JPH05304998A - α−アミラーゼ活性測定用試薬及びα−アミラーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオー
スを有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試薬及び
α−アミラーゼ活性含有試料に６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシ
ルマルトペンタオースを添加し、酵素反応によって生成
するグルコ−スを定量してα−アミラーゼ活性を測定す
る方法である。 【効果】 ６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオー
スをα−アミラーゼ活性測定用基質として用いることに
より、α−アミラーゼ活性測定時に通常使用いられてい
るα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコア
ミラーゼなどの共役酵素を用いることなく、α−アミラ
ーゼ活性を精度よく、容易に測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコ
シルマルトペンタオースを有効成分とし、α−グルコシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼなどの
共役酵素を含有しないα−アミラーゼ活性測定用試薬及
び該６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオースを用
い、上記共役酵素を使用することなくα−アミラーゼ活
性を効率よく、かつ正確に測定する方法に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】従来、血清、尿、膵液、唾液などの体液
を対象とするα−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上
極めて重要であり、特に急性や慢性の肝炎、膵臓がん、
流行性耳下腺炎などの鑑別診断においては必須の測定項
目となっている。このα−アミラーゼ活性の測定方法に
ついては、従来より種々の方法、例えば、（１）デンプ
ン又は色素結合デンプンを基質とし、還元力あるいは吸
光度を測定する方法、（２）マルトテトラオース、マル
トペンタオースなどの一連のマルトオリゴ糖を基質とし
て利用し、α−アミラーゼにより切断したのち、共役酵
素を作用させ、生成するマルトース又はグルコースを定
量する方法などが知られている。

【０００３】しかしながら、（１）の方法においては、
基質に用いられるデンプンの品質により、測定値にバラ
ツキを生じるおそれがある上、酵素切断部位が多数存在
するため、α−アミラーゼ反応を正確に化学量論的反応
として測定できないなどの欠点がある。これに対し、
（２）の方法は、均一な基質を使用するために、前記
（１）の欠点を解消することができ、好ましい方法とし
て広く用いられているが、基質そのものが共役酵素によ
り分解されるため、正の誤差を生じやすいという欠点を
有している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のα−アミラーゼ活性の測定試薬及びそれを用いる
測定方法が有する欠点を克服し、α−アミラーゼ活性を
効率よく、かつ正確に測定しうる試薬及びその測定方法
を提供することを目的としてなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、前記目的を
達成するために鋭意研究を重ねた結果、６⁴−Ｏ−Ｄ−
グルコシルマルトペンタオースをα−アミラーゼ活性の
測定用基質として用いれば、前記共役酵素を使用するこ
となくα−アミラーゼ活性を測定することができて前記
の欠点を克服しうることを見出し、この知見に基づいて
本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、６⁴−Ｏ−Ｄ−グル
コシルマルトペンタオースを有効成分とするα−アミラ
ーゼ活性測定用試薬及びα−アミラーゼ活性含有試料に
６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオースを添加
し、酵素反応によって生成するグルコ−スを定量するこ
とを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定方法である。

【０００７】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明においてα−アミラーゼ活性の測定用基質として用
いられる６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオース
は既知の化合物であって［カーボハイドレイト・リサー
チ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、
第１７３巻、第３２４〜３３１ページ（１９８８
年）］、次の構造式で表わされるものである。

【化１】 そして、該６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオー
スは上記構造式に表わされているごとく、α−アノマー
又はβ−アノマーのいずれであってもよい。また、α−
アノマーとβ−アノマーの混合物であっても基質として
有効に用いられる。

【０００８】該６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタ
オースの製造方法については、特に制限はなく、任意の
方法を用いることができるが、例えば次の方法によって
製造することができる。すなわち、該６⁴−Ｏ−Ｄ−グ
ルコシルマルトペンタオースは、分岐サイクロデキスト
リンを出発原料とし、これにサイクロデキストリナーゼ
を作用させると同時に、又は作用させたのちに、マルト
オリゴ糖生成酵素を作用させることによって製造するこ
とができる。

【０００９】ここで用いられるサイクロデキストリナー
ゼとしては、（イ）サイクロデキストリンを開裂し、サ
イクロデキストリンのグルコース重合度に由来するマル
トオリゴ糖を生成させる作用及び（ロ）サイクロデキス
トリンに対する水解速度又は親和性が、多糖類あるいは
サイクロデキストリンと同じ重合度の直鎖オリゴ糖より
も大きい基質特異性を有するものであればどのようなも
のでもよく、特に制限されず、またその起源についても
特に制限はない。

【００１０】このような酵素の中で好適なものとして
は、例えば次の理化学的性質を有する公知のサイクロデ
キストリナーゼを挙げることができる。 理化学的性質 （イ）作用：サイクロデキストリンを開裂し、サイクロ
デキストリンのグルコース重合度に由来するマルトオリ
ゴ糖を生成させる。 （ロ）基質特異性：サイクロデキストリンに対する水解
速度又は親和性が、多糖類あるいはサイクロデキストリ
ンと同じ重合度の直鎖オリゴ糖よりも大である。 （ハ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：β−サイクロデキス
トリンを基質とした場合、ｐＨ８．０近傍に至適ｐＨを
有し、かつ安定ｐＨ範囲が５．５〜９．５である。 （ニ）作用適温の範囲：４０℃近傍に作用適温を有す
る。 （ホ）温度などによる失活の条件：５０℃以上の温度で
１５分間の処理により、ほぼ失活する。 （ヘ）阻害及び活性化性：Ｈｇ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｎ
ｉ²⁺及びＦｅ²⁺により９０％以上阻害され、Ｃａ²⁺及び
Ｍｇ²⁺により１０〜３０％活性化される。 （ト）分子量：ゲルろ過法による分子量が１４４，００
０で、ＳＤＳ ＰＡＧＥ法による分子量が７２，０００
である。すなわち、該酵素は分子量７２，０００のサブ
ユニットから成る二量体である。

【００１１】なお、該酵素の力価は、２％（Ｗ／Ｖ）濃
度のβ−サイクロデキストリン溶液５００μｌ及び適当
量の該酵素を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）５００μｌを混和し、温度４０℃で適当時間反
応させたのち、１０分間煮沸することにより反応を停止
し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっ
て、生成したマルトヘプタオースを定量することにより
求めた。また、酵素量が少量の場合には、グルコースを
標準としたソモギ−ネルソン法により還元力を測定する
ことにより求めた。該酵素の酵素単位については、１分
間に１マイクロモルのマルトヘプタオ−スを生成する酵
素量を１単位とした。

【００１２】このような諸性質を有する酵素は、例えば
バチルス属に属し、該酵素を産生する微生物、例えばバ
チルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅ
ｒｉｃｕｓ）Ｅ−２４４菌株［工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第２４５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−２
４５８）として寄託されている］などを培地に培養し、
得た培養物より該酵素を採取することにより得られる。
なお、前記酵素の理化学的性質、その産生菌バチルス・
スフェリカスＥ−２４４菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２４５
８）の菌学的性質及び該酵素の製造法の詳細について
は、特開平３−１５３８４号公報に記載されている。

【００１３】そして、 先ず、一般式

【化２】 で表わされる６−Ｏ−Ｄ−グルコシル−β−サイクロデ
キストリンに、前記した特定のサイクロデキストリナー
ゼを作用させることにより、６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシル
マルトヘプタオースを主成分とする反応液を得る。

【００１４】出発物質として好適な前記一般式（ＩＩ）
で表わされる６−Ｏ−Ｄ−グルコシル−β−サイクロデ
キストリンは、例えば市販のものを用いてもよく、また
β−サイクロデキストリンとマルトースからプルナーゼ
の逆反応を利用して６−Ｏ−Ｄ−マルトシル−β−サイ
クロデキストリンを得たのち、これにグルコアミラーゼ
を作用させることにより製造することができる［澱粉科
学、第３０巻、２号、２３１〜２３９ページ（１９８３
年）］。

【００１５】この酵素反応における６−Ｏ−Ｄ−グルコ
シル−β−サイクロデキストリンの基質濃度は、該サイ
クロデキストリナ−ゼの基質に対するＫｍ値以上の濃度
になるように調整することが好ましい。また、酵素反応
条件については、該サイクロデキストリナ−ゼの作用ｐ
Ｈ及び作用温度の範囲であればよく、特に制限はない
が、通常ｐＨ７．０〜９．０、温度３５〜４５℃の条件
で反応が行われる。さらに、この反応において、必要に
応じ、エタノ−ル、アセトン、ＤＭＳＯなどの有機溶媒
を添加してもよい。反応時間は通常３０分ないし４８時
間である。また、酵素量については特に制限はないが、
反応時間内に生成物量が最大となるように、適宜必要量
を添加すればよく、通常０．５〜５０単位／ｇの範囲で
選ばれる。

【００１６】このようにして得られた６⁴−Ｏ−Ｄ−グ
ルコシルマルトヘプタオースを主成分とする反応液にマ
ルトオリゴ糖生成酵素を作用させることによって、６⁴
−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオース含有液が得ら
れる。この際に用いられるマルトオリゴ糖生成酵素とし
ては、例えば公知のβ−アミラーゼ、α−マルトース生
成アミラーゼ、α−グルコシダ−ゼ、グルコアミラ−ゼ
などが挙げられるが、これらはそれぞれ単独で用いても
よいし、組み合わせて用いてもよい。

【００１７】該マルトオリゴ糖生成酵素は、前記サイク
ロデキストリナ−ゼと共存させて、酵素反応を同時的に
行わせてもよいし、６−Ｏ−Ｄ−グルコシル−β−サイ
クロデキストリンに前記サイクロデキストリナ−ゼを作
用させたのち、さらに該マルトオリゴ糖生成酵素を作用
させて酵素反応を行わせてもよいが、後者の方が好まし
い。特に好適な態様においては、例えば６−Ｏ−Ｄ−グ
ルコシル−β−サイクロデキストリンに該サイクロデキ
ストリナ−ゼを作用させて、生成物が最大になった時点
で、酸処理や熱処理などにより、いったん反応を停止さ
せたのち、例えば反応液に未反応の６−Ｏ−Ｄ−グルコ
シル−β−サイクロデキストリンを吸着除去する処理や
適宜の精製処理を施し、次いでこれにマルトオリゴ糖生
成酵素を作用させる。なお、この未反応物の除去処理と
しては、例えば冷却処理、有機溶媒添加処理などによる
析出−濾別法、オクタデシル化シリカゲル（ＯＤＳ）カ
ラムクロマトグラフィ−などの公知の方法が挙げられ
る。また、精製処理としては通常のオリゴ糖分離精製法
が有効に用いられ、例えば活性炭カラムクロマトグラフ
ィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層クロ
マトグラフィー、分配・吸着カラムクロマトグラフィー
などが単独又は組合せて用いられる。

【００１８】該サイクロデキストリナ−ゼとマルトオリ
ゴ糖生成酵素とを共存作用させる場合の反応条件として
は、勿論両酵素の共通の作用ｐＨ及び作用温度範囲で適
宜選択すればよいが、通常ｐＨ７．０〜９．０、温度３
５〜４５℃において、０．５〜４８時間程度反応が行わ
れる。また、サイクロデキストリナ−ゼを作用させたの
ち、マルトオリゴ糖生成酵素を作用させる場合の反応条
件としては、用いる酵素の作用ｐＨ及び作用温度範囲で
適宜選べばよいが、通常ｐＨ４．０〜７．５、温度３５
〜４５℃において、０．５〜４８時間程度反応が行なわ
れる。さらに、マルトオリゴ糖生成酵素の使用量につい
ては特に制限はないが、通常６−Ｏ−Ｄ−グルコシルサ
イクロデキストリンに対し、１０〜１００単位／ｇの範
囲で選ばれる。また、この酵素反応は酸処理や熱処理な
どにより停止させることができる。

【００１９】次に、得られた反応液から、所望の６⁴−
Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオ−スを分離精製する
のであるが、この分離精製方法についても特に制限はな
く、従来オリゴ糖の分離精製に慣用されている方法を用
いることができる。例えば反応液から未反応の６−Ｏ−
Ｄ−グルコシル−β−サイクロデキストリンを除去して
いない場合にはこれを前記と同様にして除去したのち、
前記したと同様の精製処理を施して分画採取する方法な
どを採用することができる。

【００２０】このようにして得られた６⁴−Ｏ−Ｄ−グ
ルコシルマルトペンタオ−スは、これを基質とすれば、
前記のごとく通常使用されているα−グルコシダーゼ、
β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼなどの共役酵素
を用いることなく、α−アミラーゼ活性を化学量論的に
測定することができ、極めて有用なものである。α−ア
ミラーゼ活性を測定するための有利な系としては、例え
ば６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオ−ス１〜４
０ｍＭ及び緩衝剤２〜１００ｍＭを含有するｐＨ４〜１
０の系が挙げられる。この系に用いられる緩衝剤として
は、例えばリン酸塩、トリス−（ヒドロキシメチル）−
アミノメタン、ホウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタ
ル酸塩などが挙げられる。該測定系には、必要に応じ溶
解補助剤、安定化剤としてのグリセリン、牛血清アルブ
ミン、α−又はβ−サイクロデキストリン、トリトンＸ
−１００などを添加することもできるし、また、α−ア
ミラーゼ活性剤としてＣｌ^-、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺などのイ
オンをＮａＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣｌ₂、
ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏなどの形で添加することもできる。

【００２１】さらに、酵素反応によって生成するグルコ
ースを吸光度測定法によって定量する場合には、通常用
いられるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（例
えばＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄ
ｅｓなどに由来するもの）、へキソキナーゼ（例えば酵
母などに由来するもの）、ＮＡＤＰとＡＴＰなど、ある
いはグルコースオキシダーゼ（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｓｐ．などに由来するもの）、パーオキシダー
ゼ（例えばわさびなどに由来するもの）、フェノール、
４−アミノアンチピリンなどを加えればよい。本発明の
試薬は、乾燥物又は溶解した形で用いてもよいし、薄膜
状の担体、例えばシート、含浸性の紙のなどに含浸させ
て用いてもよい。このような本発明の試薬を用いること
により、各種の試料に含有されるα−アミラーゼ活性
を、簡単な操作で正確に、かつ高感度で測定することが
できる。

【００２２】次に、本発明のα−アミラーゼ活性の測定
方法の好適な１例について説明すると、先ず、α−アミ
ラーゼ活性を含む試料に、６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマ
ルトペンタオ−ス１〜３０ｍＭ及び緩衝剤を添加したの
ち、温度２５〜５０℃、ｐＨ４〜１０の条件にて３０分
間以上、好ましくは１〜６時間酵素反応させる。次い
で、必要に応じて例えば加熱処理などにより反応を停止
させ、生成したグルコースを、常法によりそのまま、例
えばソモギ−ネルソン法、グルコスタット法などを用い
て定量するか、又は前記したような吸光度測定法（例え
ば前記のＮＡＤＰＨの増加量を測定する場合には３４０
ｎｍ、４−アミノアンチピリンに由来する赤色の発色を
測定する場合には５０５ｎｍの吸光度を測定する方法な
ど）によって定量し、あらかじめ同方法で定量して作成
したα−アミラーゼ標品の検量線を用いて、試料中のα
−アミラーゼ活性を算出する。

【００２３】本発明に用いられるα−アミラーゼ活性含
有試料については、α−アミラーゼ活性を含有するもの
であればよく、特に制限はないが、具体的には微生物の
培養液、植物の抽出液、あるいは動物の体液や組織及び
それらの抽出液などを用いることができる。また、α−
アミラーゼ活性含有試料が固体の場合には、いったん精
製水又は緩衝剤に溶解又は懸濁させてから、測定に供す
るのが有利である。そしてまた、必要により、不溶物を
濾過などの操作で除去してもよい。さらに、この緩衝剤
としては、例えば前記したものなどが挙げられる。

【００２４】ここで、α−アミラーゼによる基質６⁴−
Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオースの水解部位など
につき検討した結果を次に示す。２０ｍＭ ６⁴−Ｏ−
Ｄ−グルコシルマルトペンタオース溶液１５０μｌ、１
００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０μｌ、３ｍＭ
塩化カルシウム溶液９０μｌ及びヒト唾液腺（Ｓ）α−
アミラーゼ（シグマ社製）溶液（１００Ｕ／ｌ）３０μ
ｌを混和したのち、４０℃で反応を行なって経時的
（０．５時間、４時間及び４０時間）に１００μｌずつ
サンプルを採取し、該サンプルは１０分間煮沸して反応
を停止させた。各サンプルにつき、遠心分離（１２００
０ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して変性タンパク質を除去したの
ち、上清をＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ８０（東ソー社
製、分配・吸着クロマトグラフィー充填カラム）を用い
たＨＰＬＣに付し、糖組成を分析した。反応が４０時間
のときの分析結果を図１に示す。この図１から、６⁴−
Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオースから、等モルの
６−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトテトラオースとグルコー
スが生成され 、他のマルトオリゴ糖の生成は殆ど認め
られないことがわかる。また、ヒト膵臓（Ｐ）α−アミ
ラーゼ及び豚膵臓α−アミラーゼについても同様の結果
であった。すなわち、該基質はα−アミラーゼによる水
解部位が実質的に１箇所であり、かつ生成物の一方がグ
ルコースであるので、α−アミラーゼの活性を精度よく
測定することができる。

【００２５】

【発明の効果】本発明は、上記のごとく新規なα−アミ
ラーゼ活性測定用試薬を用いることにより、α−アミラ
ーゼ活性を精度よく、容易に測定することができるとい
う利点がある。

【００２６】

【実施例】以下に実施例を示す。 実施例１ α−アミラ−ゼ活性の測定 （１）基質液の調製 後記の方法で得た４０ｍＭ ６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシル
マルトペンタオース５０μｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌ及び１００ｍＭ塩
化カルシウム１μｌを混合して基質液とした。 （２）標品α−アミラーゼ液の調製 市販のヒトα−アミラーゼ（Ｐ：Ｓ＝１：１）に精製水
を加え、０、３０、１００、３００、６００Ｕ／ｌの濃
度に溶解して標品α−アミラーゼ液とした。なお、この
市販のヒトα−アミラーゼは国際試薬（株）製キャリブ
ザイム・ＡＭＹを使用した。また、α−アミラーゼの活
性は、ｐ−ニトロフェニル−マルトヘプタオシド（Ｇ₇
−ＰＮＰ）を基質として用いるＧ₇−ＰＮＰ法により、
１分間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを遊離
する酵素量を１単位（Ｕ）として定義した。 （３）試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とする。固体の場合は通常、５００ｍｇを正確に
秤量し、精製水を加えて全量を５ｍｌとして試料液とし
た。必要に応じて、不溶物を濾過などの操作で除去して
から用いた。

【００２７】（４）検量線の作成 標品α−アミラーゼ液３９μｌに基質液６１μｌを加え
てかきまぜ、４０℃で５．０時間反応させたのち、５分
間煮沸して反応を停止させ、反応液中の遊離グルコース
量をグルコースＢ−テストワコー（和光純薬工業社製）
を用いた酵素法により定量した。各標品α−アミラーゼ
液の活性と遊離グルコース量の関係より検量線を作成し
た。その結果、検量線の式は Ｕ＝２．８６ｘ−１７．９ ［Ｕ；酵素活性／ｌ、ｘ；遊離グルコース量（μｇ／ｍ
ｌ）］ となった。そのグラフを図２に示す。 （５）試料中のα−アミラーゼ活性の測定 試料液３９μｌに基質液６１μｌを加えてかきまぜ、４
０℃で５．０時間反応させたのち、５分間煮沸して反応
を停止させ、反応液中の遊離グルコース量を（４）と同
様にして定量し、この定量値と（４）で作成した検量線
から算出して試料液中のα−アミラーゼ活性の測定を行
なうことができる。なお、試料液中の酵素活性の値が検
量線の適用範囲（０〜６００Ｕ／ｌ）を越えた場合は精
製水を用いて相当する倍数の希釈を行なったのち、再測
定を行なう。

【００２８】［６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタ
オースの製造］ （１）サイクロデキストリナーゼの調製 １％（ｗ／ｖ）β−サイクロデキストリン、１％（ｗ／
ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ及び０．１
％（ｗ／ｖ）イーストエキスから成る液体培地（水道水
使用、ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラ
スコに入れ、１２０℃で２０分間、殺菌処理を行なっ
た。これに、バチルス・スフェリカスＥ−２４４（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２４５８）の保存スラントより１白金耳接
種し、３０℃で１日間振盪培養した。この培養液５０ｍ
ｌを、前記と同様の培地組成と殺菌条件により調製した
２０００ｍｌの培地を含有する３０００ｍｌ容ミニジャ
ーに接種して３０℃、１ｖｖｍ、３５０ｒｐｍの条件で
２日間通気攪拌培養を行ない、培養終了後、この培養液
から８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離処理により菌
体を分離し、２％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含有
する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍｌに
菌体を懸濁して２５℃で１日間かきまぜた。該懸濁液か
ら１２０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離処理により菌
体残渣を除去したのち、上清を１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に対して１６時間透析した。得られた透
析物を１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離処理して不
溶物を除去し、上清を粗酵素液（１）とした。

【００２９】次いで、この粗酵素液（１）約５００ｍｌ
（総活性２００単位、タンパク量２０８３ｍｇ、比活性
０．１、ｐＨ７．０）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロース充填カラム
（φ３４×１７０ｍｍ）に供し、酵素を吸着させたの
ち、０〜１．５ＭＮａＣｌのグラジエント勾配により溶
出を行なった。このようにして得られた活性フラクショ
ンを集めて粗酵素液（２）１０５ｍｌ（総活性１４５単
位、比活性０．５８、収率７２．５％）を得た。続い
て、この粗酵素液（２）を１Ｍ硫酸ナトリウム含有１０
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したエーテ
ル５ＰＷ充填カラム（φ２１．５×１５０ｍｍ）に供
し、酵素を吸着させたのち、１Ｍ〜０硫酸ナトリウムの
グラジエント勾配により溶出を行なった。このようにし
て得られた活性フラクションを集めて粗酵素液（３）５
０ｍｌ（総活性７２単位、比活性２．９３、収率３６
％）を得た。

【００３０】（２）６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペ
ンタオースの製造 市販の６−Ｏ−Ｄ−グルコシル−β−サイクロデキスト
リン［６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキス
トリン，モノ（和光純薬工業社製）］２００ｍｇを脱イ
オン水８．９５ｍｌに溶解したのち、１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌ、前記（１）のサイクロデ
キストリナーゼの粗酵素液（３）１．８５単位を混和
し、４０℃で２時間反応を行なった。次いで、この反応
液を１０分間煮沸して反応を停止させたのち、遠心分離
（１２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により変性タンパク質
を除去し、得た上清をロータリエバポレーターで濃縮乾
固後、脱イオン水１ｍｌに再溶解した。この溶液より糖
質分取用ＰＡ−４３ ＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ社製、分
配・吸着クロマトグラフィー用充填カラム）を用いたＨ
ＰＬＣ操作（流速５ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液；アセトニト
リル：水＝５５：４５、検出；ＲＩ）により６⁴−Ｏ−
Ｄ−グルコシルマルトヘプタオース画分を分取し、ロー
タリエバポレーターで濃縮乾固して６⁴−Ｏ−Ｄ−グル
コシルマルトヘプタオース粉末約１００ｍｇを得た。な
お、該６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトヘプタオースに
β−アミラーゼ（甘藷由来のもの）及びマルトトリオー
ス生成アミラーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉ
ｓｅｕｓ由来のもの）を作用させることによって各々６
⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトヘプタオースと等モルの
マルトース、マルトトリオースが生成することより、得
られたものは６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトヘプタオ
ースであると確認された。

【００３１】次に、該６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルト
ヘプタオース粉末を９ｍｌの脱イオン水に溶解し、１０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）１ｍｌ、β−アミラーゼ
（シグマ社製、アミラーゼ活性５６００Ｕ／ｍｌ）５０
μｌを添加して４０℃で２時間反応を行なった。この反
応液を１０分間煮沸して反応を停止させたのち、遠心分
離（１２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により変性タンパク
質を除去し、得た上清をロータリエバポレーターで濃縮
乾固後、脱イオン水１ｍｌに再溶解した。この溶液より
前記と同様の糖質分取用ＰＡ−４３ ＨＰＬＣカラムを
用いたＨＰＬＣ操作により６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマ
ルトペンタオース画分を分取し、ロータリエバポレータ
ーで濃縮乾固して６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペン
タオース粉末４５ｍｇを得た。該６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコ
シルマルトペンタオース粉末４０ｍｇを脱イオン水１ｍ
ｌに溶解したのち、ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ ８０
（東ソー社製、分配・吸着クロマトグラフィー充填カラ
ム）を用いたＨＰＬＣにて糖組成を分析した。そのとき
のＨＰＬＣチャートパターンを図３に示す。また、得ら
れた６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオースの純
度は約９９％であった。

【００３２】実施例２ 測定試薬 （１） 試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することによ
り、試薬を調製した。 成 分 濃 度 ６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオース ３２．８ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５） １６．４ｍＭ 塩化カルシウム １．６４ｍＭ

【００３３】（２）測定法 測定用試料が液体の場合はそのまま試料液とする。固体
の場合は試料５００ｍｇを正確に秤量し、精製水を加え
て全量を５ｍｌとし、これを試料液とした。試料液３９
μｌに試薬６１μｌを加えてかきまぜ、４０℃で５．０
時間反応させたのち、５分間煮沸して反応を停止させ、
反応液中の遊離グルコース量を実施例１の（４）と同様
にして定量した。この定量値と実施例１の（５）で作成
した検量線から算出して試料液中のα−アミラーゼ活性
の測定を行なうことができる。なお、試料液中の酵素活
性の値が検量線の適用範囲（０〜６００Ｕ／ｌ）を越え
た場合は精製水を用いて相当する倍数の希釈を行なった
のち、再測定を行なう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタオー
スにヒト唾液腺α−アミラーゼを作用させたときの反応
液のＨＰＬＣチャートパターン

【図２】 実施例１におけるα−アミラーゼ活性の測定
に用いる検量線のグラフ

【図３】 実施例１における６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシル
マルトペンタオース画分のＨＰＬＣチャートパターン

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ６⁴−Ｏ−Ｄ−グルコシルマルトペンタ
   オースを有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試
   薬。
2. 【請求項２】 α−アミラーゼ活性含有試料に６⁴−Ｏ
   −Ｄ−グルコシルマルトペンタオースを添加し、酵素反
   応によって生成するグルコ−スを定量することを特徴と
   するα−アミラーゼ活性の測定方法。