- 1977-07-13 LU LU77751A patent/LU77751A1/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE45395B1 (en) | 1982-08-11 |
| GB1571642A (en) | 1980-07-16 |
| NL7707682A (nl) | 1978-01-17 |
| DK155751C (da) | 1989-10-23 |
| NL179399C (nl) | 1986-09-01 |
| DE2731421C2 (da) | 1988-07-07 |
| IT1114891B (it) | 1986-01-27 |
| IE45395L (en) | 1978-01-12 |
| DK315777A (da) | 1978-01-14 |
| FR2358660B1 (da) | 1983-08-12 |
| JPS5311092A (en) | 1978-02-01 |
| FR2358660A1 (fr) | 1978-02-10 |
| LU77751A1 (da) | 1978-02-02 |
| JPS5753079B2 (da) | 1982-11-11 |
| NL179399B (nl) | 1986-04-01 |
| CH633582A5 (de) | 1982-12-15 |
| DE2731421A1 (de) | 1978-02-09 |
| BE856737A (fr) | 1978-01-12 |
| CA1104912A (en) | 1981-07-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4233403A (en) | Amylase assay | |
| GB1571265A (en) | Amylase determination | |
| Kivilaan et al. | A partial characterization of an autolytically solubilized cell wall glucan | |
| DK155751B (da) | Fremgangsmaade og forsoegsudstyr til bestemmelse af amylaseindholdet af en proeve | |
| Charoensapyanan et al. | Enzymatic synthesis of propyl-α-glycosides and their application as emulsifying and antibacterial agents | |
| US4376197A (en) | Indoxylmaltodextrins, a process for their preparation and their use | |
| JPS6183195A (ja) | 新規なオリゴサツカライド誘導体、及びこれを基質として用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 | |
| US4932871A (en) | Rapid method for preparing chromogenic alpha-amylase substrate compounds at high preparative yields | |
| JPS60237998A (ja) | α−アミラ−ゼ活性測定法 | |
| JPH0631293B2 (ja) | マルトオリゴ糖誘導体およびアミラーゼ活性測定用試薬 | |
| US5393660A (en) | Reagent for Determining α-amylase activity and method for determining α-amylase activity | |
| WO1994009122A1 (en) | A new glucan lyase producing 1,5-anhydrofructose | |
| EP0252525B1 (en) | Alpha-amylase assay using modified oligosaccharide and process for producing said modified oligosaccharide | |
| Quellhorst Jr et al. | Synthesis of Dolichol in a Polyprenol Reductase Mutant Is Restored by Elevation ofcis-Prenyl Transferase Activity | |
| JP3075377B2 (ja) | α−アミラーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬 | |
| Fujinaga-Isemura et al. | Studies on the Substrate Specificity of Taka-amylase A I. The Mode of Action on Partially O-Methylated Amyloses of Taka-amylase A | |
| JPS61502515A (ja) | のう胞性線維症の線毛静態化因子決定方法 | |
| Wallenfels et al. | Action pattern of human pancreatic and salivary α-amylase on 1, 4-α-D-nitrophenylmaltooligosaccharides. 1, 4-α-D-nitrophenylmaltooligosaccharides as substrates of α-amylase, I | |
| JPS5931699A (ja) | α−アミラ−ゼ活性の測定法 | |
| US5350678A (en) | Method of differential assay for α-amylase isozymes and a kit for the same | |
| JPS63283599A (ja) | α−アミラ−ゼの活性測定法 | |
| JPS6317895A (ja) | 新規なオリゴサツカライド誘導体、及びこれを用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 | |
| JPS63214193A (ja) | ６−グルコシルマルトオリゴ糖誘導体の製法およびそれを用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 | |
| JP3627817B2 (ja) | α−アミラーゼ活性測定法およびその試薬組成物 | |
| JPS602199A (ja) | α−アミラ−ゼ活性測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |