JP2542700B2 - デオキシマルトオリゴシド誘導体、これを有効成分とするα―アミラ―ゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα―アミラ―ゼ活性の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規な６−デオキシマルトオリゴシド誘導
体、該誘導体を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定
用試薬及び該誘導体を用いてα−アミラーゼ活性を効率
よく、かつ正確に測定する方法に関するものである。

従来の技術 従来、血清、尿、膵液、唾液などの体液を対象とする
α−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上極めて重要で
あり、特に急性や慢性の肝炎、膵臓がん、流行性耳下腺
炎などの鑑別診断においては必須の測定項目となってい
る。

このα−アミラーゼ活性の測定方法については、従来
より種々の方法、例えば（１）デンプン又は色素結合デ
ンプンを基質とし、還元力あるいは吸光度を測定する方
法、（２）マルトテトラオース、マルトペンタオースな
どの一連のマルトオリゴ糖を基質として利用し、α−ア
ミラーゼにより切断したのち、共役酵素系を作用させ、
生成するマルトース、グルコース又はグルコース−６−
リン酸を定量する方法、（３）各種置換フェニルマルト
オリゴシド類を基質として利用し、α−アミラーゼによ
り切断したのち、共役酵素系を作用させ、生成する置換
フェノール類をそのままあるいは必要に応じてpHを変化
させたのち、あるいは縮合反応を行ったのち比色定量す
る方法、（４）非還元末端グルコースの６位及び／又は
４位をアリール基、アルキル基等で修飾した、各種置換
フェニルマルトオリゴシド類を基質として利用し、
（３）と同様に比色定量する方法などが知られている。

しかしながら、（１）の方法においては、基質に用い
られるデンプンの品質により測定値にバラツキが生じ
る。また、酵素切断部位が多数存在するため、α−アミ
ラーゼ反応を真に化学量論的反応として測定できないな
どの欠点を有している。これに対し、（２）の方法は、
均一な基質を使用するために、前記（１）の欠点を補う
ことができるが、あらかじめ試料中のマルトース、グル
コースなどの糖質を完全に消去することが必要である
上、酵素反応で生成するグルコースをグルコースオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、クロモゲン系を用いて測定
する場合に、試料中のグルコースの影響を補正する必要
があるとともに、多量のグルコースオキシダーゼを必要
とし、さらに、試料中に存在するアスコルビン酸、ビリ
ルビンなどの還元物質の影響を免れないなどの欠点があ
る。

一方、（３）の方法、特に２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−β−マルトペンタオシドを基質として使用する
方法は、現在最も優れた方法として広く普及している
が、基質が共役酵素に分解されるため、正の誤差を生じ
やすく、また、共役酵素量を減らすとラグタイムが長く
なるという欠点を有している。そこで、（３）の方法に
おける欠点を改良するために共役酵素で分解されない前
記（４）の方法が開発されている。

しかしながら、これらの基質は、水に対する溶解度が
低い、α−アミラーゼに対する親和性が低い、α−アミ
ラーゼによる分解速度が低い、化学的に不安定で長期間
保存することができないなどの多くの欠点を有してい
る。

発明が解決しようとする課題 本発明は、このような従来のα−アミラーゼ活性の測
定試薬及びそれを用いる測定方法が有する欠点を克服
し、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定し
うる試薬として好適な新規化合物を提供するとともに、
これを試薬とした新規なα−アミラーゼ活性の測定方法
を提供することを目的としてなされたものである。

課題を解決するための手段 本発明者らは、前記目的を達成するために種々研究を
重ねた結果、α−アミラーゼ活性測定用試薬として特定
の新規６−デオキシマルトオリゴシド誘導体が極めて好
適であり、これを用いてα−アミラーゼ活性を測定する
ことにより、その目的を達成しうることを見出し、この
知見に基づいて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、一般式 （式中のＲは芳香族発色性基であり、ｎは２〜６の整数
である） で表わされる６−デオキシマルトオリゴシド誘導体、一
般式（Ｉ）の化合物を有効成分とするα−アミラーゼ活
性測定用試薬、α−アミラーゼ含有試料に、一般式
（Ｉ）の化合物のα−アノマーと、α−グルコシダーゼ
及び／又はグルコアミラーゼを添加して酵素反応を行わ
せ、遊離する芳香族発色性化合物を定量するα−アミラ
ーゼ活性を測定方法、及びα−アミラーゼ含有試料に、
一般式（Ｉ）の化合物のβ−アノマー又はα−アノマー
とβ−アノマーとの混合物と、α−グルコシダーゼ及び
／又はグルコアミラーゼ並びにβ−グルコシダーゼを添
加して酵素反応を行わせ、遊離する芳香族発色性化合物
を定量することを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定
方法を提供するものである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の前記一般式（Ｉ）の６−デオキシマルトオリ
ゴシド誘導体における６−デオキシマルトオリゴ糖部と
しては、例えば、α−及び／又はβ−6⁴−デオキシ−Ｄ
−マルトテトラオースからα−及び／又はβ−6⁸−デオ
キシ−Ｄ−マルトオクタオースまでに対応するものが全
て使用できる。これらの中でも特に6⁵−デオキシ−Ｄ−
マルトペンタオース、6⁶−デオキシ−Ｄ−マルトヘキサ
オース、6⁷−デオキシ−Ｄ−マルトヘプタオースが好適
である。なお、上記化合物におけるデオキシの前に付し
た記号6⁴−、6⁵−、6⁶−などは、それぞれマルトオリゴ
糖を構成するグルコース単位の還元末端側から４番目、
５番目、６番目のグルコースの６位の水酸基が水素原子
に置換されていることを意味する。

前記一般式（Ｉ）で表わされる６−デオキシマルトオ
リゴシド誘導体において、還元末端グルコースの１位の
水酸基に置換されるＲは、芳香族発色性基であって、こ
のようなものとしては、例えば以下のものが挙げられ
る。

（R¹〜R⁵は水素原子、アルキル基、アリル基、アリール
基、アシル基、カルボキシル基、シアノ基、ホルミル
基、アルコキシ基、ニトロ基、ニトロソ基、アミノ基、
アジド基、スルホン酸基、スルホキシル基、スルホニル
基、又はハロゲン原子であり、それぞれ同一であっても
よいし、また異っていてもよく、またR¹とR²、又はR²と
R³が結合して、縮合芳香環を形成してもよい。ただし、
R¹〜R⁵は同時に水素原子ではない） （R⁶は水素原子又はアルキル基である） （R⁷は水素原子又はハロゲン原子である） （R⁸〜R¹⁵は水素原子、アルキル基、アリル基、アリー
ル基、アシル基、カルボキシル基、シアノ基、ホルミル
基、アルコキシ基、ニトロ基、ニトロソ基、アミノ基、
アジド基、スルホン酸基、スルホキシル基、スルホニル
基、又はハロゲン原子であり、それぞれ同一であっても
よいし、また異なっていてもよく、またR⁸とR⁹、及び／
又はR¹⁰とR¹¹が結合して、縮合芳香環を形成してもよ
く、さらにR⁹とR¹⁰、及び／又はR¹³とR¹⁴が共通の酸素
原子となって縮合エーテル環を形成してもよく、またＺ
は窒素原子又はＮ→０である） そして、前記一般式（Ｉ）で表わされる６−デオキシ
マルトオリゴシド誘導体はα−アノマー又はβ−アノマ
ーのいずれでもよい。

したがって、前記一般式（Ｉ）で表される化合物とし
ては、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵−デ
オキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェ
ニル−6⁵−デオキシ−α−Ｄ−マルトペンタオシド、フ
ェノールインド−３′−クロロフェニル−6⁵−デオキシ
−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル−
6⁷−デオキシ−β−Ｄ−マルトヘプタオシド、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−6⁷−デオキシ−β−Ｄ−マル
トヘプタオシド、メチルウンベリフェロニル−6⁵−デオ
キシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド、レザズリニル−6⁷
−デオキシ−β−Ｄ−マルトヘプタオシドなどが挙げら
れる。

本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる６−デオキシ
マルトオリゴシド誘導体は、いずれも文献未載の新規化
合物であって、例えば次に示す各種方法（Ａ〜Ｄ法）に
より製造することができる。

Ａ法：一般式 （式中のｎは４〜６の整数である） で表わされる６−デオキシシクロデキストリンに、ある
種のシクロデキストリナーゼを作用させることにより、
一般式 （式中のＸは、１個が水素原子で、他のｎ＋１個が水酸
基であり、ｎは４〜６の整数である） で表わされる種々の位置に６−デオキシグルコース残基
を有する６−デオキシマルトオリゴ糖の混合物を主成分
とする反応液を得る。

出発物質である、前記一般式（II）で表わされる６−
デオキシシクロデキストリンは、分岐体、修飾体などの
誘導体なども包含するシクロデキストリン骨格を有する
シクロデキストリン類、例えば市販のα−、β−、γ−
シクロデキストリン（グルコース重合度が各々6,7,8）
などから公知の方法で得ることができる。例えば、シク
ロデキストリンをピリジンなどの溶媒に溶解し、トシル
クロリドを７〜14倍モル添加して、15〜30℃で４〜６時
間反応させてトシル化し、必要に応じ常法により精製し
て６−トシルシクロデキストリンを得る。次いで、これ
をジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミ
ド（DMF）などの有機溶媒に溶解し、水素化ホウ素ナト
リウム（NaBH₄）などの還元剤を10〜30倍モル加えて、4
0〜60℃で10〜20時間反応させて還元し、必要に応じ、
常法により精製して６−デオキシシクロデキストリンを
得る〔例えば「カルボハイドレーツ・リサーチ（Carboh
yd.Res.）」、第18巻、第29〜37ページ（1971）参
照〕。

このようにして、出発物質として好適な、例えば６−
デオキシ−α−、６−デオキシ−β−、６−デオキシ−
γ−シクロデキストリンなどを得ることができる。中で
も酵素反応速度の点から、６−デオキシ−β−シクロデ
キストリンが特に好適である。

この方法において用いられるシクロデキストリナーゼ
は以下の理化学的性質（イ）〜（ト）により特定される
ものである（特願平１−146891号参照）。

（イ） 作 用： シクロデキストリンを開裂し、そのシクロデキストリ
ンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生成
させる作用を有する。

（ロ） 基質特異性： シクロデキストリンに対する水解速度又は親和性が、
多糖類あるいはシクロデキストリンと同じ重合度の直鎖
オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有する。

第１表及び第２表に、それぞれ気質特異性の具体例及
びシクロデキストリン類とマルトオリゴ糖についての反
応速度のパラメーターを示す。

（ハ） 至適pH及び安定pH範囲： β−シクロデキストリンを基質とした場合、pH8.0近
傍に至適pHを有し、かつ安定pH範囲が5.5〜9.5である。

第１図は、100mM濃度の酢酸緩衝液、リン酸緩衝液及
びホウ酸緩衝液それぞれ0.48ml、２％（w/v）濃度のβ
−シクロデキストリン溶液0.50ml及び酵素液0.02mlを混
合し〔基質のβ−シクロデキストリン濃度１％（w/
v）〕、40℃で１時間反応を行った場合におけるpHと相
対活性との関係を示すグラフである。この図において、
破線は酢酸緩衝液、実線はリン酸緩衝液、点線はホウ酸
緩衝液を用いた場合である。この第１図から、pH8.0近
傍に至適pHを有することが分る。

第２図は、100mM濃度の酢酸緩衝液、リン酸緩衝液及
びホウ酸緩衝液それぞれ0.20ml及び酵素液0.05mlを混合
し、各pHにおいて、25℃で24時間処理を行い、この処理
液0.10ml、100mM濃度のリン酸緩衝液（pH7.5）0.40ml及
び２％（w/v）濃度のβ−シクロデキストリン溶液0.50m
lを混合して、40℃で１時間反応を行った場合における
処理pHと相対活性との関係を示すグラフである。この図
において、破線は酢酸緩衝液、実線はリン酸緩衝液、点
線はホウ酸緩衝液を用いた場合である。この第２図か
ら、安定pH範囲は5.5〜9.5であることが分る。

（ニ） 作用適温： 40℃近傍に作用適温を有する。

第３図は、２％（w/v）濃度のβ−シクロデキストリ
ン溶液0.50ml、100mM濃度のリン酸緩衝液（pH7.5）0.48
ml及び酵素液0.02mlを混合し、各温度で10分間反応させ
た場合における温度と相対活性との関係を示すグラフで
ある。この第３図から、40℃近傍に作用適温を有するこ
とが分る。

（ホ） 失活性： 50℃以上の温度で15分間の処理により、ほぼ失活する
性質を有する。

第４図は、酵素を含有する100mM濃度のリン酸緩衝液
（pH7.5）0.05mlを各温度で15分間処理したのち、この
処理液0.02ml、100mM濃度のリン酸緩衝液（pH7.5）0.48
ml及び２％（w/v）濃度のβ−シクロデキストリン溶液
0.50mlを混合し、40℃で１時間反応させた場合における
処理温度と相対活性との関係を示すグラフである。この
第４図から、100mM濃度のリン酸緩衝液（pH7.5）中、15
分間処理で、45℃まで活性は安定であるが、50℃以上で
はほぼ失活することが分る。

（ヘ） 阻害及び活性化性： Hg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺及びFe²⁺などにより90％以上
阻害され、Ca²⁺及びMg²⁺により10〜30％活性化される性
質を有する。

第３表に、金属イオンによる酵素活性への影響を示
す。

この第３表から、二価の金属イオンであるHg²⁺、C
u²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺及びFe²⁺により90％以上阻害され、Ca
²⁺及びMg²⁺により10〜30％活性化されることが分る。

（ト） 分子量： ゲルろ過法による分子量が144,000で、SDS PAGE法に
よる分子量が72,000である。すなわち、該酵素は分子量
72,000のサブユニットから成る二量体である。

なお、該酵素の力価は、２％（w/v）濃度のβ−シク
ロデキストリン溶液500μ及び適当量の該酵素を含有
する100mM濃度のリン酸緩衝液（pH7.5）500μを混和
し、温度40℃で適当時間反応させたのち、10分間煮沸す
ることにより反応を停止し、高速液体クロマトグラフィ
ー（以下、HPLCと略称する）法によって、生成したマル
トヘプタオースを定量することにより求めた。また、酵
素量が少量の場合には、グルコースを標準としたソモギ
ーネルソン法により還元力を定量することにより求め
た。

該酵素の酵素単位については、１分間に１マイクロモ
ルのマルトヘプタオースを生成する酵素量を１単位とし
た。

次に、本発明で用いる前記シクロデキストリナーゼの
製造方法について説明する。この酵素を産生する微生物
については、バチルス属に属し、該酵素を産生するもの
であればよく、特に制限されず、例えばバチルス・スフ
ェリカス（Bacillus sphaericus）Ｅ−244菌株を挙げる
ことができる。このバチルス・スフェリカスＥ−244菌
株は土壌中から取得した野生株であって、以下に示す菌
学的性質を有している。

バチルス・スフェリカスＥ−244菌株の菌学的性質 （ａ） 形 態 （１） 細胞の形及び大きさ:0.6〜0.8×1.6〜4.0μｍ
の桿菌である。

（２） 細胞の多形成の有無：認められない。

（３） 運動性の有無：周鞭毛を有し、運動性あり。

（４） 胞子の有無：あり 胞子嚢：膨出 大きさ:0.8〜0.9×1.1〜1.2μｍ 形：楕円形 位置：亜端立 （５） グラム染色性：陽性 （６） 抗酸性：陰性 （ｂ） 各培地における生育状態 （１） 肉汁寒天平板培養： 無色の拡散性集落を形成し、その集落は平滑で周縁は
なめらかであり、色素の産生は認められない。

（２） 肉汁寒天斜面培養： 菌苔は平滑で周縁はなめらかであり、色素の産生は認
められない。

（３） 肉汁液体培養： 培地全体に生育が認められるが、沈殿は認められな
い。

（４） 肉汁ゼラチン穿刺培養： 培地上部にのみ生育し、液化は認められない。

（５） リトマス・ミルク： 凝固は認められず、酸、アルカリの産生も認められな
い。

（ｃ） 生理学的性質 （１） 硝酸塩の還元：還元しない （２） 脱窒反応：なし （３） MRテスト：陰性 （４） VPテスト：陰性 （５） インドールの生成：生成しない （６） 硫化水素の生成：生成しない （７） デンプンの加水分解：分解しない （８） クエン酸の利用：利用せず （９） 無機窒素源の利用：利用せず （10） 色素の生成：生成しない （11） ウレアーゼ：陰性 （12） オキシダーゼ：陽性 （13） カタラーゼ：陽性 （14） 生育の範囲 温度:13〜38℃ pH:6〜10.5 （15） 酸素に対する態様：好気性 （16） Ｏ−Ｆテスト：陰性（酸の産生を認めず） （17） 糖類に対する態度： Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクト
ース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソル
ビット、Ｄ−マンニット、イノシット、グリセリン及び
デンプンからの酸生成及びガス生成はいずれも認められ
ない。

（ｄ） フェニルアラニンの脱アミノ反応：陽性 このバチルス・スフェリカスＥ−244菌株は、胞子を
形成するグラム陽性桿菌であることからバチルス属に属
する細菌であると同定した。さらに、糖からの酸及びガ
スの生成は認められないこと、VPブロスのpHが7.0以上
であること及びフェニルアラニンの脱アミノ反応が認め
られることからバージェイズ・マニュアル・オブ・シス
ティマティック・バクテリオロジー、第２巻（1984年）
に基づき、バチルス属のスフェリカス種に属する細菌で
あると同定した。

なお、バチルス・スフェリカスＥ−244は、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第2458号（FERM B
P−2458）として寄託されている。

この菌株の培養は、原則的には一般微生物の好気的培
養で採用される方法と同じであるが、通常は、液体培地
による振とう培養法、又は通気かくはん培養法などが用
いられる。培地としては、適当な窒素源、炭素源、ビタ
ミン、ミネラルなど及び該酵素の誘導基質であるシクロ
デキストリンなどを含んだものが用いられる。pHは、前
記菌株が生育するpH域ならばいずれでもよいが、通常は
６〜８の範囲が好ましい。

培養は、通常20〜40℃の範囲の温度において、16時間
ないし４日間程度振とう培養又は通気かくはん培養する
ことによって行われる。

このようにして得られた培養物から所望の酵素を得る
には、例えばまず遠心分離や膜濃縮などにより集菌した
のち、菌体を超音波処理又は界面活性剤処理などにより
破砕し、菌残渣を遠心分離などで除いて粗酵素液を得、
次いでこの粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過などのカラムクロマ
トグラフィーを適宜組み合わせて実施することにより、
該酵素の精製品を得る方法を用いることができる。

このようにして得られた本発明に係るシクロデキスト
リナーゼと従来公知のシクロデストリナーゼとの理化学
的性質の相違点を第４表に示す。

次に、酵素反応の際の６−デオキシシクロデキストリ
ンの基質濃度としては、前記のシクロデキストリナーゼ
の基質に対するKm値以上の濃度を用いるのが好ましい。

前記のシクロデキストリナーゼを、６−デオキシシク
ロデキストリンに作用させる反応条件は、該シクロデキ
ストリナーゼの作用pH及び温度範囲の中で、適宜選択さ
れるが、通常pH7.0〜9.0で、温度35〜45℃の範囲が用い
られる。この際必要に応じて、エタノール、ジメチルス
ルホキシドなどの有機溶媒を用いることもできる。反応
時間は、反応生成物の安定性により異なるが、通常は30
分〜48時間程度である。酵素量としては特に制限がな
く、反応時間内に生成物が最大になるような必要量を添
加すればよいが、通常は６−デオキシシクロデキストリ
ンに対し、0.5〜５単位/gが用いられる。

このようにして前記したとおり一般式（III）で表わ
される各種６−デオキシオリゴ糖の混合物を得るが、出
発物質が６−デオキシ−β−シクロデキストリンの場合
には、6⁷−デオキシマルトヘプタオース、6⁶−デオキシ
マルトヘプタオース、6⁵−デオキシマルトヘプタオー
ス、6⁴−デオキシマルトヘプタオース、6³−デオキシマ
ルトヘプタオース、6²−デオキシマルトヘプタオース、
6¹−デオキシマルトヘプタオースの混合物を主成分とす
るものが、また、６−デオキシ−α−シクロデキストリ
ンの場合には、同様にして6⁶−デオキシマルトヘキサオ
ース、6⁵−デオキシマルトヘキサオース、6⁴−デオキシ
マルトヘキサオース、6³−デオキシマルトヘキサオー
ス、6²−デオキシマルトヘキサオース、6¹−デオキシマ
ルトヘキサオースの混合物を主成分とするものを得る。

次に、これにエキソ型糖化酵素類を作用させて６−デ
オキシグルコースの残基が非還元末端となるように、非
還元末端側のグルコース残基を加水分解させる。この際
のエキソ型糖化酵素類としては、例えば公知のα−グル
コシダーゼ、グルコアミラーゼなどを単独で用いてもよ
いし、それらを組み合わせて用いてもよい。なお、必要
に応じ、β−アミラーゼを作用させてもよい。

この酵素反応によって、一般式 （式中、ｎは２〜６の整数である） で表わされる各種６−デオキシ−マルトオリゴ糖（すな
わち、6⁴−デオキシマルトテトラオース、6⁵−デオキシ
マルトペンタオース、6⁶−デオキシマルトヘキサオー
ス、6⁷−デオキシマルトヘプタオース、6⁸−デオキシマ
ルトオクタオース）、6³−デオキシマルトトリオース、
6²−デオキシマルトース、6¹−デオキシグルコース及び
グルコースの混合物が得られる。

エキソ型糖化酵素類としてβ−アミラーゼを併用した
場合には、上記の化合部の他に６−デオキシマルトース
も生成する。このエキソ型糖化酵素類は、前記のシクロ
デキストリナーゼと共存させて酵素反応を同時的に行わ
せてもよいが、出発原料にシクロデキストリナーゼを作
用させた後で、さらに作用させるのが好ましい。特に好
ましいのは、出発原料にシクロデキストリナーゼを作用
させて、例えば生成物が最大になった際に、酸又は熱処
理などによりいったん反応を停止させ、さらに例えばオ
クタデシル化シリカゲル（ODS）カラムに通液して未反
応の原料を吸着除去するなどの精製処理を施したのち、
エキソ型糖化酵素類を作用させる方法である。シクロデ
キストリナーゼとエキソ型糖化酵素類を共存作用させる
場合の反応条件としては、両酵素に共通する作用pH、温
度範囲を適宜選択する必要があるが、通常pH7.0〜9.0、
35〜45℃で、0.5〜48時間の条件が用いられる。

また、前記のシクロデキストリナーゼの作用後、エキ
ソ型糖化酵素類を作用させる場合の反応条件としては、
用いる酵素の作用pH、温度範囲の中から適宜選択される
が、通常はpH4.0〜7.5、35〜45℃で、0.5〜48時間の条
件が用いられる。この際のエキソ型糖化酵素類の使用量
には特に制限はないが、通常６−デオキシシクロデキス
トリンに対し10〜100単位/gの範囲が用いられる。この
酵素反応は、例えば酸又は熱処理などによって停止され
る。

次に、このようにして得られた６−デオキシマルトオ
リゴ糖含有反応液から、目的化合物の前記一般式（Ｉ）
に表わされる６−デオキシマルトオリゴ糖を得るには、
通常のオリゴ糖分離方法、例えば、反応液から未反応の
６−デオキシシクロデキストリンを除き、さらに活性炭
カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマト
グラフィー、薄層クロマトグラフィーなどを用いて分画
採取する方法によって分離、精製する。また、未反応の
６−デオキシシクロデキストリンの除去は、例えば冷却
処理、有機溶媒添加処理、吸着カラム処理などの公知の
方法によって行うことができる。

このようにして得られた前記一般式（IV）で表される
６−デオキシマルトオリゴ糖の水酸基を公知の方法でア
セチル化すれば、一般式 （式中のｎは２〜６の整数である） で表わされるアセチル−６−デオキシマルトオリゴ糖、
例えば、ヘキサデカ−Ｏ−アセチル−6⁵−デオキシマル
トペンタオース、ノナデカ−Ｏ−アセチル−6⁶−デオキ
シマルトヘキサオース、ドコサ−Ｏ−アセチル−6⁷−デ
オキシマルトヘプタオースなどが得られる。

このアセチル化法としては、例えば６−デオキシマル
トオリゴ糖に、ピリジン、トリエチルアミンなどの有機
塩基の存在下で、無水酢酸又はハロゲン化アセチルなど
を100〜200倍モル加え、10〜40℃で10〜80時間反応させ
る方法を挙げることができる〔「ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）第72巻、第2
19ページ（1972）参照〕。

次に、このものの還元末端グルコースの１位を、公知
の方法でブロム化してアセチル−６−デオキシマルトオ
リゴシルブロミド（例えばα−ペンタデカ−Ｏ−アセチ
ル−6⁵−デオキシマルトペンタオシルブロミド、α−オ
クタデカ−Ｏ−アセチル−6⁶−デオキシマルトヘキサオ
シルブロミド、α−ヘンエイコサ−Ｏ−アセチル−6⁷−
デオキシマルトヘプタオシルブロミドなど）を得る。

このブロム化法としては、例えばアセチル−６−デオ
キシマルトオリゴ糖に、ジクロロメタンなどの非極性溶
媒中で、必要に応じて触媒量の水の存在下、三臭化リン
又は三臭化チタンなどを0.5〜３倍モル添加し、10〜40
℃で２〜50時間反応させる方法などが用いられる（例え
ば特開昭60−202893号公報参照）。

次いで、このものに公知の方法で前記芳香族発色性基
を有する芳香族化合物を作用させて還元末端グルコース
の１位をグルコシル化し、アセチル−６−デオキシマル
トオリゴシド誘導体を得る。この誘導体としては、例え
ば２−クロロ−４−ニトロフェニルペンタデカ−Ｏ−ア
セチル−6⁵−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド、
フェノールインド−３′−クロロフェニルペンタデカ−
Ｏ−アセチル−6⁵−デオキシβ−Ｄ−マルトペンタオシ
ド、４−ニトロフェニルヘンエイコサ−Ｏ−アセチル−
6⁷−デオキシ−β−Ｄ−マルトヘプタオシド、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニルヘンエイコサ−Ｏ−アセチル−
6⁷−デオキシ−β−Ｄ−マルトヘプタオシドなどが挙げ
られる。

このグルコシル化法としては、例えばアセチル−６−
デオキシマルトオリゴシルブロミドに、アセトニトリ
ル、ニトロメタンなどの非プロトン性溶媒中で、必要に
応じて酸化銀、炭酸銀などの銀化合物の存在下で、前記
芳香族化合物又はそのアルカリ金属塩を２〜10倍モル添
加し、20〜50℃で５〜50時間反応させる方法などが用い
られる（例えば特公昭62−283989号公報参照）。

次に、前記誘導体を、公知の方法で脱アセチル化して
前記一般式（Ｉ）で表わされる６−デオキシマルトオリ
ゴシド誘導体を得る。この脱アセチル化反応としては、
例えばアセチル−６−デオキシマルトオリゴシド誘導体
に、メタノールなどのアルコール類中で、アンモニア水
を100〜200倍モル添加し、20〜50℃で５〜50時間反応さ
せる方法などが用いられる〔「カナディアン・ジャーナ
ル・オブ・ケミストリー（Can.J.Chem.）」、第49巻、
第493ページ（1971）参照〕。

Ｂ法：一般式 （式中のＲは前記と同じ意味を有し、ｎは２〜６の整数
である） で表わされるマルトオリゴシド誘導体、例えば２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシ
ド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシ
ド、フェノールインドフェニル−β−Ｄ−マルトペンタ
オシドなどに、一般式 （式中のR¹⁶、R¹⁷は水素原子又は炭化水素基であり、そ
れらは互いに結合して環を形成してもよい） で表わされるカルボニル化合物又はそのアセタールを反
応させて、一般式 （式中のR¹⁶,R¹⁷,R及びｎは前記と同じ意味を有する） で表わされるアルキリデン−又はアリーリデン−マルト
オリゴシド誘導体、例えば２クロロ−４−ニトロフェニ
ル ベンジリデン−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−
ニトロフェニル イソプロピリデン−α−Ｄ−マルトヘ
プタオシド、フェノールインド−３′−クロロフェニル
エチリデン−β−Ｄ−マルトテトラオシドなどを得
る。

前記一般式（VI）で表わされるマルトオリゴシド誘導
体と、前記一般式（VII）で表わされるカルボニル化合
物又はそのアセタールとの反応は、例えばジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール
ジメチルエーテルなどの非プロトン性極性溶媒中におい
て、硫酸、塩化水素、ｐ−トルエンスルホン酸、無水塩
化亜鉛のような触媒の存在下で行う。このようにして得
られた前記一般式（VIII）で表わされるアルキリデン−
又はアリーリデン・マルトオリゴシド誘導体をアシル化
してアシルアルキリデン−又はアシルアリーリデン・マ
ルト オリゴシド誘導体、例えば２−クロロ−４−ニト
ロフェニル テトラデカ−Ｏ−アセチル−ベンジリデン
−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル
エイコサ−Ｏ−ベンゾイル−イソプロピリデン−α−Ｄ
−マルトヘプタオシド、フェノールインド−３′−クロ
ロフェニル ウンデカ−Ｏ−ブチリル−エチリデン−β
−Ｄ−マルトテトラオシドなどを得る。この際、アシル
化剤としては、例えば酢酸、モノクロロ酢酸、プロピオ
ン酸、α−クロロプロピオン酸、β−クロロプロピオン
酸、ｎ−酪酸、安息香酸などや、これらの酸無水物、酸
クロリド、エステルなどの反応性誘導体が用いられる。
アシル化反応の条件については特に制限はなく、従来ア
シル化において慣用されている条件を用いることができ
る。

次いで、このようにして得たアシルアルキルリデン−
又はアシルアリーリデン・マルトオリゴシド誘導体に、
脱アルキリデン化又は脱アリーリデン化反応を行い、一
般式 （式中のR¹⁸はアシル基であり、Ｒ及びｎは前記と同じ
意味を有する） で表わされる部分アシル化マルトオリゴシド誘導体、例
えば２−クロロ−４−ニトロフェニル−Ｏ−（2,3−ジ
−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→
４）−トリス〔Ｏ−（2,3,6−トリ−Ｏ−アセチル−α
−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）〕−2,3,6−ト
リ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、４−ニ
トロフェニル−Ｏ−（2,3−ジ−Ｏ−ベンゾイル−α−
Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−ペンタキス〔Ｏ
−（2,3,6−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）〕−2,3,6−トリ−Ｏ−ベンゾ
イル−α−Ｄ−グルコピラノシドなどを得る。

上記の脱アルキリデン化反応又は脱アリーリデン化反
応の条件については特に制限はなく、公知の方法、例え
ば酢酸又はギ酸を作用させる方法〔例えば「ジャーナル
・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（J.A
m.Chem.Soc.）」、第84巻、第430ページ（1962）参照〕
を用いて行うことができる。

次に、このようにして得た前記一般式（IX）で表わさ
れる部分アシル化マルトオリゴシド誘導体に、一般式 （式中、R¹⁹〜R²³は水素原子、アルキル基、ニトロ基又
はハロゲン原子を示し、それらはそれぞれ同一であって
も良いし、また互いに異なっていてもよく、またR¹⁹とR
²⁰又はR²⁰とR²¹が互いに結合して縮合芳香環を形成して
もよい。またＹはハロゲン原子を示す） で表わされるアリールスルホニルハライドを反応させて
前記一般式（IX）における非還元末端グルコースの６位
の水酸基をアリールスルオン化してアシルアリールスル
ホニル−マルトオリゴ糖、例えば２−クロロ−４−ニト
ロフェニル テトラデカ−Ｏ−アセチル−6⁵−デオキシ
−ｐ−トルエンスルホニル−β−Ｄ−マルトペンタオシ
ド、４−ニトロフェニル エイコサ−Ｏ−ベンゾイル−
6⁷−デオキシ−β−ナフタレンスルホニル−α−Ｄ−マ
ルトヘプタオシド、フェノールインド−３′−フルオロ
フェニル ウンデカ−Ｏ−ブチリル−6⁴−デオキシ−2,
4,6−トリメチルベンゼンスルホニル−β−Ｄ−マルト
テトラオシドなどを得る。

前記一般式（Ｘ）で表わされるアリールスルホニルハ
ライドとしては、例えばｐ−トルエンスルホニルクロリ
ド、β−ナフタレンスルホニルクロリド、2,4−ジニト
ロベンゼンスルホニルブロミド、2,4,6−トリメチルベ
ンゼンスルホニルクロリドなどが挙げられる。このアリ
ールスルホニル化反応の条件について特に制限はない
が、通常ピリジン中室温下でアリールスルホニルハライ
ドを２〜20倍モル作用させることによって行われる。次
いで、上記アシルアリールスルホニルマルトオリゴ糖を
還元的に脱アリールスルホン化して前記一般式（IX）に
おける非還元末端グルコースの６位の水酸基が水素原子
で置換された部分アシル化６−デオキシマルトオリゴシ
ド誘導体、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル テ
トラデカ−Ｏ−アセチル−6⁵−デオキシ−β−Ｄ−マル
トペンタオシド、４−ニトロフェニル エイコサ−Ｏ−
ベンゾイル−6⁷−デオキシ−α−Ｄ−マルトヘプタオシ
ド、フェノールインド−３′−クロロフェニル ウンデ
カ−Ｏ−ブチリル−6⁴−デオキシ−β−Ｄ−マルトテト
ラオシドなどを得る。

この還元的脱スルホニル化反応の条件については特に
制限はないが、通常ジメチルスルホキシド、ジメチルホ
ルムアミドなどの非プロトン性極性溶媒中で、40〜60℃
の温度でNaBH₄又はNaBH₃CN等を20〜100倍モルの割合で
作用させて行う。

最後に、上記部分アシル化６−デオキシマルトオリゴ
シド誘導体を脱アシル化して、前記一般式（Ｉ）で表わ
される目的化合物６−デオキシマルトオリゴシド誘導体
を得る。

この脱アシル化反応の条件についても特に制限はない
が、例えば前記Ａ法における脱アセチル化反応がそのま
ま用いられる。

Ｃ法：一般式 （式中のＲは前記と同じ意味を有する） で表わされる公知のアリールグルコシド誘導体に、前記
一般式（II）で表わされる６−デオキシシクロデキスト
リンを加え、公知の酵素シクロデキストリングルコシル
トランスフェラーゼを作用させて、一般式 （式中のＸは１個が水素原子で、ｎ個が水酸基であり、
Ｒ及びｎは前記と同じ意味を有する） で表わされる６−デオキシマルトオリゴシド誘導体の混
合物を得、次いでこれに前記エキソ型糖化酵素類を作用
させることにより、前記一般式（Ｉ）で表わされる目的
とする６−デオキシマルトオリゴシド誘導体を得る。

前記一般式（XI）で表わされるアリールグルコシド誘
導体としては、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル
−β−Ｄ−グルコシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−
グルコシド、フェノールインド−３′,5′−ジクロロフ
ェニル−β−Ｄ−グルコシドなどが挙げられる。

この反応は、水溶液中で緩衝剤の存在下で行われる。
この際の前記一般式（VIII）で表わされる化合物の濃度
は、通常0.01〜1g/ml、好ましくは0.02〜0.2g/mlの範囲
で選ばれ、一方、６−デオキシシクロデキストリン類の
濃度は、通常１〜200mg/ml、好ましくは100〜200mg/ml
の範囲で選ばれる。また、シクロデキストリングルコシ
ルトランスフェラーゼの起源については特に制限はない
が、例えばバチルス・マセランス、バチルス・メガテリ
ウム、バチルス・サーキュランスなどから得られたもの
が好ましい。その濃度は、通常0.3〜３単位/ml、好まし
くは0.5〜1.5単位/mlの範囲で選ばれる。

Ｄ法： 前記一般式（XI）で表わされる公知のアリールグルコ
シド誘導体と前記一般式（IV）（ただし、式中のｎは１
〜３の整数を示す）で表わされる６−デオキシ−マルト
オリゴ等とを混合し、これに公知酵素マルトテトラオー
ス生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ
などを目的化合物との関連で適宜選択して作用させて転
移反応を行わせることにより、目的とする６−デオキシ
マルトオリゴシド誘導体を得ることができる。

これらの転移反応の条件については特に制限はない
が、それぞれのマルトオリゴ糖生成酵素に適した温度、
濃度、液性、反応時間を選択することにより適確な反応
条件を得ることができる。

以上のように各種製法により得られた前記一般式
（Ｉ）で表わされる６−デオキシマルトオリゴシド誘導
体は、α−アミラーゼ活性の測定に極めて有用であり、
この６−デオキシマルトオリゴシド誘導体を用いてα−
アミラーゼ活性を測定することができる。

前記したように、一般式（Ｉ）で表される６−デオキ
シマルトオリゴシド誘導体には、α−アノマーとβ−ア
ノマーが存在するが、α−アミラーゼ活性の測定に際し
て、α−アノマーのみを用いる場合には、共役酵素系と
してα−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼを
用いることが必要であり、またβ−アノマーのみあるい
はα−アノマーとβ−アノマーの混合物を用いる場合に
はα−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼに加
えてさらにβ−グルコシダーゼを併用することが必要で
ある。

α−アミラーゼ活性を測定するための有利な系として
は、例えば一般式（Ｉ）で表わされるα−及び／又はβ
−６−デオキシマルトオリゴシド誘導体１〜20mM及び緩
衝剤２〜100mMを含有し、かつ共役酵素としてα−グル
コシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼをそれぞれ15〜
150単位/ml、該誘導体がβ−アノマーを含むときは、さ
らにβ−グルコシダーゼ５〜50単位/mlとを含有するpH4
〜10の系が挙げられる。この系に用いられる緩衝剤とし
ては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス−（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタン、ホウ酸塩、クエン酸
塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げられる。α−グル
コシダーゼは動物、植物、微生物などいかなる起源のも
のを用いてもよいが、特に酵母起源のものが基質特異性
の点から好ましい。また、グルコアミラーゼもいかなる
起源のものを用いてもよいが、例えばリゾプス属sp.（R
hizopus sp.）などに由来するものが好適である。ま
た、β−グルコシダーゼもいかなる起源のものを用いて
もよく、例えばアーモンドの種子から得たものが用いら
れる。

本発明においては、このような系に、前記成分以外
に、本発明の目的をそこなわない範囲で、さらに必要に
応じて慣用の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定
化剤としてグリセリン、牛血清アルブミン、α−又はβ
−シクロデキストリン、トリトンX100などを加えてもよ
い。さらに、α−アミラーゼ活性剤として、NaCl、MgCl
₂、MgSO₄、CaCl₂、CaCl₂・2H₂Oなどの形で用いられるCl
^-イオン、Ca²⁺イオン、Mg²⁺イオンなどを加えてもよ
い。これらの添加成分は１種用いてもよいし、２種以上
を組み合わせて用いてもよく、また、前記系調製の適当
な段階で加えてもよい。

本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した形で用いて
もよいし、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙な
どに含浸させて用いてもよい。このような本発明の試薬
を用いることにより、各種の試料に含有されるα−アミ
ラーゼ活性を簡単な操作で正確に、かつ高感度で測定す
ることができる。

次に、本発明のα−アミラーゼ活性の測定方法の好適
な１例について説明すると、先ず、α−アミラーゼを含
む試料に、共役酵素としてのα−グルコシダーゼ及び／
又はグルコアミラーゼをそれぞれ15〜150単位/ml、好ま
しくは30〜70単位/ml加え、前記一般式（Ｉ）で表わさ
れる６−デオキシマルトオリゴシド誘導体がβ−アノマ
ーを含む場合は、さらにβ−グルコシダーゼを５〜50単
位/ml、好ましくは５〜15単位/ml加え、同時又は順次に
該誘導体１〜20mM、好ましくは２〜6mM及び緩衝剤を添
加したのち、温度25〜50℃、pH4〜10の条件にて１分間
以上、好ましくは２〜60分間酵素反応させ、次いで生成
する芳香族発色性化合物を常法によりそのままあるいは
必要によりpHを変化させたのち、又は縮合反応を行った
のちに、適当な吸光波長で連続的もしくは断続的に吸光
度値を測定し、あらかじめ測定したα−アミラーゼ標品
の吸光度値と対比させて試料中のα−アミラーゼ活性を
算出する。

本発明に用いられるα−アミラーゼ含有試料について
は、α−アミラーゼを含有するものであればよく、特に
制限はないが、具体的には微生物の培養液、植物の抽出
液、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽出液など
を用いることができる。α−アミラーゼ含有試料が固体
の場合には、いったん緩衝液に溶解又は懸濁させるのが
よい。この緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、
炭酸塩、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン、ホウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタン酸塩など
が挙げられる。

発明の効果 本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる６−デオキシ
マルトオリゴシド誘導体は、新規な化合物であって、α
−アミラーゼ活性測定用試薬として極めて有用であり、
このものを用いることにより、試料中に含まれるグルコ
ース、マルトース、ビリルビン、ヘモグロビンなどの影
響を受けることなく、α−アミラーゼ活性を自動分析
法、用手法などにより、精度よく短時間で容易に測定す
ることができる上に、共役酵素を共存させても長期間に
わたって安定状態を維持しうるという利点がある。

実施例 次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵−デオ
キシ−β−Ｄ−マルトペンタオシドの製造 （１） ６−トシル−β−シクロデキストリンの合成 市販のβ−シクロデキストリン〔和光純薬工業（株）
製〕5.00g（4.41mmol）をピリジン50mlに溶解したの
ち、これにトシルクロリド10.0g（52.4mmol）を加え、
室温で５時間かきまぜながら反応させた。ついでこの反
応液のピリジンを減圧下に留去させたのち、残渣に水10
0ml及びベンゼン150mlをかきまぜながら添加し、固形物
を析出させた。

次に、この固形物をグラスフィルターでろ別し、アセ
トン50mlで２回洗浄したのち、ろ取物をODSカラムクロ
マトグラフィーにより精製し、エタノール−水混合液
（容量比1:9）で溶出した目的画分を濃縮して、水から
再結晶することにより、６−トシル−β−シクロデキス
トリン1.63g（1.26mmol、収率28.6％）が得られた。

このものの融点、赤外吸収スペクトル及び核磁気共鳴
スペクトルを次に示す。

融点（℃）:172.0〜174.0（分解） 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3400,2930,1642,1632,160
0,1424,1360,1300,1178,1156,1078,1028 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm:（DMSO−d₆）2.44
（3H,s）,3.15〜4.45（ｍ）,4.76（2H,br,s）,4.85（5
H,br,s）,7.44（1H,d,J＝8.8Hz）,7.75（1H,d,J＝8.8H
z） （２） ６−デオキシ−β−シクロデキストリンの合成 次に、このようにして得られた前記６−トシル−β−
シクロデキストリン1.27g（0.985mmol）をジメチルスル
ホキシド（DMSO）20mlに溶解したのち、これに水素化ホ
ウ素ナトリウム（NaBH₄）384mg（10.2mmol）を加え、50
℃で12時間反応させた。次いで、この反応液に水1000ml
を加え、DOSカラムクロマトグラフィーに供してDMSOを
除去したのち精製し、エタノール−水混和液（容量比1:
9）で溶出した目的画分を濃縮して、メタノールから再
結晶することにより、６−デオキシ−β−シクロデキス
トリン839.6mg（0.750mmol、収率76.1％）が得られた。

このものの融点、赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴ス
ペクトル及び元素分析値を次に示す。

融点（℃）:280.0〜281.0（分解） 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3370,2920,1152,1080,102
0 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（DMSO−d₆）:1.20
（3H,d,J＝6.1Hz）,2.80〜4.05（ｍ）,4.84（7H,br,s） 元素分析値:C₄₂H₇₀O₃₄として Ｃ Ｈ 理論値（％） 45.08 6.31 実測値（％） 44.99 6.45 （３） シクロデキストリナーゼの調製 １％（w/v）β−シクロデキストリン、１％（w/v）ペ
プトン、0.5％（w/v）NaCl及び0.1％（w/v）イーストエ
キスから成る液体培地（水道水使用、pH7.0）100mlを50
0ml容坂口フラスコにいれ、120℃で20分間殺菌処理を行
った。これに、バチルス・スフェリカスＥ−244菌株（F
ERM BP−2458）の保存スラントより１白金耳接種し、30
℃で１日間振とう培養した。この培養液50mlを前記と同
様の培地組成と殺菌条件により調製した。2000mlの培地
を含有する3000ml容ミニジャーに接種して30℃、1vvm、
350r.p.mの条件で２日間通気かくはん培養を行い、培養
後、この培養液から8000r.p.m、20分間の遠心分離法処
理により菌体を分離し、２％（w/v）トリトンＸ−100を
含有する10mMリン酸緩衝液（pH7.0）500mlに菌体を懸濁
して25℃で１日間かきまぜた。該懸濁液から12000r.p.m
で20分間の遠心分離処理により菌体残渣を除去したの
ち、上清液を10mMリン酸緩衝液（pH7.0）に対して16時
間透析した。得られた透析物を12000r.p.mで20分間遠心
分離処理して不溶物を除去し、上清を粗酵素液（１）と
した。

次いで、この粗酵素液（１）を約500ml（総活性200単
位、タンパク量2083mg、比活性0.1、pH7.0）を10mMリン
酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したDEAEセファロース充填
カラム（φ34×170mm）に供し、酵素を吸着させたの
ち、０〜0.5M NaClグラジエント勾配により溶出を行っ
た。このDEAEセファロースカラムクロマトグラフィーの
溶出パターンを第５図に示す。第５図において、◎印は
活性（U/ml）、○印はタンパク量（mg/ml）である。ま
た、この際の溶出条件は次のとおりである 溶出条件 溶離液:10mMリン酸緩衝液（pH7.0） 溶 出:0M−0.5M NaCl 分取量:12ml/フラクション 流 速:6ml/min 温 度：室温 このようにして得られた活性フラクションを集めて粗
酵素液（２）105ml（総活性145単位、比活性0.58、収率
72.5％）を得た。

次いでこの粗酵素液（２）20ml（総活性31単位、タン
パク量29mg）を1M硫酸ナトリウム含有100mMリン酸緩衝
液（pH7.0）で平衡化したエーテル5PW充填カラム（φ2
1.5×150mm）に供し、酵素を吸着させたのち、1M−0M硫
酸ナトリウムのグラジエントの勾配により溶出を行っ
た。この溶出パターンを第６図に示す。第６図におい
て、◎印は活性（U/ml）、○印はタンパク量（mg/ml）
である。また、この際の溶出条件は次のとおりである。

溶出条件 溶離液:100mMリン酸緩衝液（pH7.0） 溶 出:1M−0M Na₂SO₄（1hr） 分取量:5ml/フラクション 流 速:5ml/min 圧 力:35〜50kg/cm² 温 度：室温 このようにして得られた活性フラクションを集めて粗
酵素液（３）50ml（総活性72単位、比活性2.93、収率36
％）を得た。

次いでこの粗酵素液（３）をコロジオンバックにより
1.5mlにまで限外濃縮したのち、0.2ml（総活性８単位、
タンパク量1.2mg）をTSK gel G3000SW（カラムφ7.5×6
50mm×２）を用いたゲルろ過に供し、0.2M NaCl含有100
mMリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出した。この溶出パター
ンを第７図に示す。第７図において、◎印は活性（U/m
l）、○印はタンパク量（mg/ml）である。また、この際
の溶出条件は次のとおりである。

溶離液:100mMリン酸緩衝液（pH7.0）＋0.2M NaCl 分取量:1ml/フラクション 流 速:0.7ml/min 圧 力：約70kg/cm² 温 度：室温 このようにして得られた活性フラクションを集めて精
製酵素液1.4ml（総活性2.2単位、タンパク量0.24mg、比
活性9.17、収率１％）を得た。第８図に、この酵素のSD
S PAGEの結果を示す。この図から分るように、該酵素は
SDS PAGE的に単一であった。

（４） 6⁵−デオキシ−Ｄ−マルトペンタオースの製造 前記（２）と同様にして得た６−デオキシ−β−シク
ロデキストリン15gを100mMリン酸緩衝液（pH7.0）1000m
lに溶解したのち、前記（３）で得た粗酵素液を約24単
位添加して、40℃で48時間酵素反応を行わせ、反応液を
得た。

この反応液に塩酸を添加してpHを約2.0にすることに
より反応を停止させたのち、水酸化ナトリウム溶液を加
えて中和し、次いで、これをODSカラムに通液して、未
反応の６−デオキシ−β−シクロデキストリンを吸着さ
せ、通液画分を得た。この操作を４回繰り返して、合計
63gの６−デオキシ−β−シクロデキストリンを処理し
た。

この通液画分を1/10の液量の100mM酢酸緩衝液（pH4.
5）と混合したのち、さらに100mM酢酸によりpHを4.5に
調整した。次いで、これにグルコアミラーゼ2500単位を
添加して40℃で８時間酵素反応を行わせたのち、この反
応液に塩酸を添加してpHを約2.0にすることにより反応
を停止させ、次いで水酸化ナトリウム溶液を加えて中和
した。

次に、この液を活性炭カラムに通液したのち、０〜35
％のエタノールグラジエントにより６−デオキシマルト
オリゴ糖を溶出させ、次いで約25％のエタノール溶出画
分を凍結乾燥して、純度約98％の6⁵−デオキシ−Ｄ−マ
ルトペンタオース約2.5gを得た。

このものの赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクト
ル、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。

赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3420,2925,1628,1412,136
8,1150,1080,1040 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（D₂O）:1.27（3H,
d,J＝6.3Hz）,3.16（1H,t,J＝9.0Hz）,3.29（1H,t,J＝
9.0Hz）,3.50〜4.10（ｍ）,4.65（0.5H,d,J＝8.1Hz,α
−Ｈ）,5.23（0.5H,d,J＝3.4Hz,β−Ｈ）,5.27（1H,d,J
＝3.2Hz）,5.35（3H,d,J＝3.9Hz） 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー（株）製〕TSK ge
l Amide−80カラム（4.6mmID×250mm）、RI検出、溶離
液：アセトニトリル／水＝3/2（V/V），流速:1.0ml/mi
n〕:^tR＝8.7min 元素分析値:C₃₀H₅₂O₂₅として Ｃ Ｈ 理論値（％） 44.34 6.45 実測値（％） 44.45 6.45 （５） ヘキサデカ−Ｏ−アセチル−6⁵−デオキシマル
トペンタオースの合成 （４）で得た6⁵−デオキシマルトペンタオース821mg
（1.01mmol）をピリジン30mlに溶解し、無水酢酸15ml
（0.159mol）を加え、室温で２日間反応させる。次いで
反応液のピリジン、無水酢酸、酢酸を留去したのち、残
査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製
し、メタノール−ジクロロメタン混液（容量比1.5:98.
5）で溶出した目的区分を濃縮してヘキサデカ−Ｏ−ア
セチル−6⁵−デオキシマルトペンタオース（α体：β体
＝約1:1）1.369g（0.923mM、収率92.3％）を得た。

赤外線吸収スペクトル（cm^-1）:3480,2970,1754,1372,1
236,1038,946,898 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（CDCl₃）:1.15（3
H,d,J＝6.1Hz）,1.75〜2.25（48H,each s）,3.70〜5.10
（ｍ）,5.76（ca.0.5H,d,J＝8.1Hz,α−Ｈ）,6.24（ca.
0.5H,d,J＝3.5Hz,β−Ｈ） 高速液体クロマトグラフィー〔半井化学薬品（株）製CO
SMOSILC₁₈カラム（4.6mmID×150mm）、RI検出、溶離
液：アセトニトリル／水＝3/2（V/V），流速:1.0ml/mi
n〕:^tR＝9.4min （６）α−ペンタデカ−Ｏ−アセチル−6⁵−デオキシマ
ルトペンタオシルブロミドの合成 （５）で得たヘキサデカ−Ｏ−アセチル−6⁵−デオキ
シマルトペンタオース1.32g（0.889mmol）をジクロロメ
タン10mlに溶解し、三臭化リン84.5μ（0.892mmol）
と水35.2μ（1.96mmol）を加え、室温で22時間かきま
ぜながら反応させた。次いで反応液に無水炭酸カリウム
860mgを加え、室温で15分間かきまぜながら反応させ
た。不溶物をグラスフィルターでろ別し、これをジクロ
ロメタン20mlで３回洗い、ろ液と洗液を合わせたのち、
ジクロロメタンを留去した。次いで残査をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにより精製し、ジクロロメタン
−酢酸エチル混液（容量比7:3）で溶出した目的区分を
濃縮し、ジエチルエーテルから再結晶してα−ペンタデ
カ−Ｏ−アセチル−6⁵−デオキシマルトペンタオシルブ
ロミド604mg（0.401mmol、収率45.1％）を得た。

融点（℃）:118.0〜120.0 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:1756,1372,1240,1042,94
6,902 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（CDCl₃）:1.15（3
H,d,J＝6.4Hz）,1.85〜2.40（45H,each s）,3.70〜5.70
（ｍ）,6.51（1H,d,J＝3.9Hz） （７）２−クロロ−４−ニトロフェニル ペンタデカ−
Ｏ−アセチル−6⁵−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオ
シドの合成 （６）で得たα−ペンタデカ−Ｏ−アセチル−6⁵−デ
オキシマルトペンタオシルブロミド574mg（0.381mmol）
をアセトニトリル10mlに溶解し、２−クロロ−４−ニト
ロフェノール199mg（1.14mmol）を加えたのち、さらに
酸化銀（Ag₂O）266mg（1.14mmol）を加え、35℃で17時
間かきまぜながら反応させた。次いで反応液をグラスフ
イルターでろ過し、これをジクロロメタン20mlで３回洗
い、ろ液と洗液を合わせて減圧下濃縮し、アセトニトリ
ルとジクロロメタンを留去した。次いで残査にジクロロ
メタン100mlを加え、綿栓ろ過したのち、0.5N水酸化ナ
トリウム水溶液50mlで１回、飽和食塩水各々50mlで３回
洗い、次いで無水硫酸ナトリウム5gを加えて乾燥し、綿
栓ろ過したのち、減圧下濃縮し、ジクロロメタンを留去
した。次いで残査をシリカゲルカラムクロトグラフィー
により精製し、ジクロロメタン−メタノール混液（容量
比98.5:1.5）で溶出した目的区分を濃縮し、ジエチルエ
ーテルから再結晶して２−クロロ−４−ニトロフェニル
ペンタデカ−Ｏ−アセチル−6⁵−デオキシ−β−Ｄ−
マルトペンタオシド494mg（0.309mmol、収率81.0％）を
得た。

融点（℃）:126.0〜128.0 紫外部・可視部吸収スペクトル： 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3470,2960,1754,1530,137
2,1350,1234,1038,946,898 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（CDCl₃）:1.15（3
H,d,J＝6.1Hz）,1.90〜2.30（45H,each s）,3.70〜5.50
（ｍ）,7.29（1H,d,J＝9.0Hz）,8.16（1H,dd,J＝9.0Hz,
2.7Hz）,8.30（1H,d,J＝2.7Hz） 高速液体クロマトグラフィー〔半井化学薬品社製COSMOS
ILC₁₈カラム（4.6mmID×150mm）,UV_280nm検出，溶離
液：アセトニトリル／水＝7/3（V/V），流速:1.0ml/mi
n］:^tR＝9.1min比旋光度（▲［α］²⁵ _D▼）：（c 0.50,
1.4−ジオキサン）：−1.5×10²⁰ （８）２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵−デオキシ
−β−Ｄ−マルトペンタオシドの合成 （７）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル ペン
タデカ−Ｏ−アセチル−6⁵−デオキシ−β−Ｄ−マルト
ペンタオシド460mg（0.288mmol）をメタノール16mlに溶
解し、28％アンモニア水8mlと水4mlを加え、35℃で20時
間かきまぜながら反応させた。次いで反応液を減圧下濃
縮し、水とメタノールを留去した。次いで残査をODSゲ
ルカラムクロマトグラフィーにより精製し、エタノール
−水混液（容量比1:4）で溶出した目的区分を濃縮し、
水から再結晶して２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵
−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド196mg（0.203
mmol,収率68.3％）を得た。

融点（℃）:187.5〜190.5 紫外部・可視部吸収スペクトル： 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3430,2940,1644,1588,152
2,1488,1352,1276,1252,1154,1082,1046,1026 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（D₂O）:1.28（3H,
d,J＝5.9Hz）,3.14（1H,t,J＝8.6Hz）,3.50〜4.00
（ｍ）,5.28（1H,d,J＝3.4Hz）,5.35（3H,m）,5.43（1
H,d,J＝6.8Hz）,7.40（1H,d,J＝9.2Hz）,8.22（1H,dd,J
＝9.2Hz,2.7Hz）,8.40（1H,d,J＝2.7Hz） 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製TSK gel
Amide−80カラム（4.6mm ID×250mm）,UV_280nm検出，溶
離液：アセトニトリル／水＝3/1（V/V），流速:1.0ml/m
in］:^tR＝9.2min 元素分析値:C₃₆H₅₄ClNO₂₇として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） 44.66 5.62 1.45 実測値（％） 44.59 5.70 1.44 比旋光度（▲［α］²⁵ _D▼）：（c 0.37,H₂O）：＋0.95
゜×10²⁰ 実施例２ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁷−デオ
キシ−β−Ｄ−マルトヘプタオシドの製造 （１）6⁷−デオキシマルトヘプタオースの合成 エタノールグラジエントによる約29％のエタノール溶
出画分を採取したこと以外は実施例１の（１）〜（４）
と同様の操作を行い、純度99.5％の6⁷−デオキシマルト
ヘプタオース約2.7gを得た。

赤外線吸収スペクトル（cm^-1）:3420,2930,1628,1412,1
364,1150,1078,1022 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（D₂O）:1.25（3H,
d,J＝6.4Hz）,3.16（1H,t,J＝8.7Hz）,3.27（1H,t,J＝
8.7Hz）,3.45〜4.10（ｍ）,4.64（0.5H,d,J＝8.0Hz,α
−Ｈ）,5.20（0.5H,d,J＝3.5Hz,β−Ｈ）,5.26（1H,d,J
＝3.1Hz）,5.35（5H,d,J＝3.9Hz） 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製TSK gel
Amide−80カラム（4.6mm ID×250mm）,RI検出，溶離
液：アセトニトリル／水＝3/2（V/V），流速:1.0ml/mi
n］:^tR＝12.1min 元素分析値:C₄₂H₇₂O₃₅として Ｃ Ｈ 理論値（％） 44.37 6.38 実測値（％） 44.40 6.35 （２）ドコサ−Ｏ−アセチル−6⁷−デオキシマルトヘプ
タオースの合成 （１）で得た6⁷−デオキシマルトヘプタオース1140mg
（1.0mmol）、実施例１の（５）と同様の操作を行って
ドコサ−Ｏ−アセチル−6⁷−デオキシマルトヘプタオー
ス（α体：β体＝約1:1）1208mg（0.586mmol,収率58.6
％）を得た。

赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3490,2970,1754,1430,137
4,1238,1136,1038,946,898 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（CDCl₃）:1.15（3
H,d,J＝6.1Hz）,1.80〜2.40（66h,each s）,3.70〜5.55
（ｍ）,5.75（ca.0.5H,d,J＝8.0Hz,α−Ｈ）,6.24（ca.
0.5H,d,J＝3.2Hz,β−Ｈ） 高速液体クロマトグラフィー［半井化学薬品社製COSMOS
ILC₁₈カラム（4.6mm ID×150mm）,RI検出，溶離液：ア
セトニトリル／水＝7/3（V/V），流速:1.0ml/min］:^tR
＝5.4min （３）α−ヘンエイコサ−Ｏ−アセチル−6⁷−デオキシ
マルトヘプタオシルブロミドの合成 （２）で得たドコサ−Ｏ−アセチル−6⁷−デオキシマ
ルトヘプタオース1177mg（0.57mmol）に、実施例１の
（６）と同様の操作を行ってα−ヘンエイコサ−Ｏ−ア
セチル−6⁷−デオキシマルトヘプタオシルブロマイド40
1mg（0.193mmol,収率33.8％）を得た。

融点（℃）:120.0〜121.5 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3510,2990,1756,1432,137
2,1240,1042,948,898 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（CDCl₃）:1.15（3
H,d,J＝5.9Hz）,1.90〜2.30（63H,each s）,3.70〜5.70
（ｍ）,6.50（1H,d,J＝3.9Hz） 高速液体クロマトグラフィー［半井化学薬品社製COSMOS
ILC₁₈カラム（4.6mm ID×150mm）,RI検出，溶離液：ア
セトニトリル／水＝7/3（V/V），流速:1.0ml/min］:^tR
＝6.5min （４）２−クロロ−４−ニトロフェニル ヘンエイコサ
−Ｏ−アセチル−6⁷−デオキシ−β−Ｄ−マルトヘプタ
オシドの合成 実施例２の（３）で得たα−ヘンエイコサ−Ｏ−アセ
チル−6⁷−デオキシマルトヘプタオシルブロマイド401m
g（0.193mmol）に、実施例１の（７）と同様の操作を行
い、メタノールから再結晶して２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−ヘンエイコサ−Ｏ−アセチル−6⁷−デオキシ
−β−Ｄ−マルトヘプタオシド365mg（0.168mmol,収率8
7.0％）を得た。

融点（℃）:125.0〜127.0 紫外部・可視部吸収スペクトル： 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3470,2950,1746,1582,152
6,1482,1426,1368,1346,1230,1032 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（CDCl₃）:1.15（3
H,d,J＝6.1Hz）,1.98〜2.20（63H,each s）,3.70〜5.50
（ｍ）,7.28（（1H,d,J＝9.0Hz）,7.16（1H,dd,J＝9.0H
z,2.7Hz）,8.29（1H,d,J＝2.7Hz） 高速液体クロマトグラフィー［半井化学薬品社製COSMOS
ILC₁₈カラム（4.6mm ID×150mm）,UV_280nm検出，溶離
液：アセトニトリル／水＝7/3（V/V），流速:1.0ml/mi
n］:^tR＝14.2min 比旋光度（▲［α］²⁵ _D▼）：（c 0.51,1,4−ジオキサ
ン）：＋1.2×10²⁰ （５）２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁷−デオキシ
−β−Ｄ−マルトヘプタオシドの合成 実施例２の（４）で得た２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル ヘンエイコサ−Ｏ−アセチル−6⁷−デオキシ−β
−Ｄ−マルトヘプタオシド336mg（0.155mmol）に、実施
例１の（８）と同様の操作を行って２−クロロ−４−ニ
トロフェニル−6⁷−デオキシ−β−Ｄ−マルトヘプタオ
シド148mg（0.115mmol,収率74.1％）を得た。

融点（℃）:209.0〜210.0（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル： 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3400,2930,1634,1584,151
8,1484,1348,1276,1254,1154,1080,1042,1024 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（D₂O）:1.27（3H,
d,J＝5.9Hz）,3.15（1H,t,J＝8.5Hz）,3.55〜4.10
（ｍ）,5.30（1H,brs）,5.38（5H,brs）,5.43（1H,d,J
＝6.8Hz）,7.39（1H,d,J＝9.0Hz）,8.22（1H,dd,J＝9.0
Hz,2.5Hz）,8.39（1H,d,J＝2.5Hz） 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製TSK gel
Amide−80カラム（4.6mm ID×250mm）,UV_280nm検出，溶
離液：アセトニトリル／水＝7/3（V/V），流速:1.0ml/m
in］:^tR＝11.0min 元素分析値:C₄₈H₇₄ClNO₃₇として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） 44.60 5.77 1.08 実測値（％） 44.45 5.80 1.11 比旋光度（▲［α］²⁵ _D▼）：（c 0.48,H₂O）：＋1.2×
10²⁰ 実施例３ ６−デオキシマルトトリオシド誘導体はα−アミラー
ゼの作用をほとんど受けないのに対し、本発明における
６−デオキシマルトオリゴシド誘導体は極めて順調にそ
の作用をうけるが、この点について以下のとおりの試験
方法で測定した。

試験方法 （１）基質液の調製 実施例１で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵
−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド（以下本発明
基質という）50.0mgに、0.05％ウシ血清アルブミン含有
10mMリン酸緩衝液（pH＝7.0）を加えて全量を25mlとし
て基質液を調製した。

（２）基質液の調製 後述の方法で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル−
6³−デオキシ−β−Ｄ−マルトトリオシド（以下対照基
質という）50.0mgに、0.05％ウシ血清アルブミン含有10
mMリン酸緩衝液（pH＝7.0）を加えて全量を25mlとして
基質液を調製した。

（３）共役酵素液の調製 0.05％ウシ血清アルブミン含有10mMリン酸緩衝液（pH
7.0）に市販の酵母由来のα−グルコシダーゼ、市販の
アーンモド由来のβ−グルコシダーゼをそれぞれ2340
U、及び260U加えて全量20mlとして共役酵素液を調製し
た。

（４）試薬液の調製 基質液及び共役酵素液をそれぞれ容量比1.5:1で良く
混合し、試薬液を調製した。

（５）α−アミラーゼ液の調製 市販のヒト由来のα−アミラーゼ（国際試薬社製、キ
ャブリザイム・AMY（P:S＝1:1）を0.05％ウシ血清アル
ブミン含有10mMリン酸緩衝液（pH7.0）に加え、０、15
0、450U/の濃度に溶解してα−アミラーゼ液を調製し
た。

（６）α−アミラーゼ加水分解反応 試薬液2.5mlを37℃で５分間加温したのち、α−アミ
ラーゼ液100μを加えてかきまぜ、37℃で２分間加温
後から２分間400nmにおける吸光度を増加量を測定し
た。

その結果を第５表に示す。

なお、対照基質の２−クロロ−４−ニトロフェニル−
6³−デオキシ−β−Ｄ−マルトトリオシドは次の方法に
より得た。

エタノールグラジエントによる約21％のエタノール溶
出画分を採取したこと以外は、実施例１の（１）〜
（４）と同様の操作を行い、純度98.6％のα−6³−デオ
キシマルトトリオース約1.1gを得た。次いで、該化合物
401mg（0.842mmol）に、実施例１の（５）と同様の操作
を行い、デカ−Ｏ−アセチル−6³−デオキシマルトトリ
オース（α体：β体＝約1:1）604mg（0.665mmol,収率8
1.0％）を得た。

次いで、この化合物555mg（0.611mmol）に、実施例１
の（６）と同様の操作を行い、α−ノナ−Ｏ−アセチル
−6³−デオキシマルトトリオシルブロミド173mg（0.186
mmol,収率30.4％）を得た。次いで、該化合物150mg（0.
161mmol）に、実施例１の（７）と同様の操作を行い、
メタノールから再結晶して２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−ノナ−Ｏ−アセチル−6³−デオキシ−β−Ｄ−マ
ルトトリオシド140mg（0.137mmol,収率85.0％）を得
た。さらに、この化合物108mg（0.106mmol）に、実施例
１の（８）と同様の操作を行い、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−6³−デオキシ−β−Ｄ−マルトトリオシド
42.8mg（0.665mmol,収率63.1％）を得た。

融点（℃）:150.0〜152.0 紫外部・可視部吸収スペクトル： 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3420,2940,1590,1524,149
0,1414,1354,1282,1256,1156,1050,924,896 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（D₂O）:1.28（3H,
d,J＝6.4Hz）,3.18（1H,t,J＝9.4Hz）,3.45〜4.00
（ｍ）,5.28（1H,d,J＝3.1Hz）,5.32（1H,d,J＝3.8H
z）,5.42（1H,d,J＝5.9Hz）,7.40（1H,d,J＝9.0Hz）,8.
21（1H,dd,J＝9.0Hz,2.7Hz）,8.40（1H,d,J＝2.7Hz） 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製TSK gel
Amide−80カラム（4.6mm ID×250mm）,UV_280nm検出，溶
離液：アセトニトリル／水＝3/1（V/V），流速:1.0ml/m
in］:^tR＝4.3min 元素分析値:C₂₄H₃₄ClNO₁₇として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） 44.76 5.32 2.18 実測値（％） 44.68 5.35 2.18 実施例４ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵−デオ
キシ−マルトペンタオシドの製造（別法） （１）２−クロロ−４−ニトロフェニル−4⁵,6⁵−ベン
ジリデン−β−Ｄ−マルトペンタオシドの合成 市販の２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マ
ルトペンタオシド（第一化学薬品社製）15.0g（15.2mmo
l）を無水DMF225mlに溶解し、ベンズアルデヒドジメチ
ルアセタール11.4ml（76.0mmol）とトシル酸2.25g（11.
4mmol）を加え、40℃で４時間かきまぜながら反応させ
た。次いで、この反応液を氷水1.2へかきまぜながら
ゆっくりと滴下した。これに飽和重炭酸ナトリウム水溶
液を氷冷下かきまぜながらゆっくりと加えて中和し、次
いでこの混合液をジクロロメタン300mlで３回洗浄した
のち、水層部を濃縮し、DMFと水を留去した。次いで残
査をODSカラムクロマトグラフィーにより精製し、エタ
ノール−水混液（容量比2:3）で溶出した目的区分を濃
縮し、イソプロパノール−メタノールから再結晶して２
−クロロ−４−ニトロフェニル−4⁵,6⁵−ベンジリデン
−β−Ｄ−マルトペンタオシド11.2g（10.4mmol,収率6
8.3％）を得た。

融点（℃）:196.0〜200.0 紫外部・可視部吸収スペクトル： 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3410,2940,1630,1586,152
0,1486,1350,1274,1152,1074,1028,930,896 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（CDCl₃）:3.20〜
5.70（ｍ）,5.05（2H,d,J＝3.4Hz）,5.12（1H,d,J＝4.4
Hz）,5.13（1H,d,J＝4.4Hz）,5.25（1H,d,J＝7.6Hz）,
5.56（1H,s）,7.33〜7.55（5H,m）,7.35（1H,d,J＝9.0H
z）,8.14（1H,dd,J＝9.0Hz,2.7Hz）,8.29（1H,d,J＝2.7
Hz） 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製TSK gel
Amide−80カラム（4.6mm ID×250mm）,UV_280nm検出，溶
離液：アセトニトリル／水＝3/1（V/V），流速:1.0ml/m
in］:^tR＝4.8min （２）２−クロロ−４−ニトロフェニル−テトラデカ−
Ｏ−アセチル−4⁵,6⁵−ベンジリデン−β−Ｄ−マルト
ペンタオシドの合成 （１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル−4⁵,6
⁵−ベンジリデン−β−Ｄ−マルトペンタオシド13.3g
（12.4mmol）をピリジン200mlに溶解し、無水酢酸100ml
（1.28mol）を加え、室温で２日間反応させた。次い
で、この反応液を減圧下濃縮し、ピリジン、無水酢酸、
酢酸を留去したのち、残渣をシリカゲルカラムクロマト
グラフィーにより精製し、メタノール−ジクロロメタン
混液（容量比2:98）で溶出した目的区分を濃縮し、エタ
ノールから再結晶して２−クロロ−４−ニトロフェニル
テトラデカ−Ｏ−アセチル−4⁵,6⁵−ベンジリデン−β
−Ｄ−マルトペンタオシド18.1g（10.9mmol,収率87.9
％）を得た。

融点（℃）:130.0〜135.0 紫外部・可視部吸収スペクトル： 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3410,2940,1630,1586,152
0,1486,1350,1274,1152,1074,1028,930,896 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（CDCl₃）:2.00〜
2.21（42H,each s）,3.55〜4.90（ｍ）,5.15〜5.50
（ｍ）,7.30（1H,d,J＝9.2Hz）,7.26〜7.41（5H,m）,8.
17（1H,dd,J＝9.2Hz,2.7Hz）,8.30（1H,d,J＝2.7Hz） 高速液体クロマトグラフィー［半井化学薬品社製COSMOS
ILC₁₈カラム（4.6mm ID×150mm）,UV_280nm検出，溶離
液：アセトニトリル／水＝3/1（V/V），流速:1.0ml/mi
n］:^tR＝7.7min 比旋光度（▲［α］²⁵ _D▼）：（c 0.25,1,4−ジオキサ
ン）：＋0.84×10²⁰ （３）２−クロロ−４−ニトロフェニル−Ｏ−（2,3−
ジ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１
→４）−トリス［Ｏ−（2,3,6−トリ−Ｏ−アセチル−
α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−2,3,6−
トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成 （２）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル テト
ラデカ−Ｏ−アセチル−4⁵,6⁵−ベンジリデン−β−Ｄ
−マルトペンタオシド1.66g（1.00mmol）を酢酸50mlに
溶解し、水12.5mlを加え、30℃で３日間かきまぜながら
反応させた。次いでこの反応液を氷水300ml中へかきま
ぜながらゆっくりと滴下したのち、この混合液をジクロ
ロメタン300mlで３回抽出した。次いでジクロロメタン
層を水300mlで３回洗浄し、ジクロロメタン層部を無水
硫酸ナトリウムで乾燥、ろ別したのち、ろ液を減圧下濃
縮し、ジクロロメタンを留去した。次いで残渣をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、酢酸エチ
ル−メタノール−ジクロロメタン混液（容量比66:2.5:3
3）で溶出した目的区分を濃縮して、２−クロロ−４−
ニトロフェニル−Ｏ−（2,3−ジ−Ｏ−アセチル−α−
Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−
（2,3,6−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノ
シル）−（１→４）］−2,3,6−トリ−Ｏ−アセチル−
β−Ｄ−グルコピラノシド1.04g（0.661mmol、収率66.1
％）を得た。

融点（℃）:126.0〜130.0 紫外部・可視部吸収スペクトル： 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3480,2970,1752,1588,153
0,1486,1432,1372,1350,1236,1030,944,898 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（CDCl₃）:1.18〜
2.12（42H,each s）,3.50〜4.74（ｍ）,5.05〜5.40
（ｍ）,7.22（1H,d,J＝9.0Hz）,8.09（1H,dd,J＝9.0Hz,
2.7Hz）,8.22（1H,d,J＝2.7Hz） 高速液体クロマトグラフィー［半井化学薬品社製COSMOS
ILC₁₈カラム（4.6mm ID×150mm）,UV_280nm検出，溶離
液：アセトニトリル／水＝7/3（V/V），流速:1.0ml/mi
n］:^tR＝4.2min 比旋光度（▲［α］²⁵ _D▼）：（c 0.26,1,4−ジオキ
サ）：＋0.88×10²⁰ （４）２−クロロ−４−ニトロフェニル−Ｏ−（2,3−
ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−トシル−α−Ｄ−クルコピ
ラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−（2,3,6−トリ
−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→
４）］−2,3,6−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドの合成 実施例４の（３）で得た２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−Ｏ−（2,3−ジ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−（2,3,6−ト
リ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１
→４）］−2,3,6−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グル
コピラノシド1.16g（0.738mmol）をピリジン30mlに溶解
し、トシルクロリド2.11g（11.0mmol）を加え、室温下
で５時間かきまぜながら反応させた。次いでこの反応液
中のピリジンを減圧下留去し、この残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにより精製し、酢酸エチル−メ
タノール−ジクロロメタン混液（容量比40:1:20）で溶
出した目的区分を濃縮して、２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−Ｏ−（2,3−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−トシ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−トリス
［Ｏ−（2,3,6−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル）−（１→４）］2,3,6−トリ−Ｏ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコピラノシド643mg（0.372mmol,収率5
0.5％）を得た。

融点（℃）:109.0〜113.5 紫外部・可視部吸収スペクトル： 赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3490,2970,1752,1586,152
8,1486,1430,1372,1350,1240,1178,1034,942 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（CDCl₃）:1.99〜
2.17（42H,each s）,3.50〜4.80（ｍ）,5.10〜5.50
（ｍ）,7.32（2H,d,J＝9.0Hz）,7.35（2H,d,J＝8.5H
z）,7.79（1H,d,J＝8.5Hz）,8.15（1H,dd,J＝9.0Hz,2.7
Hz）,8.29（1Hz,d,J＝2.7Hz） 高速液体クロマトグラフィー［半井化学薬品社製COSMOS
ILC₁₈カラム（4.6mm ID×150mm）,UV_280nm検出，溶離
液：アセトニトリル／水＝7/3（V/V），流速:1.0ml/mi
n］:^tR＝10.0min 比旋光度（▲［α］²⁵ _D▼）：（c 0.65,1,4−ジオキサ
ン）：＋0.88×10²⁰ （５）２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵−デオキシ
−マルトペンタオシドの合成 実施例４の（４）で得た２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−Ｏ−（2,3−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−トシル
−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−トリス
［Ｏ−（2,3,6−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル）−（１→４）］−2,3,6−トリ−Ｏ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコピラノシド500mg（0.290mmol）を
DMSO10mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム（NaBH₄）1
10mg（2.91mmol）を加え、50℃で13時間反応する。次い
でこの反応液を氷水500ml中へかきまぜながらゆっくり
滴下する。次いでこの混合液をベンゼン200mlで３回抽
出し、ベンゼン層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、
綿栓ろ過する。このろ液を濃縮し、含まれるベンゼンを
留去する。精製することなく、この残渣をメタノール16
mlに溶解し、28％アンモニア水8ml及び水4mlを加え、35
℃で20時間かきまぜながら反応させる。次いで反応液を
減圧濃縮し、ここに含まれる水及びメタノールを留去す
る。次いでその残渣をODSカラムクロマトグラフィーに
より精製し、エタノール−水混液（容量比1:4）で溶出
した目的区分を濃縮し、水から再結晶して、２−クロロ
−４−ニトロフェニル−6⁵−デオキシマルトペンタオシ
ドが177mg（0.183mmol,収率63.1％）を得た。ここで得
られた２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵−デオキシ
マルトペンタオシドの物性は、実施例１で得られた２−
クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵−デオキシマルトペン
タオシドの物性と全て一致した。

実施例５ α−アミラーゼ活性の測定法 （１）基質液の調製 実施例１で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵
−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド50.0mgに、0.
05％ウシ血清アルブミン含有10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）を加えて全量を25mlとして基質液を調製した。

（２）共役酵素液の調製 0.05％ウシ血清アルブミン含有10mMリン酸緩衝液（pH
7.0）に市販の酵母由来のα−グルコシダーゼ、市販の
アーモンド由来のβ−グルコシダーゼをそれぞれ2340U
及び260U加えて全量を20mlとして共役酵素液を調製し
た。

（３）試薬液の調製 基質及び共役酵素液をそれぞれ容量比1.5:1でよく混
合して試薬液を調製した。

（４）標品α−アミラーゼ液の調製 市販のヒト由来のα−アミラーゼ（P:S＝1:1）を0.05
％ウシ血清アルブミン含有10mMリン酸緩衝液（pH7.0）
に加え、０、25、50、100、150、300、450、600U/の
濃度に溶解して標品α−アミラーゼ液を調製した。

（５）試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのま
ま試料液とした。また、固体の場合は試料500mgを正確
に秤量し、0.05％ウシ血清アルブミン含有10mMリン酸緩
衝液（pH7.0）を加えて全量を5mlとして試料液を調製し
た。

（６）検量線の作成 試薬液2.5mlを37℃で５分間加温したのち、標品α−
アミラーゼ液100μ加えてかきまぜ、37℃で２分間加
温後からの２分間、400nmにおける吸光度の増加量を測
定した。この時、標品α−アミラーゼ液活性と吸光度の
増加量関係より検量線を作成した。国際試薬社製標品α
−アミラーゼ（キャブリザイム・AMY）を用いた場合、
検量線の式は Ｕ＝5.875・△Ａ×10³−3.37 ［U:酵素活性U/、△A:吸光度の増加量］ となる。そのグラフを第９図に示す。

（７）試薬液中のα−アミラーゼ活性の測定 試薬液2.5mlを37℃で５分間加温したのち、試料液100
μを加えてかきまぜ、37℃で２分間加温後からの２分
間、400nmにおける吸光度の増加量を測定した。この測
定値と（６）で作成した検量線から算出して試料液中の
α−アミラーゼ活性を測定することができる。なお、試
料液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲（０〜600U/
）を超えた場合は0.05％ウシ血清アルブミン含有10mM
リン酸緩衝液（pH7.0）を用いて相当する倍数の希釈を
行った後、再測定を行う。

実施例６ 本発明の化合物が測定系内で安定に存在することを実
証するために、非還元末端非修飾体を対照として下記の
試験方法に従って共役酵素との反応を行った。

試験方法 （１）基質液の調製 実施例１で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵
−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド（以下本発明
基質という）50.0mgに、0.05％ウシ血清アルブミン含有
10mMリン酸緩衝液（pH＝7.0）を加えて全量を25mlとし
て基質液を調製した。

（２）基質液の調製 市販の２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マ
ルトペンタオシド（以下対照基質という）50.0mgに、0.
05％ウシ血清アルブミン含有10mMリン酸緩衝液（pH＝7.
0）を加えて全量25mlとして基質液を調製した。

（３）共役酵素液の調製 0.05％ウシ血清アルブミン含有10mMリン酸緩衝液（pH
7.0）に市販の酵母由来のα−グルコシダーゼ11700Uを
加えて全量を5mlとして共役酵素液Ａを調製した。同様
に、0.05％ウシ血清アルブミン含有10mMリン酸緩衝液
（pH7.0）に市販のアーモンド由来のβ−グルコシダー
ゼ182Uを加えて全量5mlとして共役酵素液Ｂを調製し
た。

（４）共役酵素反応 基質液、基質液、共役酵素液Ａ及びＢを37℃で５
分間加温したのち、基質液及び基質液をそれぞれ基
質液：共役酵素液A:共役酵液Ｂ＝2:1:0.5（容量比）で
よく混合し、２分後から５分間、400nmにおける吸光度
の増加量を測定した。

その結果を第10図に示した。図中の□印は基質液、
△印は基質液によるものである。これより、本発明基
質は共役酵素と反応することなく、測定系内で安定に存
在することが分る。

実施例７ 測定試薬 （１）試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することによ
り試薬Ａを調製した。成 分 濃 度 ２−クロロ−４−ニトロフェニル−6⁵−デオキシ−β− Ｄ−マルトペンタオシド 2.0 mM α−グルコシダーゼ 60 U/ml β−グルコシダーゼ 10 U/ml β−グリセロリン酸緩衝液（pH7.0） 10 mM ウシ血清アルブミン 0.05％ 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することによ
り試薬Ｂを調製した。成 分 濃 度 β−グリセロリン酸緩衝液（pH7.0） 10 mM ウシ血清アルブミン 0.05％ （２）測定法 測定用試料が液体の場合はそのまま試料液とした。固
体の場合は試料500mgを正確に秤量し、試薬Ｂを加えて
全量を5mlとして試料液とした。次いで試薬A3.0mlを37
℃で５分間加温したのち、試料液100μ加えてかきま
ぜ、37℃で２分間加温後から２分間400nmにおける吸光
度の増加量を測定した。この測定値とあらかじめ作成し
た検量線から算出して試料液中のα−アミラーゼ活性を
測定することができる。なお、試料液中の酵素活性の値
が検量線の適用範囲を超えた場合は試料Ｂを用いて相当
する倍数の希釈を行った後、再測定を行う。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いたシクロデキストリナーゼの至適
pHを示すグラフ、第２図は安定性pHを示すグラフ、第３
図は作用温度を示すグラフ、第４図は温度による失活の
条件を示すグラフ、第５図はDEAEセファロースによるカ
ラムクロマトグラフィーの結果を示すグラフ、第６図は
TSK gelエーテル5PWによるHPLCの結果を示すグラフ、第
７図はTSK gel G3000SWによるHPLCの結果を示すグラ
フ、第８図はSDS PAGEの結果を示す図、第９図はα−ア
ミラーゼ活性の測定に用いる検量線を示すグラフ、第10
図は本発明基質と対照基質との測定系内における安定性
を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 水澤 清 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社内 (72)発明者 山次 信幸 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社内

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式 （式中のＲは芳香族発色性基であり、ｎは２〜６の整数
   である） で表わされる６−デオキシマルトオリゴシド誘導体。
2. 【請求項２】請求項１記載の６−デオキシマルトオリゴ
   シド誘導体を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用
   試薬。
3. 【請求項３】α−アミラーゼ含有試料に、請求項１記載
   の６−デオキシマルトオリゴシド誘導体のα−アノマー
   と、α−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼを
   添加して酵素反応を行わせ、遊離する芳香族発色性化合
   物を定量することを特徴とするα−アミラーゼ活性の測
   定方法。
4. 【請求項４】α−アミラーゼ含有試料に、請求項１記載
   の６−デオキシマルトオリゴシド誘導体のβ−アノマー
   又はα−アノマーとβ−アノマーとの混合物と、α−グ
   ルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼ並びにβ−グ
   ルコシダーゼを添加して酵素反応を行わせ、遊離する芳
   香族発色性化合物を定量することを特徴とするα−アミ
   ラーゼ活性の測定方法。