JPS637797A - α−アミラ−ゼの活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なα−アミラーゼ基質を用いたα−アミラ
ーゼの活性測定法に関する。

（従来の技術） 膵液や尿などの体液に含有されるα−アミラーゼの活性
を測定することにより、各種疾患の診断が行われている
。α−アミラーゼの活性測定法には９例えば、構造が既
知のマルトオリゴ糖（マルトチトラオース、マルトペン
タオース、マルトヘキサオースなど）を基質とする方法
がある。この方法によれば２例えば、試料に該マルトオ
リゴ糖とα−グルコシダーゼとを接触させる。すると。

検体中のα−アミラーゼが作用して基質からグルコース
が遊離する。マルトオリゴ糖としてマルトペンタオース
を用いた例を次に示す。

生成したグルコースは既知の方法１例えば、グルコース
オキシダーゼ／パーオキシダーゼ／色素系を利用する定
量法；ヘキソキナーゼ／ホスフォグルコムターゼ／グル
コース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ
系を利用する定量法；で測定される。α−グルコシダー
ゼはマルトペンタオースなどの四糖以上のオリゴ糖に作
用しにり＜。

マルトースやマルトトリオースなどの三糖以下のオリゴ
糖に良好に作用するため、グルコースを測定することに
よりα−アミラーゼの活性が測定されうる。しかし、α
−グルコシダーゼはわずかではあるが基質であるマルト
ペンタオースに作用するため、測定のブランク値が上昇
し、その結果。

測定値の誤差が大きくなるという欠点がある。α−グル
コシダーゼの基質分解作用のため、α−グルコシダーゼ
と基質とを一液化することは、試薬としての安定性が損
なわれるため好ましくない。

マルトオリゴ糖の還元性末端にフェニル基、ナフチル基
、またはそれらの誘導体をアグリコンとして結合させた
基質を用いる方法も提案されている。例えば、基質とし
てｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシド（特公昭５７
−５３０７９号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトへキ
サオシド（特公昭５７−５３０７９　号公ｉ）　、　　
ｐ−ニトロフェニルマルトへブタオシド（特開昭５４−
５１８９２号公報）、２．４−ジクロロフェニルマルト
ペンタオシド（特開昭５６−３５９９８号公報）などが
利用される。これらの基質を用いると、後述のように、
アグリコンが遊離するため２例えば遊離したｐ−ニトロ
フェノールを光学的に測定することにより、α−アミラ
ーゼの活性が容易に測定されうる。

代表的な基質を用いた場合の反応式を次に示す。

（１）　ｐ−ニトロフェニル−α−マルトペンタオシド
を基質とする場合 α−アミラーゼ ■ｐ−ニトロフェニ１１−α−マルトペンタオシドｐ−
ニトロフェニル−α−マルトシド　＋　マルトトリオー
ス■ｐ−ニトロフェニル−α−マルトシド　＋　マルト
トリオース＋２１２，４−ジクロロフェニル−β−マル
トペンタオシドを基質とする場合 α−アミラーゼ ■２，４−ジクロロフェニルーβ−マルトペンタオシＦ
２．４−ジクロＵフェニルーβ−マルトシド　＋　マル
トトリオース■２，４−シクＩ］ＴＪフェニル−β−マ
）シトシト　＋　マルトトリオース２．４−ジクＯ［Ｉ
フェノール　＋　グルゴース上記（１）および（２）の
いずれの方法においても、α−グルコシダーゼがわずか
ではあるが基質に作用するため、ブランク値が上昇する
欠点がある。α−グルコシダーゼの基質分解作用のため
、前記グルコースを測定する方法と同様にα−グルコシ
ダーゼと基質とを一液化することは難しい。

このような欠点を解消するため、マルトオリゴ糖の非還
元性末端のグルコースの６位のヒドロキシル基が修飾さ
れたタイプの基質を用いる方法が提案されている。例え
ば、特開昭６０−２３７９９８号公報には非還元性末端
のグルコースの６位のＯＨ基を例えば、ハロゲン原子、
　−ＯＲ，−０ＣＯＲ，−０ＳＯ□Ｒ１−ＮＨＲ（Ｒは
アルキル、フェニル、ピリジルなど）で置換し、還元性
末端のグルコースに置換または未置換のフェニル基がア
グリコンとして結合したマルトトリオースが基質として
開示されている。

還元性末端グルコースの６位の０１１基が置換されてい
るとα−グルコシダーゼによる基質の分解が起こらない
。

しかし、このように６位のみに置換基が導入された基質
は１合成が困難であり、収率も悪いという欠点がある。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。

その目的とするところは１体液などに存在するα−アミ
ラーゼの活性を精度よく前車な操作で測定する方法を提
供することにある。本発明の他の目的は１合成の容易な
非還元性末端グルコース修飾マルトオリゴシトを用いて
α−アミラーゼの活性を測定する方法を提供することに
ある。

（問題点を解決するための手段および作用）本発明のα
−アミラーゼの活性測定法は、非還元性末端グルコース
の４位および６位のヒドロキシル基が修飾されたα−フ
ヱニルマルトオリゴシドおよび／または非還元性末端グ
ルコースの４位および６位のヒドロキシル基が修飾され
たβ−フェニルマルトオリゴシトでなる次式（１）で示
される基質に、α−グルコシダーゼおよび／またはグル
コアミラーゼ、および必要に応じてβ−グルコシダーゼ
の共存下で試料を接触させて、遊離するフェノール系化
合物を測定することにより上記目的が達成される： ・・・（Ｉ） ここで、ＲＩおよびＲ２はそれぞれ独立してハロゲン原
子、　−ＯＲ，、−ＱＣ−Ｒ５または−０３０２−１？
。

を示し、Ｒ３およびＲ２は共同してポリメチレンジオキ
シ基または置換ポリメチレンジオキシ基を構成していて
もよ＜；Ｒ□は置換または未置換のフェニル基を示し；
ｎは１〜８の整数であり；Ｒ４は炭素数６〜１０のシク
ロアルキル基；Ｒ６はアルキル基、置換アルキル基、フ
ェニル基または置換フェニル基を示す。

本発明方法に用いられる基質の骨格となるマルトオリゴ
糖は３〜１０個の糖（式（Ｉ）のｎ＝１〜８に相当）か
ら形成される。マルトオリゴ塘としては、マルトトリオ
ース、マルトテトラオース。

マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプ
タオースなどがある。特にマルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース。

マルトヘプタオースが好適である。

マルトオリゴ糖の非還元性末端グルコースの置換基であ
るＲ、およびＲ２は同一の基であっても異なる基であっ
てもよい。Ｒ１＋　Ｒｚのうちハロゲン原子としては、
塩素、臭素、フン素、沃素などが挙げられる。Ｒ１＋　
Ｒｚが−ＯＲ，で示される基である場合には、　Ｒａは
炭素数６〜１０のシクロアルキル基である。このような
基（Ｒ１，ＲＺ）としてはシクロへキシルオキシ基、シ
クロヘプチルオキシ基、シクロオクチルオキシ基などが
ある。ＲＩ、Ｒｚが一００ＣＲｓまたは一０３Ｏｚ　、
Ｒｓで示される基である場合には。

Ｒ，はアルキル基、置換アルキル基、フェニル基または
置換フェニル基を示す。このようなＲ，、Ｒ２としては
、アルキルカルボキシ基、ベンゾイルオキシ基、アルキ
ル置換ベンゾイルオキシ基、アルコキシ置換ベンゾイル
オキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、フェニルスル
ホニルオキシ基、アルキル置換フェニルスルホニルオキ
シ（例えば、トシルオキシ）基、アルコキシ置換フェニ
ルスルホニルオキシ基などがある。Ｒ，、Ｉｈとは共同
してポリメチレンジオキシ基（−０−（ＣＩｌ□）ｌＩ
−０−）を形成していてもよい。ｍは２〜５の整数であ
る。メチレン基はアルキル基および／またはフェニル基
により置換されていてもよい。ポリメチレンジオキシ基
としてはエチレンジオキシ基、プロピレンジオキシ基、
イソプロピレンジオキシ基などが好ましい。

このような修飾マルトオリゴシトのアグリコンに相当す
るＲ３は置換または未置換のフェニル基である。Ｒ１は
還元性末端のグルコースの１位のＯＨ基にα型で結合し
ていてもよく、β型で結合していてもよい。置換フェニ
ル基とは、ハロゲン原子。

ヒドロキシ基、炭素原子数１〜６のアルキル基。

アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、ニド四基など
を有するフェニル基である。このような基を形成しうる
置換フェノール類としては１例えばり四ロフェノール、
ジクロロフェノール、ヒＦＯキシフェノール、アルキル
フェノール５アルコキシフエノール、ヒドロキシ安息香
酸、ニトロフェノール、ハロゲン化ニトロフェノール、
アルキル化ニトロフェノール、アルコキシ化ニトロフェ
ノール、ニトロ化ヒドロキシ安息香酸、ジニトロフェノ
ールなどが挙げられる。特に少なくとも１個のニトロ基
を有するフェノール類２例えば４−二トロフェノール、
２−クロロ−４−二トロフェノール、２．６−ジクロロ
−４−二トロフェノール。

２．６−ジプロモー４−二トロフェノール、２−ブロモ
−４−二トロフェノール、２−二トロフェノール、２−
ヒドロキシ−４−二トロフェノール。

３−ヒドロキシ−４−二トロフェノールなどが好適であ
る。

上記修飾α−（またはβ−）フェニルマルトオリゴシト
は新規化合物である。このような化合物としては１例え
ば次の化合物がある。〔〕内は略称である。

（ａ）４−ニトロフェニル０−４−デオキシ−４−クロ
ロ−６−ジオキシ−６−クロローα−Ｄ−グルコピラノ
シル＝　（（１−４）−０−α−Ｄ−グルコピラノシル
−）、−〇−β−Ｄ−グルコピラノシド 〔ジクロロ４−ニトロフェニル−β−マルトペンタオシ
ド〕 （′ｂ）２−クロロ−４−ニトロフェニル０−４−デオ
キシ−４−シクロへキシルオキシ−６−ジオキシ−６−
シクロへキシルオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（
（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー）、ｊ　
　Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド 〔ジシクロへキシルオキシ２−クロロ−４−二トロフェ
ニルーβ−マルトペンタオシド〕（Ｃ）４−ニトロフェ
ニル０−４−デオキシ−４−ｐ−１−ルエンスルホニル
オキシー０−６−ゾオキシー６−ｐ−トルエンスルホニ
ルオキシ−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー　（（１→
４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー）、−〇−α−
Ｄ−グルコピラノシド 〔シトシルオキシ４−ニトロフェニル−α−マルトヘプ
タオシド〕 （ｄ）２−クロロ−４−ニトロフェニル０−４−デオキ
シ−４−メチルカルボキシ−〇−６−ゾオキシー６−メ
チルカルボキシー０−α−Ｄ−グルコピラノシル−１（
１−４）　　−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−）３−
０−α−Ｄ−グルコピラノシド 〔ジメチルカルボキシ２−クロロ−４−二トロフェニル
ーα−マルトペンタオシド〕 （ｅ）２−クロロ−４−二トロフェニル０−４−デオキ
シ−４−エチルスルホニルオキシ−０−６＝デオキシ−
６−エチルスルホニルオキシー０−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシル
ー）３−０−α−Ｄ−グルコピラノシド 〔ジエチルスルホニルオキシ２−クロロ−４＝ニトロフ
ェニル−α−マルトペンタオシド〕（ｆ）２−クロロ−
４−ニトロフェニル４．６−０−４．６−エタンジイル
−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−（（１→４）−〇−
α−Ｄ−グルコピラノシルー）、−〇−α−Ｄ−グルコ
ピラノシド〔エタンジイル２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−α−マルトペンタオシド〕 本発明の基質は例えば次の方法で合成されうる。

例えば、上記基質のうち、（Ｃ）シトシルオキシ４−ニ
トロフェニル−α−マルトヘプタオシド（下記式（Ｉｎ
）　　；　　ｎ＝５　；α型結合）は、下記式（１１）
で示される化合物（ｎ＝５；α型結合）にｐ−１−ルエ
ンスルホニルクロライドを作用させて得られる。

ｆａ）のジクロロ４〜ニトロフェニル−β−マルトペン
タオシドは、上記（Ｉ［ｒ）で示される化合物（シトシ
ルオキシ４〜ニトロフエニル−β−マルトペンタオシド
；　ｎ　＝＝３　；β型結合）にさらにアンモニウムク
ロライドを作用させて得られる（Ｍｅｌｔｏｎ　；Ｃａ
ｒｂｏｈｙｄ、　Ｒｅｓ、　　井、　２９−３７　（１
９７１）　）　、　ｆａｔのようなジハロゲン置換化合
物にさらに安息香酸を作用させると、ハロゲンはベンゾ
イルオキシ基に置換される。このほか、（ｆ）のような
式（Ｉ）におけるＲ２とＲ２とが共同してポリメチレン
ジオキシ基を構成する化合物は、　（■）で示される化
合物に置換または未置換の炭素数２〜５のジハロゲン化
アルキルを作用させて得られる。例えば、エタンジイル
２−　クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトペンタ
オシドは、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトペン
タオシドに１．２−ジクロロエタンを作用させて得られ
る。

本発明に用いられるα−グルコシダーゼの起源は、特に
限定されない。動物、植物、微生物などから得られるα
−グルコシダーゼが利用され得る。

特に、酵母起源のα−グルコシダーゼは、マルトトリオ
シト以下のグルコシドによく作用し、かつマルトテトラ
オシド以上のグルコシドには作用しない点、およびアグ
リコンの特異性が広い点から好適に利用されうる。β−
グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼの起源も特に限
定されない。例エバ、アーモンドから得られるβ−グル
コシダーゼやりシブスプレマーから得られるグルコアミ
ラーゼが好適に利用されうる。

本発明方法によりα−アミラーゼの活性を測定するには
、上記基質；上記α−グルコシダーゼ。

グルコアミラーゼおよびβ−グルコシダーゼを適宜組み
合わせた酵素系（追随酵素系）；および必要に応じてそ
の他の添加物を含有する試薬にα−アミラーゼを含む試
料を接触させる。例えば、アグリコンがα型に結合した
基質（α型基質）を用いる場合には、追随酵素系として
はα−グルコシダーゼおよび／またはグルコアミラーゼ
が使用される。アグリコンがβ型に結合した基質（β型
基質）を用いる場合には、追随酵素系としては、α−グ
ルコシダーゼおよび／またはグルコアミラーゼに加えて
β−グルコシダーゼが使用される。本発明方法による基
質分解の反応式をジクロロ４−ニトロフェニル−α（ま
たはβ）−マルトペンタオシドを例に挙げて説明する。

（１）　’；　クロロ４−ニトロフェニル−α−マルト
ペンタオシドを基質とする場合 ４−ニトロフェニル−α−マルトシド　＋　ジクロロマ
ルトトリオース■４−ニトロフェニル−α−マルトシド
　＋　シクロＵマ）１トトリ才−スα−グルコシターセ
　およＵ／または　グルコ７ミラーセ４−ニトロフェノ
−１し ＋　グルコース　＋　ツク１１！ログ）ｌゴースｆ２）
　’；　’１０ロー４−二トロフェニルーβ−マルトペ
ンタオシドを基質とする場合 ４−ニトロフェニル−β−マルトシド　＋　シクロ■マ
ルトトリオース■４−ニトロフェニル−β−７１シトシ
ト　＋　シクロロマＩｔ）トリオースα−グルゴシター
セ　およＵ／または　グ１１コアミラーセ４−ニトロフ
ェニルー β−グルコシＦ　＋　グルコース　＋　シクロログ１シ
コースこのようにして遊離するフェノール系化合物（上
記例においては４−ニトロフェノール）を適当な手段に
より測定することにより、α−アミラーゼの活性が測定
される。遊離するフェノール系化合物が基質とは異なる
スペクトル吸収を示す場合には１反応混合物のスペクト
ルを直接測定する。

基質から遊離したフェノール系化合物が基質とほぼ同じ
スペクトル吸収を示す場合には、呈色試薬。

例えば４−アミノアンチピリンなどの化合物と酸化縮合
させ、その発色強度を測定する。フェノール系化合物の
測定方法としては、α−アミラーゼの反応を連続的に追
跡するレート法；および−定時間反応させた後１反応を
止めて測定する方法；のいずれもが使用されうる。

本発明方法における酵素反応時には、グルコアミラーゼ
はα−グルコシダーゼとほぼ同等の働きを有する。ただ
し、α−グルコシダーゼがマルトトリオシト以下の低分
子グリコシドにはよく作用するが、マルトテトラオシド
以上のグルコシドには作用しにくいのに対して、グルコ
アミラーゼはマルトテトラオシド以上のグルコシドにも
作用する。例えば、基質としてマルトヘプタオシド以上
の高分子グルコシドを用いると、マルトテトラオシド以
上のグルコシドが生成することがある。このようなマル
トテトラオシド以上のグルコシドは。

α−グルコシダーゼでは分解されないが、グルコアミラ
ーゼを用いるとグルコース単位にまで容易に分解される
。そのため測定系の感度が上昇する。

α−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを共存させ
た追随酵素系が好適に利用される。

本発明方法によれば非還元性末端グルコースの４位およ
び６位のヒドロキシル基が修飾されたα−マルトオリゴ
シトを基質として利用するため。

α−グルコシダーゼやグルコアミラーゼなどの追随酵素
系と基質を一液化した試薬を調製・保存してもこれらの
酵素が基質を分解することかはとんどない。そのため、
試薬ブランク値の上昇が抑制され、精度よくα−アミラ
ーゼ活性を測定することができる。

本発明の基質、特に（１）式のＲ７およびＲ２が同一の
基である基質は合成が容易であるため安価に提供されう
る。本発明方法は自動分析機を用いての連続測定も可能
であり、筒便かつ安価にα−アミラーゼ活性の測定がな
されうる。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

１１および　六　１−１〜１−２ 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０　ｍＭグッドバッツ７−　（ｐＨ７，０）α−グル
コシダーゼ　　　　　　　８００／ｍ１β−グルコシダ
ーゼ　　　　　　　１００／ｍｊ！基質（表１参照）　
　　　　　　　　　２　ｍＭ試薬調製直後、１０分後、
　２０分後および３０分後にこの試薬の４００ｎｍにお
ける吸光度を測定した（試薬３ｒ＋ｊ！；３７℃）。吸
光度の変化（ブランク値の経時変化）を表１に示す。

（以下余白） 表１から１本発明方法に用いられる非還元性末端が修飾
された基質を含有する試薬は、非還元性末端が修飾され
ていない基質を含有する試薬に比べてブランク値が低く
、その経時的な上昇の度合も極めて小さいことがわかる
。

ス１１日二」− 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０　ｍＭグツドバフファー（ｐＨ７，０）α−グルコ
シダーゼ　　　　　　　８０ＬＩ／ｍｊ２β−グルコシ
ダーゼ　　　　　　　１００／ｍ１基質（表２参照）　
　　　　　　　　　２　ｍＭこの試薬を用い、実施例１
と同様に吸光度の変化を測定した。次に、上記試薬３ｍ
ｌを試料血清５０μｌに添加し、３７℃にて５〜６分間
放置した後、　４００ｎｍにおける吸光度の変化を測定
し、１分間あたりの吸光度の変化（アミラーゼ活性の指
標となる）を算出した。試薬ブランク値の経時変化およ
び１分間あたりの吸光度の変化を表２に示す。

２施■叉二叉 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０　ｍＭグツドバッフｙ　−（ｐＨ７，０）α−グル
コシダーゼ　　　　　　　８００７ｍ＃基質（表２参照
）　　　　　　　　　　２　ｍＭこの試薬を用い、実施
例２−１と同様に操作を繰り返した。その結果を表２に
示す。

ル較■童 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０　ｍＭグツドバッフｙ　−（ｐＨ７，０）α−グル
コシダーゼ　　　　　　　８００／ｍｊ２グルコアミラ
ーゼ　　　　　　　　１０　Ｕ／ｍＩｌ基￥ｔ（表２参
照）　　　　’　　　　　　２　ｍＭこの試薬を用い、
実施例２−１と同様に操作を繰りかえした。その結果を
表２に示す。

・−３−１〜３−３．および　六１３ 下記組成の試薬を調製した。

試薬組成： ５０　ｍＭ　ＰＩＰＥＳバッファー（ａｌｌ　７．０）
α−グルコシダーゼ　　　　　　　８００／＋＋＋４！
基質（表２参照）　　　　　　　　　　２　ｍＭこの試
薬を用い、実施例２−１と同様に操作を繰りかえした。

その結果を表２に示す。

（以下余白） 表３から１本発明試薬（実施例２−１〜２−２゜３−１
〜３−３）は、非還元性末端が修飾されていない基質を
含有する試薬（比較例２．３）に比べてブランク値が低
く、その経時的な上昇の度合も極めて小さい。実施例２
−１においてはグルコアミラーゼが試薬中に含有される
ため、実施例２−２に比べて、測定感度が高くなってい
るのが確認、される。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、特定の構造を有するα−
フェニルマルトオリゴシトを基質として簡便かつ精度良
くα−アミラーゼの測定が行われる。本発明に使用され
る基質は１合成が容易であるため、α−アミラーゼの測
定が安価になされうる。本発明方法を用いた体液中のα
−アミラーゼの測定は、各種疾、愚の診断などに利用さ
れうる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、非還元性末端グルコースの４位および６位のヒドロ
   キシル基が修飾されたα−フェニルマルトオリゴシドお
   よび／または非還元性末端グルコースの４位および６位
   のヒドロキシル基が修飾されたβ−フェニルマルトオリ
   ゴシドでなる次式（ I ）で示される基質に、α−グル
   コシダーゼおよび／またはグルコアミラーゼ、および必
   要に応じてβ−グルコシダーゼの共存下で試料を接触さ
   せて、遊離するフェノール系化合物を測定することを特
   徴とするα−アミラーゼの活性測定法：▲数式、化学式
   、表等があります▼ ここで、Ｒ＿１およびＲ＿２はそれぞれ独立してハロゲ
   ン原子、−ＯＲ＿４、▲数式、化学式、表等があります
   ▼または−ＯＳＯ＿２−Ｒ＿５を示し、Ｒ＿１およびＲ
   ＿２は共同してポリメチレンジオキシ基または置換ポリ
   メチレンジオキシ基を構成していてもよく；Ｒ＿３は置
   換または未置換のフェニル基を示し；ｎは１〜８の整数
   であり；Ｒ＿４は炭素数６〜１０のシクロアルキル基；
   Ｒ＿５はアルキル基、置換アルキル基、フェニル基また
   は置換フェニル基を示す。