JPS63283599A - α−アミラ−ゼの活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なα−アミラーゼ基質を用いたα−アミラ
ーゼの活性測定法に関する。

（従来の技術） 膵液や尿などの体液に含有されるα−アミラーゼの活性
を測定することにより、各種疾患の診断が行われている
。α−アミラーゼの活性測定法には、例えばマルトオリ
ゴ糖（マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トテトラオースなど）を基質とする方法がある。この方
法では、ａ−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖と
α−グルフシダーゼとを作用させて基質からグルコース
を遊離させ、グルコースの量を測定することにより、α
−アミラーゼの活性値を知る。マルトオリゴ糖としてマ
ルトペンタオースを用いた例を次に示す。

α−アミラーゼ ■　マルトペンタオース　　　　　　　　　マルトース
＋マルトトリオース生成したグルコースは、例えば、グ
ルコースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ／色素系を利
用する定量法；へキソキナーゼ／ホス７オグルコムター
ゼ／グルフース−６−ホス７エートデヒド四ゲナーゼ１
ＮｋＤＨ系を利用する測定法などにより測定される。α
−グルコシダーゼはマルトペンタオースなどの四糖以上
のオリゴ糖に作用しにくくマルトースやマルトトリオー
スなどの三糖以下のオリゴ糖に良好に作用するため、上
記基質を使用してグルコースを測定することによりα−
アミラーゼの活性を測定することができる。しかし、α
−グルコシダーゼはわずかではあるが基質であるマルト
ペンタオースに作用するため、測定のブランク値が上昇
し、その結果、測定値の誤差が大きくなるという欠点が
ある。α−グルコシダーゼの基質分解作用のため、α−
グルコシダーゼと基質とを一液化することは、試薬とし
ての安定性が損なわれるため好ましくない。

マルトオリゴ糖の還元性末端にフェニル基、ナフチル基
、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させた
基質を用いる方法も提案されている。例えば、基質とし
てｐ−二トロフェニルマルトペンタオシド（特公昭５７
−！５３０’１９号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルト
へキサオシド（特公昭５７−１５３０７９号公報）、ｐ
−ニトロフェニルマルトへブタオシド（特開昭５４−５
１８９２号公報）、ｚ、４−ジクロロフェニルマルトペ
ンタオシド（特開昭３６−３５９９１３号公報）などが
利用されている。これらの基質を用いると、アグリコン
が遊離し、遊離したアグリコン、例えばｐ−ニトロフェ
ノールを光学的に測定することにより、α−アミラーゼ
の活性を容易に測定することができる。

代表的な基質を用いた場合の反応式を次に示す。

（Ｉ）　　ｐ−二トロフェニルーα−マルトペンタオシ
ドを基質とする場合 α−アミラーゼ ■　ｐ−ニトロフェニル−α−マルトペンタオシドｐ−
ニトロフェニル−α−マルトシド＋マルトトリオース■
　ｐ−ニトロフェニル−α−マルトシド＋マルトトリオ
ースα−グルコシダーゼ ｐ−ニトロフェノール＋グルコース （Ｚ）ａ、４−ジクロロフェニル−β−マルトペンタオ
シドを基質とする場合 α−アミラーゼ ■　２　ｅ　４−ジクロロフェニル−β−マルトヘンタ
オシトーーーーー→２．４−ジクロロフェニル−β−マ
ルトシド＋マルトトリオース■　２，４−ジクロロフェ
ニル−β−マルトシド＋マルトトリオースα−グルコシ
ダーゼ 、４−ジクロロフェニル−β−グルコシドグルコースβ
−グルフシターゼ ■　２，４−ジクロロフェニル−β−グルコシド２．４
−ジクロロフェノール＋グルコース乳化剤 ■　２．４−ジクロロフェノール＋４−アミノアンチピ
リ≧−−−ラキノン色素 上記（Ｉ）および（２）のいずれの方法においても、α
−グルコシダーゼがわずかではあるが基質に作用するた
め、ブランク値が上昇する欠点がある。α−グルコシダ
ーゼの基質分解作用のため、前記グルコースを測定する
方法と同様にα−グルコシダーゼと基質とを一液化する
ことは難しい。

このような欠点を解消するため、マルトオリゴ糖の非還
元性末端のグルコースの６位のヒドロキシル基が修飾さ
れたタイプの基質を用いる方法が提案されている。例え
ば、特開昭６０−２３７９９８号公報には非還元性末端
のグルコースの６位のＯＨ基を例えば、ハロゲン原子、
−０Ｒ１−００ＯＲ，−０８０２Ｒ。

−ＨＨＲ（Ｒはアルキル、フェニル、ピリジルなど）で
置換し、還元性末端のグルコースに置換または未置換の
フェニル基がアグリコンとして結合したマルトトリオー
スが基質として開示されている。

非還元性末端グルコースの６位のＯＨ基が置換されてい
るとα−グルコシダーゼによる基質の分解が起こらない
。

しかし、このように６位のみに置換基が導入された基質
は、合成が困難であり、収率も悪いという欠点がある。

また特開昭６０−５４３９５号公報には非還元性末端の
グルコースの４位および６位のＯＨ基をアルキル基又は
アルコイル基又はフェニル基で置換し、還元性末端のグ
ルコースにアグリコンを結合させたマルトオリゴシトを
基質として用いることが開示されている。非還元性末端
グルコースの４位および６位のＯＨ基が置換されている
とα−グルコシダーゼによる基質の分解が生じ難い。し
かし、このような基質は、２つのＯＨ基が置換されてい
るため、水溶性が悪く高濃度溶液の調製が不可能であり
、α−アミラーゼ活性測定に十分な濃度を溶解すること
ができないという欠点がある。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解消しようとするものであり
、その目的とするところは、基質と追随酵素の一液化条
件において、α−グルコシダーゼ等の追随酵素の作用を
受けず、合成が容易であり、かつ水溶性に優れた基質を
用いて体液中のα−アミラーゼ活性を精度よく簡単な操
作で測定する方法を提供することにある。

（問題点を解決するための手段および作用）本発明は、
非還元性末端グルコースの４位および６位のヒドロキシ
ル基が修飾されたα−フェニルマルトオリゴシドおよび
／または非還元性末端グルコースの４位および６位のヒ
ドロキシル基が修飾されたβ−フェニルマルトオリゴシ
ドである次式（Ｉ）で示される基質に、α−グルコシダ
ーゼおよび／またはグルフアミラーゼおよび必要により
β−グルコシダーゼの共存下でα−アミラーゼ含有試料
を作用させ、遊離するフェノール系化合物を測定するこ
とを特徴とするα−アミラーゼの活性測定法である。

（式中、Ｒ１およびＲ８の少なくとも一方は水酸基、カ
ルボキシル基又はスルホン酸基を有する炭素数１〜６の
置換アルキル基あるいは水酸基、ヒドロキシル基、又は
スルホン酸基を有する置換フェニル基を示し、残された
基は水素、炭素数１〜６のアルキル基あるいは７エエル
基を示す。Ｒ３は置換又は未置換のフェニル基を示す。

ｎ　＝　１〜８である。） 本発明に用いる基質の骨格となるマルトオリゴ糖は３〜
１０個の糖（式（Ｉ）のｎ　＝　１〜８に相当）から形
成される。マルトオリゴ糖としては、マルトトリオース
、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘ
キサオース、マルトヘプタオースなどがある。特にマル
トテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオ
ース、マルトヘプタオースが好適である。

マルトオリゴ糖の非還元性末端グルコースの置換基であ
るＲ１およびＲ２は同一の基であっても異なる基であっ
てもよい。Ｒ１およびＲ１の少なくとも一方は水酸基、
カルボキシル基又はスルホン酸基を有する炭素数１〜６
の置換アルキル基あるいは水酸基、ヒドロキシル基、又
はスルホン酸基を有する置換フェニル基であり、残され
た基は水素、炭素数１〜６のアルキル基あるいはフェニ
ル基を示す。水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基は
同一のアルキル基、又はフェニル基に置換してもよく、
また複数個置換してもよい。

このような置換アルキル基としては、ヒドロキシメチル
、スルホメチル、カルボキシメチル、ヒドロキシエチル
、スルホエチル、カルボキシエチル、ヒドロキシプロピ
ル、スルホプロピル、ヒドロキシブチル、スルホブチル
、カルボキシブチルなどがある。

置換フェニル基としては、４−ヒドロキシフェニル、４
−スルホフェニル、４−カルボキシフェニル、３−ヒド
ロキシフェニル、３−スルホ７エ二ル、３−カルボキシ
フェニル、２−ヒドロキシフェニル、２−スルホフェニ
ル、２−カルボキシフェニル、２，４−ジヒドロキシフ
ェニル、２　、　ａ−ジカルボキシフェニル１２，４−
ジスルホフェニルＳ２−ヒドロキシ−４−カルボキシフ
ェニル、２−ヒドロキシ−４−スルホフェニル、３．５
−ジヒドロキシフェニル、３．５−ジカルボキシ７工二
ル、３．５−ジスルホフェニル、２，４．６−トリヒド
ロキシフエニル、４−ヒドロキシメチルフェニル、４−
スルホメチルフェニル、４−カルボキシメチルフェニル
、４−ヒドロキシエチルフェニル、４−スルホエチルフ
ェニル、４−カルボキシエチルフェニル、４−ヒドロキ
シプロピルフェニル、４−スルホプロピルフェニル、４
−カルボキシプロピルフェニル、４−（２−ヒドロキシ
プロピル）フェニル、４−（２−スルホプロピル）フェ
ニル、４−（２−カルボキシプロピル）フェニル、４−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）フェニル、４
−（２−ヒドロキシ−３−カルボキシプロピル）フェニ
ル、３−ヒドロキシメチルフェニル、３−スルホメチル
フェニル、３−カルボキシメチルフェニル、３−ヒドロ
キシエチルフェニル、３−スルホエチルフェニル、３−
カルポキシエチルフエニル、３−ヒドロキシプロピルフ
ェニル、３−スルホプロピルフェニル、３−カルボキシ
プロピルフェニル、ｓ−（ｇ−ヒドロキシプロピル）フ
ェニル、３−（ｇ−スルホプロピル）フェニル、３”（
２−カルボキシプロピル）フェニル、３−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）フェニル、３−（２−ヒド
ロキシ−３−カルボキシプロピル）フェニルなどがある
。

修飾マルトオリゴシトのアグリコンに相当するＲ３は置
換または未置換のフェニル基である。式は還元性末端の
グルコースの１位のＯＨ基にα型で結合していてもよく
、β型で結合していてもよい。

置換フェニル基とは、ハロゲン原子、とドロキシ基、炭
素原子数１〜６のアルキル基、アルコキシ基、アルコキ
シカルボニル基、ニトロ基なトラ有するフェニル基であ
る。このような基を形成しうる置換フェノール類として
は、例えばクロロフェノール、ジクロロフェノール、ヒ
ドロキシフェノール、アルキルフェノール、アルコキシ
フェノール、ヒドロキシ安息香酸、ニトロフェノール、
ハロゲン化ニトロフェノール、アルキル化ニトロフェノ
ール、アルコキシ化ニトロフェノール、ニトロ化ヒドロ
キシ安息香酸、ジニトロフェノールなどが挙げられる。

特に少なくとも１個のニトロ基を有する７エ／−ル類、
例えば４−ニトロフェノール、２−クロロ−４−二トロ
フェノール、２゜６−ジクロロ−４−二トロフェノール
、２．６−ジプロモー４−二トロフェノール、２−ブロ
モ−４−ニトロフェノール、２−ニトロフェノール、２
−ヒドロキシ−４−ニトロフェノール、３−ヒドロキシ
−４−二トロフェノールなどが好適である０ 上記修飾ａ−（またはβ−）フェニルマルトオリゴシド
は新規化合物である。このような化合物としては、例え
ば次の化合物がある。〔〕内は略称である。

（Ｉ）２−クロロ−４−二トロフェニル　４．６−ｏ−
４ａ−スルホベンジリデン）−〇−α−り一グルコビラ
ノシルー（（Ｉ−４）−０−α−Ｄ−グルフピラノシル
ー）ｓ−０−β−Ｄ−グルコピラノシド 〔４−スルホベンジリデン　２−クロロ−４−二トロフ
ェニルーβ−マルトペンタオシド〕（２）４−ニトロフ
ェニル　４．６−０−（３゜６−ジヒドロキシベンジリ
デン）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（（Ｉ−４）
−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−）ｓ−０−α−Ｄ−
グルフビラノシド （３，５−ジヒドロキシベンジリデン　４−ニトロフェ
ニル−α−マルトヘプタオシド〕（８）２−クロロ−４
−二ト℃フェニル　４．６−〇−ヒドロキシイソプロピ
リデンー〇−α−Ｄ−グルコビラノシル−（（Ｉ，４）
−０−α−り一グルコピラノシルー）３−ｏ−α−Ｄ−
グルコピラノシド 〔ヒドロキシイソプロピリデン　２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−α−マルトペンタオシド〕（４）　２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル　４，６−Ｏ−（３−ヒドロ
キシ−４−カルボキシベンジリデン）−〇−α−Ｄ−グ
ルコピラノシルー（（Ｉ→４）−〇−α−Ｄ−グルコピ
ラノシルー）３−〇−α−Ｄ−グルコピラノシド 〔３−ヒドロキシ−４−カルボキシベンジリデン２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトペンタオシド〕 （５）２−クロロ−４−ニトロフェニル　４，６−Ｏ−
（２−ヒドロキシ−４−スルホベンジリデン）−ｏ−α
−Ｄ−グルフピラノシル−（（Ｉ→４）−〇−α−Ｄ−
グルコピラノシル）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシド 〔２−ヒドロキシ−４−スルホベンジリデン　２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−α−マルトヘンタオシド〕 本発明の基質（Ｉ）は新規な化合物であり、化合物α）
にカルボニル化合物またはそのアセタール＠）を反応さ
せることによって製造することができる。

上記反応は一般に非反応性溶媒中で行なわれ該非反応性
溶媒としては、ジメチルホルムアミド・ジメチルスルホ
キサイド、エチレングリコールジメチルエーテル等が例
示され、必要により上記化合物ｌ自体を溶媒として用い
る場合もある０反応温度は特に制限されないが、通常０
°Ｃから溶媒の沸点までの範囲で行なうことが推奨され
・更に好ましい範囲は４０〜１００°Ｃである。更に減
圧下還流加熱したり、あるいは副生アルコール類を蒸発
除去しながら反応させるのも効果的である。反応の促進
のために触媒たとえば少量の純硫酸、塩酸ガス、’Ｏ−
）ルエンスルホン酸あるいは無水塩化亜鉛などが用いら
れることもある。

前記製造方法によれば、マルトオリゴ糖の非還元性末端
グルコース残基に環状アセタール保護基を選択的に結合
させることが可能である。長谷用らの糖製状アセタール
に関する研究報＠（Ｏａｒｂｏｈｙｄ。

Ｒ＠ＩＩ　２９２０９　　（Ｉｅｔ３））及びその他の
研究報告によれば単糖類のグルコースの４位および６位
のＯＨ基に対し選択的に環状アセタールを結合させる方
法が発表されている。しかしより高分子量の核置換フエ
ニＡ・マルトオリゴサイドについて非還元性末端グルコ
ース残基の４位又は６位のＯＨ基に環状アセタールを選
択的に結合させる方法は全く新規な発明であってその有
用性は大きい。

原料物質である核置換フェニルマルトオリゴシト（Ｉ）
は、核置換芳香族化合物とマルトオリゴ糖を通常の方法
に従って合成する。化学的にはマルトオリゴ糖をアセチ
ル化し、このアセチル化マルトオリゴ糖と核置換芳香族
化合物を結合させた後、脱アセチル化することにより合
成できる（実験化学講座第２４巻第３０４頁、１９５８
年参照）。生化学的にはサイクロデキストリン、グリコ
ジルトランス７工ラーゼル置換芳香族化合物と可溶性デ
ンプン（またはα−サイクロデキストリンまたは白色デ
キストリン）を反応させて、核置換フェニルマルトオリ
ゴシトを合成することができる。例えば、４−スルホベ
ンジリデン　２−クロロ−４−二トロフェニルーβ−マ
ルトペンタオシドハ２−クロロー４−ニトロフェニルマ
ルトペンタオシドに４−スルホベンズアルデヒドを作用
させて得られる。

本発明に用いられるα−グルコシダーゼの起源は、特に
限定されない。動物、植物、微生物などから得られるα
−グルコシダーゼが利用され得る。

特に、酵母起源のα−グルコシダーゼは、マルトトリオ
シト以下のグリコシドによく作用し、かつマルトテトラ
オシド以上のグルコシドには作用しにくい点、およびア
グリコンの特異性が広い点から好適に利用されうる。

β−グルフシダーゼおよびグルコアミラーゼの起源も特
に限定されない。例えば、アーモンドから得られるβ−
グルコシダーゼやりシブスプレマーから得られるグルコ
アミラーゼが好適に利用されつる。

本発明方法によりα−アミラーゼの活性を測定するには
、上記基質、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼお
よびβ−グルコシダーゼを適宜組み合わせた酵素系（追
随酵素系）、および必要に応じてその他の添加物を含有
する試薬にα−アミラーゼを含む試料を作用させる。例
えば、アグリコンがα型に結合した基質（α型基質）を
用いる場合には、追随酵素系としてはα−グルコシダー
ゼおよび／またはグルコアミラーゼが使用される。

アグリコンがβ型に結合した基質（β型基質）を用いる
場合には、追随酵素系としては、α−グルコシダーゼお
よび／ま〆はグルコアミラーゼおよびβ−グルコシダー
ゼが使用される。

本発明方法による基質分解の反応式を４−スルホ−ベン
ジリデン　２−クロロ−４−二トロ７二二ルーα（また
はβ）−マルトペンタオシドを例に挙げて説明する。

（Ｉ）　　４−スルホベンジリデン　２−クロロ−４−
二トロフェニルーａ−マルトペンタオシトヲ基質とする
場合 ■　４−スルホベンジリデン　２−クロロ−４−二トロ
フェニルーαα−アミラーゼ ーマル）ぺ／タｒシＹ　　　　　　　　　　ｚ−クロロ
−４−二トロフェニルーα−マルトシド＋４−スルホベ
ンジリデントリオース■　２−クロロ−４−二トロフェ
ニルーａ−マルトシド＋４−スルホベンジリデントリオ
ース ４−ニトロフェノール＋グルコース＋４−スルホベンジ
リデングルコース （２）　　４−スルホベンジリデン　２−クロロ−４−
ニトロフェニル−β−マルトペンタオシトヲ基質とする
場合 ■　４−スルホベンジリデン　２−クロロ−４−二トロ
フェニルーβα−アミラーゼ ーマルトヘンタオシトーー→２−クロロ−４−二トロフ
ェニルーβ−マルトシド＋４−スルホベンジリデントリ
オース■　２−クロロ−４−二トロフェニルーβ−マル
トシド＋４−スルホベンジリデントリオース ４−ニトロフェニル−β−グルコシド＋グルコース＋４
−スルホベンジリデングルコース ■　２−クロロ−４−二トロフェニルーβ−グルコシド
β−グルフシダーゼ ２−クロロ一番−二トロフェノール＋グルコース上記反
応にて遊離したフェノール系化合物（上記例においては
２−クロロ−４−ニトロフェノール）を適当な手段によ
り測定することにより、α−アミラーゼの活性を測定す
ることができる。遊離するフェノール系化合物が基質と
は異なるスペクトル吸収を示す場合には、反応混合物の
スペクトルを直接測定する。基質から遊離したフェノー
ル系化合物が基質とほぼ同じスペクトル吸収を示す場合
には、該フェノール化合物を呈色試薬、例えば４−アミ
ノアンチピリンなどの色原体と過酸化水素とをペルオキ
シダーゼの存在下に酸化縮合させ、その発色強度を測定
する。

フェノール系化合物の測定方法としては、’ａ　−アミ
ラーゼの反応を連続的に追跡するレート法又は一定時間
反応させた後、反応を止めて測定するエンドポイント法
のいずれもが使用されうる。

本発明方法における酵素反応時には、グルコアミラーゼ
はα−グルコシダーゼとほぼ同等の働きを有する。ただ
し、α−グルコシダーゼがマルトトリオシト以下の低分
子グリコシドにはよく作用するが、マルトテトラオシド
以上のグルコシドには作用しにくいのに対して、グルコ
アミラーゼはマルトテトラオシド以上のグルコシドにも
作用する。例えば、基質としてマルトヘプタオシド以上
の高分子グルコシドを用いると、α−アミラーゼの作用
によりマルトテトラオシド以上のグルコシドが生成する
ことがある。このようなマルトテトラオシド以上のグル
コシドは、α−グルコシダーゼでは分解されにくいが、
グルコアミラーゼを用いるとグルツース単位にまで容易
に分解される。

そのため測定系の感度が上昇する。α−グルコシダーゼ
およびグルコアミラーゼを共存させた追随酵素系が好適
に利用される。

本発明方法によれば非還元性末端グルコースの４位およ
び６位のＯＲ基が修飾されたα−又はβ−マルトオリゴ
シトを基質として利用するため、α−グルコシダーゼや
グルコアミラーゼなどの追随酵素系と基質を一液化した
試薬を調製、保存してもこれらの酵素が基質を分解する
ことがほとんどない。そのため、試薬ブランク値の上昇
が抑制され、精度よくα−アミラーゼ活性を測定するこ
とができる。

本発明の基質は、式（Ｉ）で示される化合物のＲ１およ
びＲ２が水溶性基であり、水に対する溶解性が優れてい
る。また合成が容易であるため安価に提供され得る。本
発明方法は自動分析機を用いての連続測定も可能であり
、簡便かつ安価にα−アミラーゼ活性の測定がなされう
る。

（実施例） 以下に本発明を実施例で説明する。

実施例１および比較例１−１〜１−２ 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０ｍＭグツドバッファー（ｐＨ’７．０）α−グルコ
シダーゼ　　　８０ルー β−グルコシダーゼ　　　ｌＯ坂− 基質（表１参照）　　　　　　２　ｍＭ試薬調製直後、
１０分後、２０分後および３０分後にこの試薬の４００
　ｎｍにおける吸光度を測定した（試薬３ｍ１３７°Ｃ
）。吸光度の変化（ブランク値の経時変化）を表１に示
す。

表　　１ 表１から、本発明方法に用いられる非還元性末端が修飾
された基質を含有する試薬は、非還元性末端が修飾され
ていない基質を含有する試薬に比べてブランク値が低く
、その経時的な上昇の度合も極めて小さいことがわかる
。

下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ａｏｍｕグツドバッファー（Ｉ）Ｈ’７．０）α−グル
コシダーゼ　　　ａｏＵ廓 グルコアミラーゼ　　　　１０麹 基質（表２参照）　　　　　　２　ｍＭこの試薬を用い
、実施例１と同様に吸光度の変化を測定した。次に、上
記試薬３−を試料血清５０μｌ　に添加し、３７℃にて
５〜６分間放置した後、４００ｎｍにおける吸光度の変
化を測定し、１分間あたりの吸光度の変化（アミラーゼ
活性の指標となる）を算出した。試薬ブランク値の経時
変化および１分間あたりの吸光度の変化を表２に示す。

一夾！二」− 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０ｍＭグツドバッファー（ｐＨ７，０）α−グルコシ
ダーゼ　　　８０ルー 基質（表２参照）　　　　　　ｚ　ｍＭこの試薬を用い
、実施例１１−１と同様に操作を繰り返した。その結果
を表２に示す。

比較例２ 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０ｍＭグツドバッファー（ｐＩ−１７，０）α−グル
コシダーゼ　　　８００廓 グルコアミラーゼ　　　　ｌ　ＯＵ／１基質（表２参照
）　　　　　　２　ｍＭこの試薬を用い、実施例３−１
と同様に操作を繰りかえした。その結果を表２に示す。

表２から、本発明試薬（実施例！−１，３−２）は非還
元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬（比較
例３）に比べてブランク値が低く、その経時的上昇の度
合も極めて小さい。実施例３−１においてはグルコアミ
ラーゼが試薬中に含有されているため、実施例３−２に
比べて測定感度が高くなっているのが確認される。

実施例８−１〜８−３．および比較例３下記組成の試薬
を調製した。

試薬組成： ５０ｍＭＰ工ＰＩＣＳバッファー（ｍ　７．０）α−グ
ルコシダーゼ　　　８０Ｕ〜 基質（表３参照）　　　　　　２　ｍＭこの試薬を用い
、実施例ｔ−１と同様に操作を繰りかえした。その結果
を表３に示す。

表３から、本発明試薬（実施例δ−１〜８−３）は、非
還元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬（比
較例８）に比べてブランク値が低く、その経時的な上昇
の度合も極めて小さい。

実施側番および比較例４−１〜４−２ 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０ｍＭグツドバッファー（ｐｉ（７，０）α−グルコ
シダーゼ　　　８０Ｕ廓 β−グルコシダーゼ　　　ｌ　ＯＵ／ｊ基質（表３参照
）　　　　　　２　ｍＭ試薬調製直後、１０分後、１１
０分後および３０分後にこの試薬の４００　ｎｍにおけ
る吸光度を測定した（試薬３ｍｇ＋３７°Ｃ）。吸光度
の変化（ブランク値の経時変化）を表４に示す。

表４から、本発明方法に用いられる非還元性末端が修飾
された基質を含有する試薬は、非還元性末端が修飾され
ていない基質を含有する試薬に比べてブランク値が低く
、その経時的な上昇の度合も極めて小さいことがわかる
。

’！ｉ二り 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０ｍＭグツドバッファー（ｐＨ７，０）α−グルコシ
ダーゼ　　　８０　ｔＴ／ｓＺグルコアミラーゼ　　　
　１０ルー 基質（表４参照）　　　　　　２　ｍＭこの試薬を用い
、実施例１と同様に吸光度の変化を測定した。次に、上
記試薬３−を試料血清５０μｌに添加し、３７°Ｃにて
５〜６分間放置した後、４００　ｍｍにおける吸光度の
変化を測定し、１分間あたりの吸光度の変化（アミラー
ゼ活性の指標となる）を算出した。試薬ブランク値の経
時変化および１分間あたりの吸光度の変化を表５に示す
。

遺」Ｅ皿ノー二主 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成； ５０ｍＭグツドバッファー（ｐＨ７，０）α−グルフシ
ダーゼ　　　８０　ＴＪ／を基質（表５参照）　　　　
　　２　ｍＭこの試薬を用い、実施例！−１と同様に操
作を繰り返した。その結果を表５に示す０ 比較例６ 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０ｍＭグツドバッファー（田７．０）α−グルコシダ
ーゼ　　　８０麹　。

グルコアミラーゼ　　　　１０欧− 基質（表４参照）　　　　　　２　ｍＭこの試薬を用い
、実施例！−１と同様に操作を繰り返した。その結果を
表５に示す。

表５から、本発明試薬（実施例５−１〜Ｉｓ−２）は、
非還元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬（
比較例Ｓ）に比べてブランク値が低く、その経時的な上
昇の度合も極めて小さい。実施例６−１においてはグル
コアミラーゼが試薬中に含有されるため、実施例６−２
に比べて、測定感度が高くなっているのが確認される。

下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０ｍＭＰ工ＰＩＯＳバッファー（田７．０）α−グル
コシダーゼ　　　８０ン讐 基質（表６参照）　　　　　　２ｍＭ この試薬を用い、実施例ｚ−１と同様に操作を繰りかえ
した。その結果を表６に示す。

表６から、本発明試薬（実施例６−１〜６−８）は、非
還元性末端が修飾されていない基質を含有する試薬（比
較例６）に比べてブランク値が低く、その経時的な上昇
の度合も極めて小さい。

、　（発明の効果） 本発明によれば、このように、特定の構造を有するα−
フェニルマルトオリゴシドを基質として簡便かつ精度良
くα−アミラーゼの測定が行われる。本発明に使用され
る基質は、水溶性が高く、追随酵素による分解を受けな
いのでα−アミラーゼの測定が安定して、精度高く測定
できる。本発明方法を用いた体液中のα−アミラーゼの
測定は、各種疾患の診断などに利用されうる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 非還元性末端グルコースの４位および６位のヒドロキシ
   ル基が修飾されたα−フェニルマルトオリゴシドおよび
   ／または非還元性末端グルコースの４位および６位のヒ
   ドロキシル基が修飾されたβ−フェニルマルトオリゴシ
   ドである次式（ I ）で示される基質に、α−グルコシ
   ダーゼおよび／またはグルコアミラーゼおよび必要によ
   りβ−グルコシダーゼの共存下でα−アミラーゼ含有試
   料を作用させ、遊離するフェノール系化合物を測定する
   ことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒ＿１およびＲ＿２の少なくとも一方は水酸基
   、カルボキシル基又はスルホン酸基を有する炭素数１〜
   ６の置換アルキル基あるいは水酸基、ヒドロキシル基、
   又はスルホン酸基を有する置換フェニル基を示し、残さ
   れた基は水素、炭素数１〜６のアルキル基あるいはフェ
   ニル基を示す。Ｒ＿３は置換又は未置換のフェニル基を
   示す。ｎ＝１〜８である。）