JPH05208989A - マルトオリゴ糖誘導体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 式（Ｉ） （式中、Ｒ₁ ，Ｒ₂ 水素，β−ガラクトピラノシル基
を、ｎは１〜７の整数。）で表わされるマルトオリゴ糖
誘導体およびその製造法並びにマルトオリゴ糖誘導体を
含有するα−アミラーゼ活性測定用試薬。 【効果】 マルトオリゴ糖誘導体は、水溶性に優れ、α
−グルコシダーゼやグルコアミラーゼ等の追随酵素の作
用を殆ど受けないので、基質と酵素とを一液化した製剤
とすることが容易であり、測定精度が良好なα−アミラ
ーゼ活性測定用試薬が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なマルトオリゴ糖
誘導体およびその製造法ならびに該マルトオリゴ糖誘導
体を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定試薬に関
する。

【０００２】

【従来の技術】膵液や尿などの体液に含有されるα−ア
ミラーゼの活性を測定することにより、各種疾患の診断
が行われている。α−アミラーゼの活性測定法には、例
えばマルトオリゴ糖（マルトテトラオース、マルトペン
タオース、マルトヘキサオースなど）を基質とする方法
がある。この方法では、α−アミラーゼ含有試料に該マ
ルトオリゴ糖とα−グルコシダーゼとを作用させて基質
からグルコースを遊離させ、グルコースの量を測定する
ことにより、α−アミラーゼの活性値を知る。生成した
グルコースは、例えばグルコースオキシダーゼ／パーオ
キシダーゼ／色素系を利用する定量法：ヘキソキナーゼ
／ホスフォグルコムターゼ／グルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ系を利用する測定法な
どにより測定される。

【０００３】α−グルコシダーゼはマルトペンタオース
などの四糖以上のオリゴ糖に作用しにくくマルトースや
マルトトリオースなどの三糖以下のオリゴ糖に良好に作
用するため、上記基質を使用してグルコースを測定する
ことによりα−アミラーゼの活性を測定することができ
る。しかし、α−グルコシダーゼはわずかではあるが基
質であるマルトペンタオースに作用するため、測定のブ
ランク値が上昇し、その結果、測定値の誤差が大きくな
るという欠点がある。α−グルコシダーゼの基質分解作
用のため、α−グルコシダーゼと基質とを一液化するこ
とは、試薬としての安定性が損なわれるため好ましくな
い。

【０００４】マルトオリゴ糖の還元性末端にフェニル
基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコンと
して結合させた基質を用いる方法も提案されている。例
えば、基質としてｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシ
ド（特公昭５７−５３０７９号公報）、ｐ−ニトロフェ
ニルマルトヘキサオシド（特公昭５７−５３０７９号公
報）、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（特公昭
６２−５０１１９号公報）、２，４−ジクロロフェニル
マルトペンタオシド（特公昭５９−１３１９９号公報）
などが利用されている。これらの基質を用いると、アグ
リコンが遊離し、遊離したアグリコン、例えばｐ−ニト
ロフェノールを光学的に測定することにより、α−アミ
ラーゼの活性を容易に測定することができる。上記方法
においても、α−グルコシダーゼがわずかではあるが基
質に作用するため、ブランク値が上昇する欠点がある。
α−グルコシダーゼの基質分解作用のため、前記グルコ
ースを測定する方法と同様にα−グルコシダーゼと基質
とを一液化することは難しい。

【０００５】このような欠点を解消するため、マルトオ
リゴ糖の非還元性末端のグルコースの６位のヒドロキシ
ル基が修飾されたタイプの基質を用いる方法が提案され
ている。例えば特開昭６０−２３７９９８号公報には非
還元性末端のグルコースの６位のＯＨ基を、例えばハロ
ゲン原子、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＳＯ₂ Ｒ−、−Ｎ
ＨＲ（Ｒはアルキル基、フェニル基、ピリジル基など）
で置換し、還元性末端のグルコースに置換または未置換
のフェニル基がアグリコンとして結合したマルトオリゴ
シドが基質として開示されている。非還元性末端グルコ
ースの６位のＯＨ基が置換されているとα−グルコシダ
ーゼによる基質の分解が起こらない。しかし、このよう
に６位のみに置換基が導入された基質は、化学合成が困
難であり、収率も悪いという欠点がある。

【０００６】また特開昭６０−５４３９５号公報には非
還元性末端のグルコースの４位および６位のＯＨ基をア
ルキル基、アルコイル基またはフェニル基で置換し、還
元性末端のグルコースにアグリコンを結合させたマルト
オリゴ糖を基質として用いることが開示されている。非
還元性末端グルコースの４位および６位のＯＨ基が置換
されているとα−グルコシダーゼによる基質の分解が生
じ難い。しかし、このような基質は２つのＯＨ基が置換
されているため、水溶性が悪く高濃度溶液の調製が不可
能であり、α−アミラーゼ活性測定に十分な濃度を溶解
することができないという欠点がある。

【０００７】この欠点を改善するものとして、３−ケト
ブチリデン基、２−ケトブチリデン基、２−ケトプロピ
リデン基、４−ケトペンチリデン基、メチルスルフィニ
ルエチリデン基、エチルスルフィニルエチリデン基、メ
タンスルホニルエチリデン基、エタンスルホニルエチリ
デン基の如き水溶性の高い修飾基を非還元性末端グルコ
ースに導入した基質を用いる方法が提案されている（特
開平１−１５７９９６号）。しかし、これらの基質は水
溶性には優れているが、澱粉やアミロース等のグルコー
ス鎖を認識して、その結合を切断するα−アミラーゼの
作用様式を純粋に反映していない欠点がある。

【０００８】一方、ｐ−ニトロフェニル α−マルトペ
ンタオサイドの非還元性末端グルコースにガラクトース
をβ結合させた基質を用いる方法が報告されている（日
本農芸化学会誌講演要旨集第６５巻、第３号、第１１７
頁、１９９１年、及び特開平３−２６４５９６号公
報）。しかしながら、この基質を用いる場合、発色基と
して用いたｐ−ニトロフェノールのα−アミラーゼ活性
測定域（ｐＨ７．０）付近におけるモル吸光係数（以
下、εという）が、最大εの約半分しかなく、しかもわ
ずかなｐＨ変動によってεが大きく変化したり、温度、
塩化ナトリウム量またはアルブミン量が変化するとεも
変動するため測定誤差が生ずるというような問題がある
上に、アミラーゼ活性測定試薬として用いるときの感度
が十分でないという欠点もある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来のα
−アミラーゼ活性測定基質の欠点、従来のα−アミラー
ゼ活性測定試薬の欠点などを解消しようとするものであ
り、その目的とするところは、基質と追随酵素の一液化
条件においてα−グルコシダーゼなどの追随酵素の作用
を受けず、合成が容易であり、水溶性に優れ、かつアミ
ラーゼの作用様式をより純粋に反映する基質としての新
規マルトオリゴ糖誘導体およびその製造法を提供するこ
とであり、また当該新規マルトオリゴ糖誘導体を基質と
して用いて体液中のα−アミラーゼ活性を精度よく簡単
な操作で測定する試薬を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の要旨を
有するものである。

【００１１】(1) 一般式（Ｉ）

【００１２】

【化１７】

【００１３】（式中、Ｒ₁ およびＲ₂ は互いに異なる水
素またはβ−ガラクトピラノシル基を、ｎは１〜７の整
数を示す。）で表わされるマルトオリゴ糖誘導体。

【００１４】(2) 一般式（Ｉ）：

【００１５】

【化１８】

【００１６】（式中、Ｒ₁ およびＲ₂ は互いに異なる水
素またはβ−ガラクトピラノシル基を、ｎは１〜７の整
数を示す。）で表わされるマルトオリゴ糖誘導体を含有
することを特徴とするα−アミラーゼ活性測定用試薬。

【００１７】(3) 一般式（II) ：

【００１８】

【化１９】

【００１９】（式中、ｎは１〜７の整数を示す。）で表
わされるマルトオリゴ糖誘導体とラクトースとをβ−ガ
ラクトシダーゼの存在下に反応させることを特徴とする
下記一般式（Ｉ）：

【００２０】

【化２０】

【００２１】（式中、Ｒ₁ およびＲ₂ は互いに異なる水
素またはβ−ガラクトピラノシル基を、ｎは１〜７の整
数を示す。）で表わされるマルトオリゴ糖誘導体の製造
法。

【００２２】(4) 一般式(III) または一般式（IV）：

【００２３】

【化２１】

【００２４】

【化２２】

【００２５】（式中、ｎは１〜７の整数を示す。）で表
されるマルトオリゴ糖誘導体の製造法において、一般式
(V) または一般式(VI)：

【００２６】

【化２３】

【００２７】

【化２４】

【００２８】（式中、ｎは１〜７の整数を示す。）で表
されるガラクトシルマルトオリゴ糖を有機媒体の存在
下、もしくは無溶媒の下に、アルカリ及び無水酢酸とと
もに加熱してアセチル化する工程、得られた一般式(VI
I) または一般式 (VIII):

【００２９】

【化２５】

【００３０】

【化２６】

【００３１】（式中、ｎは１〜７の整数を示す。Ａｃは
アセチル基を示す。）で表されるアセチル化ガラクトシ
ルマルトオリゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノール
を有機溶媒中、酸触媒とともに加熱する工程、次いで得
られた反応生成物のアセチル基を脱離する工程を含むこ
とを特徴とするマルトオリゴ糖誘導体の製造法。

【００３２】(5)一般式(III) または一般式(IV):

【００３３】

【化２７】

【００３４】

【化２８】

【００３５】（式中、ｎは１〜７の整数を示す。）で表
されるマルトオリゴ糖誘導体の製造法において、マルト
オリゴ糖およびラクトースをβ−ガラクトシダーゼの存
在下に反応させて得られた一般式(V) または一般式(V
I):

【００３６】

【化２９】

【００３７】

【化３０】

【００３８】（式中、ｎは１〜７の整数を示す。) で表
されるガラクトシルマルトオリゴ糖を有機媒体の存在
下、もしくは無溶媒の下に、アルカリ及び無水酢酸とと
もに加熱してアセチル化する工程、得られた一般式(VI
I) または一般式 (VIII):

【００３９】

【化３１】

【００４０】

【化３２】

【００４１】（式中、ｎは１〜７の整数を示す。Ａｃは
アセチル基を示す。）で表されるアセチル化ガラクトシ
ルマルトオリゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノール
を有機溶媒中、酸触媒とともに加熱する工程、次いで得
られた反応生成物のアセチル基を脱離する工程を含むこ
とを特徴とするマルトオリゴ糖誘導体の製造法。

【００４２】本発明におけるマルトオリゴ糖誘導体
（Ｉ）〔以下、一般式(III) 及び一般式(IV)で表される
マルトオリゴ糖誘導体を含めてマルトオリゴ糖誘導体
（Ｉ）という。〕の骨格となるマルトオリゴ糖は、３〜
１０個の糖〔式（Ｉ）のｎ＝１〜７に相当〕から形成さ
れる。マルトオリゴ糖としては、マルトトリオース、マ
ルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサ
オース、マルトヘプタオースなどがあり、特にマルトテ
トラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス、マルトヘプタオースが好適である。これらの中で
も、マルトテトラオース骨格を有するマルトオリゴ糖
は、膵臓由来α−アミラーゼ、唾液由来α−アミラーゼ
による水解切断酵素が一箇所であり、反応機序が明確で
あり、膵臓由来α−アミラーゼ、唾液由来α−アミラー
ゼの基質水解作用に差がない。

【００４３】マルトオリゴ糖の非還元性末端グルコース
の修飾基であるガラクトースは、非還元性末端グルコー
スの４位または６位の水酸基にβ型で結合している。

【００４４】本発明のマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）は新
規な化合物であり、還元性末端を２−クロロ−４−ニト
ロフェノールで置換されたマルトオリゴ糖誘導体（II)
とラクトースをβ−ガラクトシダーゼ共存下に反応させ
て製造することができる。反応は、ｐＨ３〜１０、好ま
しくは５〜８、温度０〜８０℃、好ましくは３０〜５０
℃で１分以上、好ましくは２０〜１２０分間行なう。次
いで、酵素反応を止めた後、反応液を分取用ＨＰＬＣ等
により分別し、精製することによって本発明のマルトオ
リゴ糖誘導体（Ｉ）が得られる。ここで用いるβ−ガラ
クトシダーゼの起源については特に限定はなく、動植
物、微生物などから得られるものがいずれも使用でき
る。

【００４５】また本発明のマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）
は、非還元性末端グルコースがガラクトース修飾された
マルトオリゴ糖誘導体を２−クロロ−４−ニトロフェノ
ールと反応させることにより合成することもできる。

【００４６】非還元性末端がガラクトース修飾されたガ
ラクトシルマルトオリゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフ
ェノールとの反応は、まず該ガラクトシルマルトオリゴ
糖を通常の方法によってアセチル化し、このアセチル化
ガラクトシルマルトオリゴ糖と２−クロロ−４−ニトロ
フェノールとを例えば塩化亜鉛の存在下に沸騰水浴中で
１時間程度反応させることによって行うことができる。
その後冷却し、ベンゼンで抽出して、これを水、５％カ
セイソーダ、水で順次洗浄した後、乾燥し、無水アルコ
ールにより再結晶させる。次いで、無水メタノールに溶
解させ、ナトリウムメチラートを加えて微煮沸すれば脱
アセチル化されるので、溶媒を留去し、熱水より再結晶
すれば本発明のマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）が得られ
る。

【００４７】具体的には、以下の方法が挙げられる。一
般式(V) または一般式(VI)で表されるガラクトシルマル
トオリゴ糖を有機媒体の存在下、もしくは無溶媒の下
に、アルカリおよび無水酢酸とともに加熱してアセチル
化する。該反応により、一般式(VII) または一般式(VII
I)で表されるアセチル化ガラクトシルマルトオリゴ糖が
得られる。

【００４８】この場合の有機媒体としては、塩化メチレ
ン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、エーテル、酢
酸エチルエステル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどが用いられ
る。アルカリとしては、酢酸ナトリウム、トリエチルア
ミン、ピリジンなどが用いられる。アセチル化反応の条
件は、室温〜１５０℃で、好ましくは酢酸ナトリウムを
用いた場合、９０〜１２０℃、ピリジンを用いた場合、
室温〜６０℃である。

【００４９】次に、得られた一般式(VII) または一般式
(VIII)で表されるアセチル化ガラクトシルマルトオリゴ
糖を２−クロロ−４−ニトロフェノールとともに有機溶
媒中、酸触媒の存在下で加熱する。該反応により、２−
クロロ−４−ニトロフェニル基が還元性末端グルコース
にα結合あるいはβ結合した反応生成物（２−クロロ−
４−ニトロフェニル（ＣＮＰ化）ガラクトシルマルトオ
リゴ糖保護体ともいう。）が得られる。

【００５０】この場合の有機溶媒としては、塩化メチレ
ン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、エーテル、酢
酸エチルエステルなどが用いられる。酸触媒としては、
ＺｎＣｌ₂ 、ＳｎＣｌ₄ 、ＴｉＣｌ₄ などのルイス酸も
しくは、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸な
どの有機スルホン酸などが用いられる。上記反応条件
は、室温〜２００℃、好ましくは３０〜１２０℃であ
る。２−クロロ−４−ニトロフェニル基は反応条件によ
りα結合あるいはβ結合させることができる。

【００５１】本発明では、さらに上記工程で得られた反
応生成物のアセチル基をメタノール中で触媒量のナトリ
ウムメチラートによる公知の脱保護反応により脱離し
て、一般式(III) または一般式(IV)で表されるマルトオ
リゴ糖誘導体を得る。他の脱離反応としては、無水メタ
ノール中、陰イオン交換樹脂あるいは無水メタノール
中、トリエチルアミンを用いる方法が挙げられる。

【００５２】上記反応で使用される一般式(V) または一
般式(VI)で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖は、例
えばマルトテトラオース、マルトペンタオース等のグル
コース数２〜９個からなるマルトオリゴ糖を原料とし、
基質としてラクトースを用いたβ−ガラクトシダーゼ反
応の結果切断されて生じるガラクトシル基をマルトオリ
ゴ糖の非還元性末端グルコースの４位あるいは６位に導
入することによって得ることができる。

【００５３】β−ガラクトシダーゼを使用する条件は、
ｐＨ５〜９の緩衝液、好ましくはｐＨ６〜８の緩衝液
中、温度１５〜６０℃、反応時間約１０〜１００時間で
ある。反応条件により４位あるいは６位に選択的にβ−
ガラクトシル基を導入することができる。

【００５４】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬
は、上記マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）を基質として含有
するものである。また通常当該試薬は、さらにα−グル
コシダーゼ、グルコアミラーゼおよびβ−グルコシダー
ゼを適宜組み合わせた酵素系（追随酵素系）、および必
要に応じてその他の添加剤を含有していてもよい。

【００５５】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬に
おいては、２−クロロ−４−ニトロフェニル基とグルコ
ース鎖のグリコシド結合はα型、β型どちらでもかまわ
ないが、α型結合のものより、β型結合のものの方が水
溶性に優れるため、基質の製剤化に有利である。

【００５６】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬に
おいて用いられるα−グルコシダーゼの起源は、特に限
定されない。動物、植物、微生物などから得られるα−
グルコシダーゼが利用され得る。特に、酵母起源のα−
グルコシダーゼは、マルトトリオシド以下のグリコシド
によく作用し、かつマルトテトラオシド以上のグリコシ
ドには作用しにくい点、およびアグリコンの特異性が広
い点から好適に使用されうる。

【００５７】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬に
おいて用いられるβ−グルコシダーゼおよびグルコアミ
ラーゼの起源も特に限定されない。例えば、アーモンド
から得られるβ−グルコシダーゼやリゾプスデレマー
（Rhiz. delemar)から得られるグルコアミラーゼが好適
に使用されうる。

【００５８】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬を
用いたα−アミラーゼ活性の測定は、例えば次のように
して行われる。即ち、α−アミラーゼ活性測定用試薬に
α−アミラーゼを含む試料を作用させる。

【００５９】追随酵素系としては、α−グルコシダーゼ
および／またはグルコアミラーゼおよび必要によりβ−
グルコシダーゼが使用される。

【００６０】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬を
使用する測定方法における基質分解の反応式を、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−β−マルトペンタオシドを基質とする場合
を例にあげて説明する。

【００６１】

【化３３】

【００６２】上記反応にて遊離した２−クロロ−４−ニ
トロフェノールを適当な手段により測定することによっ
てα−アミラーゼの活性を測定することができる。遊離
する２−クロロ−４−ニトロフェノールが基質とは異な
るスペクトル吸収を示す場合には、反応混合物のスペク
トルを直接測定する。

【００６３】２−クロロ−４−ニトロフェノールの測定
方法としては、α−アミラーゼの反応を連続的に追跡す
るレート法および一定時間反応させた後、反応を止めて
測定するエンドポイント法のいずれもが使用されうる。

【００６４】前記の酵素反応時には、グルコアミラーゼ
はα−グルコシダーゼとほぼ同等の働きを有する。ただ
し、α−グルコシダーゼがマルトトリオシド以下の低分
子グリコシドにはよく作用するが、マルトテトラオシド
以上のグリコシドには作用しにくいのに対して、グルコ
アミラーゼはマルトテトラオシド以上のグリコシドにも
作用する。例えば基質としてマルトヘプタオシド以上の
高分子グリコシドを用いると、α−グルコシダーゼの作
用によりマルトテトラオシド以上のグリコシドが生成す
ることがある。このようなマルトテトラオシド以上のグ
リコシドは、α−グルコシダーゼでは分解されにくい
が、グルコアミラーゼを用いるとグルコース単位にまで
容易に分解される。そのため測定系の感度が上昇すると
いう利点があるので、α−グルコシダーゼおよびグルコ
アミラーゼを共存させて必要によりβ−グルコシダーゼ
を共に用いる追随酵素系は好適に利用される。

【００６５】

【発明の効果】本発明の試薬によれば、非還元性末端グ
ルコースの４位または６位のＯＨ基がガラクトースで修
飾されたα−またはβ−マルトオリゴシド、即ちマルト
オリゴ糖誘導体（Ｉ）を基質として利用するため、α−
グルコシダーゼやグルコアミラーゼなどの追随酵素系と
基質を一液化した試薬を調製、保存してもこれらの酵素
が基質を分解することがほとんどない。そのため、試薬
ブランク値の上昇が抑制され、精度よくα−アミラーゼ
活性を測定することができる。本発明のα−アミラーゼ
活性測定用試薬の基質であるマルトオリゴ糖誘導体
（Ｉ）は、非還元性末端グルコースの４位または６位の
水酸基に結合したガラクトースが水溶性基であるため、
水に対する溶解性が優れている。また、本発明の基質
は、酵素を用いて選択的に収率良く合成することができ
るため、安価に提供され得る。更に、本発明のα−アミ
ラーゼ活性測定用試薬の基質であるマルトオリゴ糖誘導
体（Ｉ）は、非還元性末端の修飾基がガラクトースであ
るため、α−アミラーゼの当該誘導体に対する作用様式
は、澱粉やアミロース等のグルコース鎖を認識してその
結合を切断するα−アミラーゼ本来の作用様式に近い状
態で反映され、中でも非還元性末端グルコースの４位の
ＯＨ基が、ガラクトースで修飾されたマルトオリゴ糖誘
導体を基質とした場合、６位のＯＨ基がガラクトースで
修飾されたマルトオリゴ糖誘導体よりも、α−アミラー
ゼの反応性は高くなり好ましい。また、本発明のマルト
オリゴ糖誘導体（Ｉ）から遊離する発色基は、２−クロ
ロ−４−ニトロフェノールであり、従来の基質から生じ
るｐ−ニトロフェノールで問題となっていたαアミラー
ゼ測定域、ｐＨ７．０付近での感度、ｐＨ、塩化ナトリ
ウム濃度、アルブミン濃度などの変動等による測定誤差
などの問題が解消される。

【００６６】なお本発明試薬によれば、自動分析機を用
いての連続測定も可能であり、簡便かつ安価にα−アミ
ラーゼ活性の測定がなされうる。

【００６７】またマルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）の製造法
において、本発明で示すラクトースを基質とするβ−ガ
ラクトシダーゼの酵素反応を用いたガラクトシルマルト
オリゴ糖の合成は、ｐ−ニトロフェニルマルトペンダオ
シドを原料とする従来の反応と比べて、ガラクトシル基
が２個導入される副反応がはるかに少ない。また、得ら
れるガラクトシルマルトオリゴ糖の収率も大幅に上昇
し、従来法と違って副生物との分離精製も容易である。
更に、次のアセチル化反応においては副反応が少なく、
得られる本発明の２−クロロ−４−ニトロフェニル（Ｃ
ＮＰ化）ガラクトシルマルトオリゴ糖保護体は、未反応
の原料と極性が離れているため、精製が容易で１回のシ
リカゲルカラムクロマトグラフィーによって十分精製さ
れる。本発明ではガラクトシル基を非還元性末端グルコ
ースの４位あるいは６位にβ結合したマルトオリゴ糖
(V) または(VI)を原料にすることにより、マルトオリゴ
糖誘導体（Ｉ）の収率が上昇し、副生物もしくは未反応
の原料の混入による精製の困難さが解消された。

【００６８】すなわち本発明により得られるマルトオリ
ゴ糖誘導体（Ｉ）は、マルトオリゴ糖の非還元性末端グ
ルコースの４位または６位にガラクトシル基をβ−ガラ
クトシダーゼにより導入した原料(V) また(VI)を使用
し、第一工程でアセチル基によりヒドロキシル基を保護
し、第二工程で２−クロロ−４−ニトロフェノールを作
用させた後、アセチル基を脱離して目的物が得られる方
法であって、従来法で問題となっていた精製除去の困難
な副生物が少なく、収率のよい製造法である。

【００６９】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明がこれら実施例に限定されるものでない
ことは言うまでもない。

【００７０】実施例１（合成例） ２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−β−マルトペンタオシドの製造例：
２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトペンタオ
シド１ｇおよびラクトース１ｇを５０ｍＭアセテート緩
衝液（ｐＨ６．０）５mlに溶解した。Bacilluscirculan
s由来のβ−ガラクトシダーゼ溶液（６５ｕ／ml）２５
０μｌを加えて、４０℃、９０分インキュベーションし
た。１００℃で１０分間処理して酵素反応を止めた。こ
の酵素反応液を分取用ＨＰＬＣで精製した。図１は、上
記の酵素反応液の精製前の分析用ＨＰＬＣのチャートで
ある。分取用ＨＰＬＣによる精製は、図１における分析
用ＨＰＬＣのリテンションタイム２７．２４分のピーク
に相当するフラクションを集め、ロータリーエバポレー
ターでメタノールを減圧留去し、残った水溶液を凍結乾
燥することにより行って無色または淡黄色の粉末を得
た。

【００７１】以下に分取および分析用ＨＰＬＣの条件を
示す。 （分取条件） カラム ：SH-345-5 S-5 120A AQ (22×500mm) 溶出溶媒 ：メタノール／水＝２０／８０ 流速 ：７ml／分 カラム温度：４５℃ （分析条件） カラム ：ODS-AQ (4.6 ×250mm) 溶出溶媒 ：メタノール／水＝２０／８０ 流速 ：０．５ml／分 カラム温度：４５℃

【００７２】５００ＭＨｚ ¹Ｈ−ＮＭＲ；δ値（分裂
型、相対プロトン数） 3.5 〜4.0 （多重線，３６） 4.453 （二重線，１） 注：β−ガラクトシル基のアノマー水素 5.343 （二重線，１） 注：β−グルコシル基のアノマー水素 5.385 （二重線，１） 注：α−グルコシル基のアノマー水素 5.389 （二重線，１） 注：α−グルコシル基のアノマー水素 5.393 （二重線，１） 注：α−グルコシル基のアノマー水素 5.445 （二重線，１） 注：α−グルコシル基のアノマー水素 7.42 （二重線，１） 8.24 （ダブル二重線，１） 8.43 （二重線，１）

【００７３】実施例２（合成例） ２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−β−マルトペンタオシドの製造例：
２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトペンタオ
シド１ｇおよびラクトース１ｇを５０ｍＭアセテート緩
衝液（ｐＨ６．０）５mlに溶解した。Bacilluscirculan
s由来のβ−ガラクトシダーゼ溶液（１９５ｕ／ml）２
５０μｌを加えて、４０℃、９０分インキュベーション
した。１００℃で１０分間処理して酵素反応を止めた。
この酵素反応液を分取用ＨＰＬＣで精製した。図２は、
上記の酵素反応液の精製前の分析用ＨＰＬＣのチャート
である。分取用ＨＰＬＣによる精製は、図２における分
析用ＨＰＬＣのリテンションタイム２４．２９分のピー
クに相当するフラクションを集め、ロータリーエバポレ
ーターでメタノールを減圧留去し、残った水溶液を凍結
乾燥することにより行って無色または淡黄色の粉末を得
た。

【００７４】以下に分取および分析用ＨＰＬＣの条件を
示す。 （分取条件） カラム ：SH-345-5 S-5 120A AQ (22×500mm) 溶出溶媒 ：メタノール／水＝２０／８０ 流速 ：７ml／分 カラム温度：４５℃ （分析条件） カラム ：ODS-AQ (4.6 ×250mm) 溶出溶媒 ：メタノール／水＝２０／８０ 流速 ：０．６ml／分 カラム温度：４５℃

【００７５】５００ＭＨｚ ¹Ｈ−ＮＭＲ；δ値（分裂
型、相対プロトン数） 3.5 〜4.0 （多重線，３５） 4.20 （ダブル二重線，１） 注：ジェミナルカッ
プリングしているため６位の水素の片方であり、通常よ
り低磁場シフトしているため、β（１−６）結合してい
ることが証明できる。また、もう一方の６−位の水素
は、COSYスペクトル実験よりδ値3.88と帰属した。） 4.424 （二重線，１） 注：β−ガラクトシル基のアノマー水素 5.342 （二重線，１） 注：β−グルコシル基のアノマー水素 5.366 （二重線，１） 注：α−グルコシル基のアノマー水素 5.373 （二重線，１） 注：α−グルコシル基のアノマー水素 5.389 （二重線，１） 注：α−グルコシル基のアノマー水素 5.445 （二重線，１） 注：α−グルコシル基のアノマー水素 7.42 （二重線，１） 8.24 （ダブル二重線，１） 8.43 （二重線，１）

【００７６】実施例３ 前記実施例１および２で得られたマルトオリゴ糖誘導体
（表１に記載）を基質として用い、下組組成からなるα
−アミラーゼ活性測定試薬をそれぞれ調製した。 試薬組成Ａ： ５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ ９０ｕ／ml β−グルコシダーゼ １２ｕ／ml ＣａＣｌ₂ １ｍＭ 基質 ２ｍＭ 試薬組成Ｂ： ５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０） グルコアミラーゼ ２ｕ／ml α−グルコシダーゼ ９０ｕ／ml β−グルコシダーゼ １２ｕ／ml ＣａＣｌ₂ １ｍＭ 基質 ２ｍＭ なお比較例１、２及び３として表１に示した基質を用い
て上記と同様の試薬を調製した。

【００７７】

【表１】

【００７８】実験例１ 表１に示された各試薬３mlに三種類の血清１、２および
３をそれぞれ0.25ml添加し、３７℃にて３分間放置した
のち、４１５ｎｍにおける吸光度の変化を測定し、１分
間当たりの吸光度の変化を算出した。その結果を表２に
示した。なお、表２には試薬ブランクの１分間当たりの
吸光度の変化も併せて記載した。

【００７９】

【表２】

【００８０】表２に示した結果から明らかな如く、本発
明の試薬は試薬ブランクにおける１分間当たりの吸光度
変化が比較例、特に比較例１ａおよび１ｂに比べて非常
に低く、本発明のマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末端
がブロックされているため追随酵素の作用を受けていな
いことが判る。また、本発明の試薬の測定感度が、比較
例２ａおよび２ｂよりもそれぞれ高いことから、本発明
のマルトオリゴ糖誘導体は、３−ケトブチリデン ２−
クロロ−４−ニトロフェニル β−マルトペンタオシド
よりもアミラーゼに対する反応性が高いことが判るが、
これは本発明のマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末端
が、より天然の基質に近いガラクトースであるため、α
−アミラーゼの作用様式をより純粋に反映しているから
であると考えられる。

【００８１】実験例２ 基質製剤化の適性を調べるため、後記表３に示した各基
質の水溶性を調べた。実施例３で示した試薬組成Ａにお
いて、基質の濃度が１００ｍＭとなるように、表３の各
基質を溶解させた。その結果を表３に示した。

【００８２】

【表３】

【００８３】上記の結果より、本発明のマルトオリゴ糖
誘導体が水溶性に優れ、基質製剤化に好適であることが
判る。

【００８４】次の実施例４において、β−ガラクトース
が１，４−結合された化合物を示すが、反応条件により
１，６−結合した化合物も得られる。

【００８５】実施例４ （Ａ） β−（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオ
ースの製造 マルトテトラオース１ｇおよびラクトース１ｇを５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）５ｍｌに溶解した。バチル
ス・サーキュランス(Basillus circulans)由来のβ−ガ
ラクトシダーゼ溶液（６５単位／ｍｌ）２５０μｌを加
えて、４０℃、９０分インキュベートした。１００℃で
１０分間処理し酵素反応を止めた。この酵素反応液を、
トヨパールＨＷ−４０Ｓカラムで精製した後（溶離液：
水、流速１．４ｍｌ／分）凍結乾燥し、２５０ｍｇの白
色粉末を得た。得られた反応生成物は、β−（１，４）
−ガラクトシルマルトテトラオース（一般式(VI)、ｎ＝
２、１００％）であった。得られたβ−（１，４）−ガ
ラクトシルマルトテトラオースのＨＰＬＣ分析の結果を
図３に示す。図３には還元性末端グルコースがα−Ｄ−
グルコピラノースである化合物とβ−Ｄ−グルコピラノ
ースである化合物が示され、２個のガラクトシル基が入
ってないことが明らかである。なお、分析条件はカラ
ム：YMC-PACK AQ-303 4.6×25cm、溶離液：水、流速：
１．０ｍｌ／分、温度：室温、検出器：ＲＩである。

【００８６】（Ｂ） β−（１，４）−ガラクトシルマ
ルトテトラオース保護体の製造 上記工程で得られたβ−（１，４）−ガラクトシルマル
トテトラオシド１ｇおよび酢酸ナトリウム２００ｍｇを
酢酸無水物に懸濁し、１００℃〜１１０℃で５時間加熱
してアセチル化した。冷却後、冷水に注ぎ、一夜放置し
た。析出する結晶を吸引濾過し、真空下でよく乾燥させ
た。収率約１００％。 ２００ＭＨｚ ¹Ｈ−ＮＭＲ：δＣＤＣｌ₃ （分裂型、相対プロトン数） １．９５〜２．３５（多重線、５１Ｈ） 注：アセチル基 ３．６８〜５．５（多重線、３４Ｈ） ５．７６（二重線、１Ｈ） 注：Ｊ＝８．１Ｈｚ 非還元性末端のアノマー水素 該反応により得られた反応生成物は、β−（１，４）−
ガラクトシルマルトテトラオース保護体（一般式VIII、
ｎ＝２、１００％）であった。

【００８７】（Ｃ） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
−β（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオース保護
体の製造 上記工程で得られたβ−（１，４）−ガラクトシルマル
トテトラオース保護体１ｇを塩化メチレン５ｍｌに溶解
し、ＳｎＣｌ₄ ６００ｍｇを加えた。２−クロロ−４−
ニトロフェノール５００ｍｇを加え、６０℃の油浴で１
０時間還流させた。冷却後、トリクロロメタンで抽出し
濃縮乾固後、ヘキサン／酢酸エチル（６：４）を溶離液
としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製
し、白色粉末３５０ｍｇを得た。 ２００ＭＨｚ ¹Ｈ−ＮＭＲ：δ（分裂型、相対プロトン数） １．９５〜２．２０（多重線、４８Ｈ） 注：アセチル基 ３．６８〜５．５０（多重線、３５Ｈ） ７．２９（二重線、１Ｈ） 注：Ｊ＝８．１Ｈｚ ＣＮＰの環プロトン ８．１７（ダブル二重線、１Ｈ） 同上 ８．３１（二重線、１Ｈ） 同上 該反応により得られた生成物は、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−β（１，４）−ガラクトシルマルトテトラ
オース保護体（ＣＮＰ化ガラクトシルマルトオリゴ糖保
護体、ＣＮＰ基がβ結合したもの、１００％）である。
該ＣＮＰ化ガラクトシルマルトオリゴ糖保護体は、副反
応が少なく、未反応の原料と極性が離れているため、精
製が容易で１回のシリカゲルカラムクロマトグラフィー
による精製で十分であった。

【００８８】（Ｄ） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
−β（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオースの製
造 上記で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル−β
（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオース保護体１
ｇを無水メタノール１０ｍｌに溶解した。ナトリウムメ
チラート５ｍｇを添加し、一夜放置した。酢酸１ｍｌを
加え中和し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。シ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチ
ル／メタノール／水＝８：２：１）で精製し、凍結乾燥
することにより白色粉末６２０ｍｇを得た。 ５００ＭＨｚ ¹Ｈ−ＮＭＲ：δＣＤＣｌ_{3 PPM} （分裂型、相対プロトン数） ３．５〜４．０（多重線、２８Ｈ） ４．４５（二重線、１Ｈ） 注：β−ガラクトシル基のアノマー水素 ５．３４（二重線、１Ｈ） 注：β−グルコシル基のアノマー水素 ５．３８（二重線、１Ｈ） 注：α−グルコシル基のアノマー水素 ５．３９（二重線、１Ｈ） 注：α−グルコシル基のアノマー水素 ５．４５（二重線、１Ｈ） 注：α−グルコシル基のアノマー水素 ７．４２（二重線、１Ｈ） ＣＮＰの環プロトン ８．２４（ダブル二重線、１Ｈ） 同上 ８．４３（二重線、１Ｈ） 同上 得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル−β（１，
４）−ガラクトシルマルトテトラオース（一般式(IV)：
ｎ＝２、ＣＮＰ基がβ結合したもの、１００％）のＨＰ
ＬＣ分析を図４に示す。なお、分析条件はカラム：ＴＳ
Ｋ−ＧＥＬ、ＮＨ₂-６０、溶媒：アセトニトリル−水
（７：３）、流速：１ｍｌ／分、検出器：ＵＶ２８０ｎ
ｍである。他のマルトオリゴ糖誘導体との比較を図５に
示す。図５中、（ａ）は２−クロロ−４−ニトロフェニ
ルマルトテトラオース、（ｂ）は２−クロロ−４−ニト
ロフェニルマルトペンタオースを示す。

【００８９】上記の結果より、本発明の製法によると、
各工程の副反応が少なく、精製が容易であり、収率よ
く、ガラクトシルマルトオリゴ糖が製造できた。

【００９０】実施例５および比較例４ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β（１，４）−ガラ
クトシルマルトテトラオースを用いたα−アミラーゼの
測定例 試薬組成Ａ（実施例５） ５０ｍＭ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ ９０ｕ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２ｕ／ｍｌ ＣａＣｌ₂ １ｍＭ ２−クロロ−４−ニトロフェニルβ（１，４）−ガラクトシルマルトテト ラオース（以下、β（１，４）−Ｇａｌ−Ｇ４−ＣＮＰと略記） ２ｍＭ 試薬組成Ｂ（比較例４） ５０ｍＭ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ ９０ｕ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２ｕ／ｍｌ ＣａＣｌ₂ １ｍＭ ３−ケトブチリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトペン タオシド（以下、３−ＫＢ−Ｇ５−ＣＮＰと略記） ２ｍＭ 上記各試薬３ｍＭにサンプル０．２５ｍｌを添加し、３
７℃において３分間放置したのち、４１５ｎｍにおける
吸光度の変化を測定し、１分間当たりの吸光度の変化量
からα−アミラーゼ活性を算出した。また唾液由来のア
ミラーゼ（以下、Ｐ型アミラーゼと表現）及び膵液由来
のアミラーゼ（以下、Ｓ型アミラーゼと表現）の標準品
を用いてその両者の測定値の比であるＰ／Ｓ（Ｐ型アミ
ラーゼ／Ｓ型アミラーゼの比）を求めた。

【００９１】

【表４】

【００９２】初期吸光度から見て、３ＫＢ−Ｇ５−ＣＮ
Ｐよりも純度の高いものが製造でき、かつブランクの上
昇も低いことから、安定度もよいことが明らかである。
また、血清測定値の感度もよく、Ｐ／Ｓ比が３ＫＢ−Ｇ
５−ＣＮＰを用いて測定した値が０．８６なのに対し、
β（１，４）−Ｇａｌ−Ｇ４−ＣＮＰを用いた場合は、
０．９２と１に近く、よりα−アミラーゼの作用様式を
純粋に反映していると考えられる。

【００９３】実施例６ 表５に示した基質それぞれについて、ヒト膵臓由来α−
アミラーゼ、ヒト唾液腺由来α−アミラーゼによる水解
機序を下記条件で検討した。

【００９４】

【表５】

【００９５】［反応条件］ 基質 ２mg／ml ＭＥＳ ０．０５Ｍ ＣａＣｌ₂ ０．４ｍＭ α−アミラーゼ ２０Ｕ／ml ［分析条件］ ＨＰＬＣ使用 カラム ＴＳＫｇｅｌ ＮＨ２−６０ 溶出液 ＣＨ₃ ＣＮ：水＝７：３ 流速 １ml／min 検出波長 ２８０ｎｍ

【００９６】反応開始から３０分経過後の反応液をカラ
ムに添加した。得られたクロマトデータより反応生成物
の反応液中の残存率を求め、その結果から更に、α−ア
ミラーゼによってそれぞれの基質のどの箇所がどれだけ
の割合で水解されているかを計算した。その結果を図６
に示す。図６に示した結果から明らかな如く、比較例の
基質のα−アミラーゼによる水解箇所が複数あるのに対
し、本発明の基質では水解箇所の数が１である。このた
め反応機序が単純化されよりリーズナブルな形となって
いる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の合成例における酵素反応液の精製前
の分析用ＨＰＬＣチャートである。

【図２】実施例２の合成例における酵素反応液の精製前
の分析用ＨＰＬＣチャートである。

【図３】β（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオー
スのＨＰＬＣ分析の結果を示す。

【図４】２−クロロ−４−ニトロフェニルβ−（１，
４）−ガラクトシルマルトテトラオースのＨＰＬＣ分析
を示す。

【図５】他のマルトオリゴ糖誘導体のＨＰＬＣ分析にお
ける結果を示す。（ａ）は２−クロロ−４−ニトロフェ
ニルマルトテトラオース、（ｂ）は２−クロロ−４−ニ
トロフェニルマルトペンタオースを示す。

【図６】表５に示したマルトオリゴ糖誘導体を基質とし
たヒト膵臓由来α−アミラーゼ、ヒト唾液腺由来α−ア
ミラーゼによる水解機序を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 桑原 宣洋 神奈川県藤沢市藤沢2493−10 ドルミ藤沢 Ｄ−801 (72)発明者 藤田 孝輝 神奈川県横浜市港南区港南台２丁目２番７ −1006 (72)発明者 原 浩司 大阪府泉佐野市上町２丁目６番23号101号 室 (72)発明者 馬島 肇一 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀酵素工場内 (72)発明者 濱田 芳男 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀酵素工場内 (72)発明者 手嶋 真一 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀酵素工場内 (72)発明者 林 勇藏 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 東洋紡 績株式会社内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ₁ およびＲ₂ は互いに異なる水素またはβ−
   ガラクトピラノシル基を、ｎは１〜７の整数を示す。）
   で表わされるマルトオリゴ糖誘導体。
2. 【請求項２】 一般式（Ｉ） 【化２】 （式中、Ｒ₁ およびＲ₂ は互いに異なる水素またはβ−
   ガラクトピラノシル基を、ｎは１〜７の整数を示す。）
   で表わされるマルトオリゴ糖誘導体を含有することを特
   徴とするα−アミラーゼ活性測定用試薬。
3. 【請求項３】 一般式（II) 【化３】 （式中、ｎは１〜７の整数を示す。）で表わされるマル
   トオリゴ糖誘導体とラクトースとをβ−ガラクトシダー
   ゼの存在下に反応させることを特徴とする下記一般式
   （Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖誘導体の製造法。 【化４】 （式中、Ｒ₁ およびＲ₂ は互いに異なる水素またはβ−
   ガラクトピラノシル基を、ｎは１〜７の整数を示す。）
4. 【請求項４】 一般式(III) または一般式(IV)： 【化５】 【化６】 （式中、ｎは１〜７の整数を示す。）で表されるマルト
   オリゴ糖誘導体の製造法において、一般式(V) または一
   般式(VI)： 【化７】 【化８】 （式中、ｎは１〜７の整数を示す。）で表されるガラク
   トシルマルトオリゴ糖を有機媒体の存在下、もしくは無
   溶媒の下に、アルカリ及び無水酢酸とともに加熱してア
   セチル化する工程、得られた一般式(VII) または一般式
   (VIII): 【化９】 【化１０】 （式中、ｎは１〜７の整数を示す。Ａｃはアセチル基を
   示す。）で表されるアセチル化ガラクトシルマルトオリ
   ゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノールを有機溶媒
   中、酸触媒とともに加熱する工程、次いで得られた反応
   生成物のアセチル基を脱離する工程を含むことを特徴と
   するマルトオリゴ糖誘導体の製造法。
5. 【請求項５】 一般式(III) または一般式（IV）: 【化１１】 【化１２】 （式中、ｎは１〜７の整数を示す。）で表されるマルト
   オリゴ糖誘導体の製造法において、マルトオリゴ糖およ
   びラクトースをβ−ガラクトシダーゼの存在下に反応さ
   せて得られた一般式(V) または一般式(VI): 【化１３】 【化１４】 （式中、ｎは１〜７の整数を示す。) で表されるガラク
   トシルマルトオリゴ糖を有機媒体の存在下、もしくは無
   溶媒の下に、アルカリ及び無水酢酸とともに加熱してア
   セチル化する工程、得られた一般式(VII) または一般式
   (VIII): 【化１５】 【化１６】 （式中、ｎは１〜７の整数を示す。Ａｃはアセチル基を
   示す。）で表されるアセチル化ガラクトシルマルトオリ
   ゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノールを有機溶媒
   中、酸触媒とともに加熱する工程、次いで得られた反応
   生成物のアセチル基を脱離する工程を含むことを特徴と
   するマルトオリゴ糖誘導体の製造法。