JPH05262784A - 非還元末端アジド化マルトオリゴ糖及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 一般式 【化１】 （ｎは１〜６の整数）で表わされる非還元末端アジド化
マルトオリゴ糖、及び６−アジド−デオキシシクロデキ
ストリンに、特定の性質を有するシクロデキストリナー
ゼを作用させると同時に、又は作用させたのちに、エキ
ソ型糖化酵素類を作用させて、前記非還元末端アジド化
マルトオリゴ糖を製造する方法である。 【効果】 前記非還元末端アジド化マルトオリゴ糖はそ
れ自体α−アミラーゼ活性測定用基質として有用である
とともに、特に該基質として好適な芳香族発色性基を有
する非還元末端アジド化マルトオリゴ誘導体などの中間
体として有用である。該非還元末端アジド化マルトオリ
ゴ糖は安価なシクロデキストリンを原料として用い、簡
単な操作で効率よく大量に製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な非還元末端アジ
ド化マルトオリゴ糖及びその製造方法に関するものであ
る。さらに詳しくいえば、本発明は、それ自体α−アミ
ラーゼ活性測定用基質となるが、特に、α−アミラーゼ
活性測定用基質として極めて有用な還元末端グルコース
１位の水酸基のＨを芳香族発色性基で置換して成る非還
元末端アジド化マルトオリゴシド誘導体の中間体として
用いられる新規な非還元末端アジド化マルトオリゴ糖、
及びこのものを効率よく製造する方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】本発明者らは、先に、α−アミラーゼ活
性測定用基質として有効な還元末端グルコース１位の水
酸基のＨを芳香族発色性基で置換した新規な非還元末端
アジド化マルトオリゴシド誘導体について、還元末端グ
ルコース１位の水酸基のＨを芳香族発色性基で置換した
マルトオリゴシド誘導体を原料とし、これにテトラメト
キシメタンを作用させて非還元末端４，６−位ＯＨをジ
メトキシメチリデン化したのち、アセチル化し、さらに
得られた生成物のジメトキシメチリデン基を酢酸−水を
作用させて除去して４，６−ＯＨ誘導体とし、次いでト
シルクロリドを作用させる選択的６−Ｏ−トシル化反
応、４−Ｏ−アセチル化反応、そしてヨウ化ナトリウム
を作用させるヨード化反応を行って非還元末端ヨード化
マルトオリゴ糖誘導体とし、続いてアジ化ナトリウムを
作用させるアジド化反応、最後に脱アセチル化反応を行
ってこれを製造する方法を見出した。

【０００３】しかしながら、この方法は、反応工程が極
めて長く、かつ煩雑である上、出発原料のマルトオリゴ
シド誘導体が高価であることから、工業的に大量生産す
るには必ずしも満足しうる方法とはいえなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、特に、α−
アミラーゼ活性測定用基質として極めて好適な還元末端
グルコース１位の水酸基のＨを芳香族発色性基で置換し
た非還元末端アジド化マルトオリゴシド誘導体などの中
間体として有用な新規な化合物を提供するとともに、こ
の化合物を効率よく大量に製造する方法を提供すること
を目的としてなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために種々研究を重ねた結果、特定の新規マル
トオリゴ糖が非還元末端アジド化マルトオリゴシド誘導
体などの中間体として有用であり、そして該化合物は６
−アジド化シクロデキストリンに特定のシクロデキスト
リナーゼとエキソ型糖化酵素類を作用させることにより
容易に製造することができることを見出し、この知見に
基づいて本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、一般式

【化２】 （式中のｎは１〜６の整数である）で表わされる非還元
末端アジド化マルトオリゴ糖を提供するものである。

【０００７】本発明に従えば、前記非還元末端アジド化
マルトオリゴ糖は、６−アジド−６−デオキシシクロデ
キストリンに、（イ）シクロデキストリンを開裂し、シ
クロデキストリンのグルコース重合度に由来するマルト
オリゴ糖を生成させる作用及び（ロ）シクロデキストリ
ンに対する水解速度又は親和性が多糖類あるいはシクロ
デキストリンと同じ重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい
基質特異性を有するシクロデキストリナーゼを作用させ
ると同時に、又は作用させたのちに、エキソ型糖化酵素
類を作用させることにより製造することができる。

【０００８】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる非
還元末端アジド化マルトオリゴ糖は、新規な化合物であ
って、具体例としては、α又はβの６³−アジド−６³−
デオキシマルトトリオース、６^４−アジド−６^４−デオ
キシマルトテトラオース、６^５−アジド−６^５−デオキ
シマルトペンタオース、６^６−アジド−６^６−デオキシ
マルトヘキサオース、６^７−アジド−６^７−デオキシマ
ルトヘプタオース、６^８−アジド−６^８−デオキシマル
トオクタオースなどを挙げることができる。なお、６^３
−、６^４−、６^５−などは、マルトオリゴ糖を構成する
グルコース単位の還元末端側から、３番目、４番目、５
番目のグルコース残基の６位の水酸基が置換されている
ことを示す。

【０００９】これまで、マルトトリオースの非還元末端
の化学的修飾に関する研究において、その中間体として
１，６−アンヒドロ−６″−アジド−６″−デオキシ−
β−マルトースオクタアセテートが知られているが
［「カルボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄ
ｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」第５１巻、第７３〜８
４ページ（１９７６年）］、この化合物は、ＯＨ基がア
セチル基で保護されていること、分子内エーテル構造を
有していることなどから、本発明の前記一般式（Ｉ）の
ｎ＝１に相当する化合物とは異なっている。

【００１０】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる非
還元末端アジド化マルトオリゴ糖は文献未載の新規な化
合物であって、次に示す本発明方法に従い効率よく製造
することができる。

【００１１】本発明方法においては、該非還元末端アジ
ド化マルトオリゴ糖を製造するのにシクロデキストリナ
ーゼが用いられるが、この酵素については、（イ）シク
ロデキストリンを開裂し、シクロデキストリンのグルコ
ース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生成させる作用
を有し、かつ（ロ）シクロデキストリンに対する水解速
度又は親和性が、多糖類あるいはシクロデキストリンと
同じ重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有
するものであればどのようなものでもよく、特に制限さ
れず、またその起源についても特に制限はない。

【００１２】このような酵素の中で好適なものとして
は、例えば次の理化学的性質を有する公知のシクロデキ
ストリナーゼを挙げることができる。

【００１３】理化学的性質 （イ）作用：シクロデキストリンを開裂し、シクロデキ
ストリンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖
を生成させる作用を有する。 （ロ）基質特異性：シクロデキストリンに対する水解速
度又は親和性が、多糖類あるいはシクロデキストリンと
同じ重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有
する。 （ハ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：β−シクロデキスト
リンを基質とした場合、ｐＨ８．０近傍に至適ｐＨを有
し、かつ安定ｐＨ範囲が５．５〜９．５である。 （ニ）作用適温：４０℃近傍に作用適温を有する。 （ホ）失活性：５０℃以上の温度で１５分間の処理によ
り、ほぼ失活する性質を有する。 （ヘ）阻害及び活性化性：Ｈｇ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ
^２＋、Ｎｉ^２＋及びＦｅ²⁺により９０％以上阻害され、
Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋により１０〜３０％活性化される
性質を有する。 （ト）分子量：ゲルろ過法による分子量が１４４，００
０で、ＳＤＳ ＰＡＧＥ法による分子量が７２，０００
である。すなわち、該酵素は分子量７２，０００のサブ
ユニットから成る二量体である。

【００１４】なお、該酵素の力価は、２％（Ｗ／Ｖ）濃
度のβ−シクロデキストリン溶液５００μｌ及び適当量
の該酵素を含有する１００ｍＭ濃度のリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）５００μｌを混和し、温度４０℃で適当時間
反応させたのち、１０分間煮沸することにより反応を停
止し、高速液体クロマトグラフィーによって、生成した
マルトヘプタオースを定量することにより求めた。ま
た、酵素量が少量の場合には、グルコースを標準とした
ソモギーネルソン法により還元力を測定することにより
求めた。

【００１５】該酵素の酵素単位については、１分間に１
マイクロモルのマルトヘプタオースを生成する酵素量を
１単位とした。

【００１６】このような諸性質を有する酵素は、例えば
バチルス属に属し、該酵素を産生する微生物、例えばバ
チルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅ
ｒｉｃｕｓ）Ｅ−２４４菌株［工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第２４５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−２
４５８）として寄託されている］などを培地に培養し、
得た培養物より該酵素を採取することにより得られる。

【００１７】なお、前記酵素の理化学的性質、その産生
菌バチルス・スフェリカスＥ−２４４菌株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２４５８）の菌学的性質及び該酵素の製造法の詳
細については、特開平３−１５３８４号公報及び特開平
３−８６７０１号公報に記載されている。

【００１８】前記一般式（Ｉ）で表わされる６−アジド
化マルトオリゴ糖は、次のようにして製造することがで
きる。

【００１９】先ず、一般式

【化３】 （式中のｍは４〜６である）で表わされる６−アジド−
６−デオキシシクロデキストリンに、前記した特定のシ
クロデキストリナーゼを作用させることにより、一般式

【化４】 （式中のＸは１個がＮ_３で、残りのｍ＋１個が水酸基で
あり、ｍは４〜６である）で表わされる、種々の位置に
６−アジド−６−デオキシグルコース残基を有する６−
アジド−６−デオキシマルトオリゴ糖の混合物を主成分
とする反応液を得る。

【００２０】出発物質として、好適な前記一般式（Ｉ
Ｉ）で表わされる６−アジド−６−デオキシシクロデキ
ストリンは、例えば市販のα−、β−、γ−シクロデキ
ストリン（それぞれグルコース重合度は、６、７、８で
ある）などから、公知の方法により製造することができ
る。この製造法の好適な１例について説明すると、まず
シクロデキストリンをピリジンなどの溶媒に溶解し、こ
れに該シクロデキストリンに対し、２〜７モル倍量のト
シルクロリドを添加し、通常１５〜３０℃の範囲の温度
で４〜６時間程度反応させて６位ＯＨのうちの１個のみ
をトシル化し、必要に応じ常法に従い精製して、６−Ｏ
−トシルシクロデキストリンを得る。次いで、これを水
性媒体中で６−Ｏ−トシルシクロデキストリンに対し、
１０〜５０モル倍量のアジ化ナトリウムを添加し、通常
７０〜９０℃の範囲の温度で３〜１０時間程度反応させ
てトシルオキシ基をアジド基に置換する。該水性媒体と
しては、水や、水とアセトン、１，４−ジオキサン、ア
セトニトリル、ＤＭＦなどとの混合物が用いられる。そ
して必要に応じ、常法に従い精製して６−アジド−６−
デオキシシクロデキストリンを得ることができる［「カ
ルボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒ
ｅｓ．）」第１８巻、第２９〜３７ページ（１９７１
年)参照］。

【００２１】このようにして、出発物質として好適な、
例えば６−アジド−６−デオキシ−α−シクロデキスト
リン、６−アジド−６−デオキシ−β−シクロデキスト
リン、６−アジド−６−デオキシ−γ−シクロデキスト
リンを容易に製造することができるが、これらの中でも
酵素反応速度の点から６−アジド−６−デオキシ−β−
シクロデキストリンが特に好適である。

【００２２】この酵素反応における６−アジド−６−デ
オキシシクロデキストリンの基質濃度は、該シクロデキ
ストリナーゼの基質に対するＫｍ値以上の濃度になるよ
うに調整することが好ましい。また、酵素反応条件につ
いては、該シクロデキストリナーゼの作用ｐＨ及び作用
温度の範囲であればよく、特に制限はないが、通常ｐＨ
７．５〜９．０、温度３５〜４５℃の条件で反応が行わ
れる。

【００２３】さらに、この反応において、必要に応じ、
エタノール、アセトン、ＤＭＳＯなどの有機溶媒を添加
してもよい。反応時間は通常３０分ないし４８時間であ
る。また、酵素量については特に制限はないが、反応時
間内に生成物量が最大となるように、適宜必要量を添加
すればよく、通常０．５〜５０単位／ｇの範囲で選ばれ
る。

【００２４】このようにして、前記一般式（ＩＩＩ）で
表わされる各種６−アジド−６−デオキシマルトオリゴ
糖の混合物を主成分とする反応液が得られる。この反応
液としては、例えば出発物質が６−アジド−６−デオキ
シ−β−シクロデキストリンの場合には、６^７−アジド
−６^７−デオキシマルトヘプタオース、６^６−アジド−
６^６−デオキシマルトヘプタオース、６^５−アジド−６
^５−デオキシマルトヘプタオ−ス、６^４−アジド−６^４
−デオキシマルトヘプタオース、６^３−アジド−６^３−
デオキシマルトヘプタオース、６^２−アジド−６^２−デ
オキシマルトヘプタオース、６^１−アジド−６^１−デオ
キシマルトヘプタオースの混合物を主成分とするものが
得られ、６−アジド−６−デオキシ−α−シクロデキス
トリンの場合には、同様に６^６、６^５、６^４、６^３、６
^２、６^１−アジド−６^６、６^５、６^４、６^３、６^２、６
^１−デオキシマルトヘキサオースの混合物を主成分とす
るものが得られる。

【００２５】次に、このようにして得られた反応液に、
エキソ型糖化酵素類を作用させて、６−アジド−６−デ
オキシグルコースの残基が非還元末端となるように、非
還元末端側のグルコース残基を加水分解させる。この際
に用いられるエキソ型糖化酵素類としては、例えば公知
のα−グルコシダーゼやグルコアミラーゼなどが挙げら
れるが、これらはそれぞれ単独で用いてもよいし、組み
合わせて用いてもよく、また所望に応じβ−アミラーゼ
を併用してもよい。

【００２６】この酵素反応によって、６^８−アジド−６
^８−デオキシマルトオクタオース、６^７−アジド−６^７
−デオキシマルトヘプタオース、６^６−アジド−６^６−
デオキシマルトヘキサオース、６^５−アジド−６^５−デ
オキシマルトペンタオース、６^４−アジド−６^４−デオ
キシマルトテトラオース、６^３−アジド−６^３−デオキ
シマルトトリオースなどの前記一般式（Ｉ）で表わされ
る各種非還元末端アジド化マルトオリゴ糖、６^２−アジ
ド−６^２−デオキシマルトース、６^１−アジド−６^１−
デオキシグルコースなどとの混合物として得られる。な
お、β−アミラーゼを併用した場合は、前記化合物の他
に６^１−アジド−６^１−デオキシマルトースも混在す
る。

【００２７】該エキソ型糖化酵素類は、前記のシクロデ
キストリナーゼと共存させて、酵素反応を同時的に行わ
せてもよいし、６−アジド−６−デオキシシクロデキス
トリンにシクロデキストリナーゼを作用させたのち、さ
らに該エキソ型糖化酵素類を作用させて酵素反応を行わ
せてもよいが、後者の方が好ましい。特に好適な態様に
おいては、例えば６−アジド−６−デオキシシクロデキ
ストリンに該シクロデキストリナーゼを作用させて、生
成物が最大になった時点で、酸処理や熱処理などによ
り、いったん反応を停止させたのち、例えば反応液をオ
クタデシル化シリカゲル（ＯＤＳ）カラムクロマトグラ
フィーなどに付し、未反応の６−アジド−６−デオキシ
シクロデキストリンを吸着除去するなどの精製処理を施
し、次いでこれにエキソ型糖化酵素類を作用させる。

【００２８】該シクロデキストリナーゼとエキソ型糖化
酵素類とを共存作用させる場合の反応条件としては、も
ちろん両酵素の共通の作用ｐＨ及び作用温度範囲で適宜
選択すればよいが、通常ｐＨ７．０〜９．０、温度３５
〜４５℃において、０．５〜４８時間程度反応が行われ
る。

【００２９】また、シクロデキストリナーゼを作用させ
たのち、エキソ型糖化酵素類を作用させる場合の反応条
件としては、用いる酵素の作用ｐＨ及び作用温度範囲で
適宜選べばよいが、通常ｐＨ４．０〜７．５、温度３５
〜４５℃において、０．５〜４８時間程度反応が行われ
る。

【００３０】さらに、エキソ型糖化酵素類の使用量につ
いては特に制限はないが、通常６−アジド−６−デオキ
シシクロデキストリンに対し、１０〜１００単位／ｇの
範囲で選ばれる。また、この酵素反応は酸処理や熱処理
などにより反応を停止させることができる。

【００３１】次に、このようにして得られた非還元末端
アジド化マルトオリゴ糖含有反応液から、所望の前記一
般式（Ｉ）で表わされる非還元末端アジド化マルトオリ
ゴ糖を分離精製するが、この分離精製方法については特
に制限はなく、従来オリゴ糖の分離精製に慣用されてい
る方法を用いることができる。例えば反応液から未反応
の６−アジド−６−デオキシシクロデキストリンを除去
したのち、活性炭カラムクロマトグラフィー、ＯＤＳカ
ラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー、薄層クロマトグラフィーなどを用いて分画採
取する方法などを採用することができる。また、未反応
の６−アジド−６−デオキシシクロデキストリンの除去
法としては、例えば冷却処理、有機溶媒添加処理などに
よる析出−ろ別法、カラム吸着法などの公知の方法が挙
げられる。

【００３２】このようにして得られた前記一般式（Ｉ）
で表わされる非還元末端アジド化マルトオリゴ糖は、こ
れ自体α−アミラーゼ活性測定用基質としても使用でき
るが、特に、α−アミラーゼ活性測定用基質として極め
て好適に用いることのできる、例えば該化合物の還元末
端グルコース１位の水酸基のＨを芳香族発色性基で置換
した非還元末端アジド化マルトオリゴシド誘導体などの
中間体として有用である。

【００３３】前記一般式（Ｉ）で表わされる非還元末端
アジド化マルトオリゴ糖自体をα−アミラーゼ活性測定
用基質としても使用する場合には、次のようなα−アミ
ラーゼ活性測定用試薬、α−アミラーゼ活性の測定方法
が挙げられる。

【００３４】α−アミラーゼ活性を測定するための有利
な系としては、例えば前記一般式（Ｉ）で表わされる非
還元末端アジド化マルトオリゴ糖１〜２０ｍＭ及び緩衝
剤２〜１００ｍＭを含有し、かつ共役酵素として、α−
グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼ若しくはその両方
を、それぞれ１５〜１５０単位／ｍｌ含有するｐＨ４〜
１０の系が挙げられる。該測定系には、必要に応じ溶解
補助剤、安定化剤、α−アミラーゼ活性剤などを添加す
ることもできる。さらに、酵素反応によって生成するグ
ルコースやマルトースを吸光度測定法によって定量する
場合には、通常用いられるグルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、マルトースホスホリラーゼ、へキソキナ
ーゼ、β−ホスホグルコムターゼ、ＮＡＤＰとＡＴＰな
どを加えればよい。

【００３５】また、α−アミラーゼ活性の測定方法の好
適な１例について説明すると、まず、α−アミラーゼ活
性を含む試料に、共役酵素としてのα−グルコシダーゼ
又はグルコアミラーゼ若しくはその両方を、それぞれ１
５〜１５０単位／ｍｌ、好ましくは３０〜７０単位／ｍ
ｌになるように加え、同時に、又は順次に前記一般式
（Ｉ）で表わされる非還元末端アジド化マルトオリゴ糖
１〜２０ｍＭ及び緩衝剤を添加したのち、温度２５〜５
０℃、ｐＨ４〜１０の条件にて１分間以上酵素反応させ
る。次いで生成するグルコースやマルトースを、常法に
よりそのまま、例えばソモジ・ネルソン法、グルコスタ
ット法などを用いて定量するか、又は前記したような吸
光度測定法によって定量し、あらかじめ同方法で定量し
て作成したα−アミラーゼ標品の検量線を用いて、試料
中のα−アミラーゼ活性を算出する。

【００３６】なお、α−アミラーゼ含有試料について
は、α−アミラーゼ活性を含有するものであればよく、
特に制限はないが、具体的には微生物の培養液、植物の
抽出液、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽出液
などを用いることができる。α−アミアラーゼ含有試料
が固体の場合には、いったん精製水又は緩衝液に溶解又
は懸濁させるのがよい。また、必要により、不溶物をろ
過などの操作で除去してもよい。

【００３７】次に、前記一般式（Ｉ）で表わされる非還
元末端アジド化マルトオリゴ糖を中間体として得られ
る、一般式

【化５】 （式中のｎは１〜６の整数であり、Ｒは芳香族発色性基
である）で表わされる非還元末端アジド化マルトオリゴ
シド誘導体について説明する。

【００３８】先ず、前記一般式（ＩＶ）で表わされる非
還元末端アジド化マルトオリゴシド誘導体において、還
元末端グルコース１位の水酸基のＨに置換される芳香族
発色性基としては、分光学的に検出できればどのような
ものを用いてもよいが、例えば一般式

【化６】 （式中のＲ^１〜Ｒ^５は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ
基、アルキル基、アリール基、アリル基、アミノ基、ス
ルホン酸基、又はカルボキシル基であり、それぞれ同一
であってもよいし、また異なっていてもよく、またＲ^１
とＲ^２、Ｒ^２とＲ^３とがそれぞれたがいに結合して、縮
合芳香環を形成してもよい）

【化７】 （式中のＲ^６は水素原子又はアルキル基である）

【化８】 （式中のＲ^７は水素原子又はハロゲン原子である）

【化９】 （式中のＲ^８〜Ｒ^１５は水素原子、ハロゲン原子、ニト
ロ基、アルキル基、アリール基、アリル基、アミノ基、
スルホン酸基、又はカルボキシル基であり、それぞれ同
一であってもよいし、異なっていてもよく、またＲ^８と
Ｒ^９、Ｒ^１０とＲ^１１とがそれぞれたがいに結合して、
縮合芳香環を形成してもよく、さらにＲ^９とＲ^１０及び
／又はＲ^１３とＲ^１４が共通の酸素原子となって縮合エ
ーテル環を形成してもよく、Ｚは窒素原子又はＮ→Ｏで
ある）で表わされる基などである。

【００３９】そして、前記一般式（ＩＶ）で表わされる
非還元末端アジド化マルトオリゴシド誘導体はα−アノ
マー（α−配糖体）又はβ−アノマー（配糖体）のいず
れであってもよい。

【００４０】このような前記一般式（ＩＶ）で表わされ
る化合物としては２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６
^５−アジド−６^５−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオ
シド、４−ニトロフェニル＝６^５−アジド−６^５−デオ
キシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド、２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝６^７−アジド−６^７−デオキシ−β−
Ｄ−マルトヘプタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル＝６^５−アジド−６^５−デオキシ−α−Ｄ−マルト
ペンタオシド、４−ニトロフェニル＝６^５−アジド−６
^５−デオキシ−α−Ｄ−マルトペンタオシド、２，４−
ジクロロフェニル＝６^７−アジド−６^７−デオキシ−α
−Ｄ−マルトヘプタオシド、フェノールインド−３′−
クロロフェニル＝６^５−アジド−６^５−デオキシ−β−
Ｄ−マルトペンタオシド、４−メチルウンベリフェロニ
ル＝６^６−アジド−６^６−デオキシ−α−Ｄ−マルトヘ
キサオシド、レザズリニル＝６^４−アジド−６^４−デオ
キシ−α−Ｄ−マルトテトラオシド、ルシフェリニル＝
６^３−アジド−６^３−デオキシ−β−Ｄ−マルトトリオ
シドなどが挙げられる。

【００４１】なお、前記一般式（ＩＶ）で表わされる非
還元末端アジド化マルトオリゴシド誘導体において、α
−アミラーゼ活性測定用基質として用いる場合の酵素反
応速度の観点からは、ｎ＝３〜５の化合物が特に好適で
ある。

【００４２】前記一般式（Ｉ）で表わされる非還元末端
アジド化マルトオリゴ糖を中間体とし、該化合物より前
記一般式（ＩＶ）で表わされる非還元末端アジド化マル
トオリゴシド誘導体を製造するためには、有機合成法、
酵素反応法など、どのような方法を用いてもよいが、例
えば次のような製法が挙げられる。

【００４３】前記一般式（Ｉ）で表わされる非還元末端
アジド化マルトオリゴ糖に無水酢酸及び過塩素酸を酢酸
エチルの存在下で作用させてアセチル化反応を行い、こ
の反応と同時に又は反応後に、水及び三臭化リンをジク
ロルメタンの存在下で作用させて還元末端グルコース１
位のブロム化反応を行い、得られる非還元末端アジド化
アセチルマルトオリゴシルブロミドに前記芳香族発色性
化合物を酸化銀及びアセトニトリルの存在下で作用させ
て非還元末端アジド化アセチルマルトオリゴシド誘導体
とし、さらにこれにアミンを水及びメタノールの存在下
で作用させて脱アセチル化反応を行うことにより、目的
化合物を製造することができる（特開昭６２−２８３９
８９号公報参照）。

【００４４】前記したように、一般式（ＩＶ）で表わさ
れる非還元末端アジド化マルトオリゴシド誘導体にはα
−アノマーとβ−アノマーが存在するが、α−アミラー
ゼ活性の測定に際して、α−アノマーのみを用いる場合
には共役酵素として、α−グルコシダーゼ又はグルコア
ミラーゼあるいはその両方を用いることが必要であり、
β−アノマーのみあるいはα−アノマーとβ−アノマー
の混合物を用いる場合にはα−グルコシダーゼ又はグル
コアミラーゼあるいはその両方に加えてさらにβ−グル
コシダーゼを併用することが必要である。なお、必要に
応じてβ−アミラーゼを用いることもできる。

【００４５】また、このときのα−アミラーゼ活性を測
定するための有利な系としては、例えば一般式（ＩＶ）
で表わされる非還元末端アジド化マルトオリゴシド誘導
体０．１〜１０ｍＭ及び緩衝液２〜３００ｍＭを含有
し、かつ共役酵素としてα−グルコシダーゼ及び／又は
グルコアミラーゼをそれぞれ５〜１０００単位／ｍｌ、
さらに、β−グルコシダーゼを用いるときには０．５〜
３０単位／ｍｌを含有するｐＨ４〜１０の系が挙げられ
る。

【００４６】さらにまた、一般式（ＩＶ）で表わされる
非還元末端アジド化マルトオリゴシド誘導体を有効成分
とする試薬の場合には、乾燥物あるいは溶解した形で用
いてもよいし、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の
紙などに含浸させて用いてもよい。

【００４７】次に一般式（ＩＶ）で表わされる非還元末
端アジド化マルトオリゴシド誘導体を用いた場合の好適
な実施態様を説明すると、まず、α−アミラーゼを含む
試料に、共役酵素としてのα−グルコシダーゼ又はグル
コアミラーゼあるいはその両方をそれぞれ５〜１０００
単位／ｍｌ、好ましくは１０〜５００単位／ｍｌ加え、
一般式（ＩＶ）で表わされる非還元末端アジド化マルト
オリゴシド誘導体がβ−アノマーを含むときは、さらに
β−グルコシダーゼを０．５〜３０単位／ｍｌ、好まし
くは１〜１５単位／ｍｌ加え、これと同時又はこれらの
後に、該マルトオリゴシド誘導体０．１〜１０ｍＭ、好
ましくは０．３〜５ｍＭを緩衝剤とともに添加したの
ち、温度２５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、ｐＨ
４〜１０、好ましくは６〜８の条件下で少なくとも１分
間、好ましくは２〜１０分間酵素反応させ、生成した芳
香族発色性化合物を、常法に従いそのままであるいは必
要に応じｐＨを調整したのち、又は縮合反応を行ったの
ちに、適当な吸光波長で連続的に又は断続的に吸光度変
化量を測定し、あらかじめ測定したα−アミラーゼ標品
の吸光度変化量と対比させて試料中のα−アミラーゼ活
性を算出する。また、芳香族発色性化合物の分子吸光係
数から算出することもできる。

【００４８】

【発明の効果】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる
非還元末端アジド化マルトオリゴ糖は、これ自体α−ア
ミラーゼ活性測定用基質としても使用できるが、特に、
α−アミラーゼ活性測定用基質として極めて好適に用い
ることのできる例えば該化合物の還元末端グルコーズ１
位の水酸基のＨを芳香族発色性基で置換した非還元末端
アジド化マルトオリゴシド誘導体などの中間体として有
用である。そして、本発明の製法によれば、前記一般式
（Ｉ）で表わされる非還元末端アジド化マルトオリゴ糖
を、安価なシクロデキストリンを原料として用い、短い
反応工程でかつ簡便な操作により効率よく大量に製造す
ることができる。

【００４９】

【実施例】以下に実施例を示す。なお、各例中の比旋光
度は２５℃においてナトリウムのＤ線で測定した値であ
る。

【００５０】実施例１ ６^５−アジド−６^５−デオキシ−Ｄ−マルトペンタオー
スの製造 （１）６−アジド−６−デオキシ−β−シクロデキスト
リンの製造 （ａ） 市販のβ−シクロデキストリン［和光純薬工業
（株）製］５０．０ｇ（４４．１ｍｍｏｌ）をピリジン
５００ｍｌに溶解し、トシルクロリド３３．３ｇ（１７
５ｍｍｏｌ）を加え、室温下で４時間、かきまぜながら
反応させた。次いでこの反応液に水２５０ｍｌ及びｎ−
ブタノール１０００ｍｌを加え、混合液を減圧下１／２
量まで留去し、濃縮液をアセトン５００ｍｌ中へかきま
ぜながら投入すると析出物が出現した。この析出物をグ
ラスフィルターでろ別し、アセトン２００ｍｌで２回洗
浄したのち、ろ取物をＯＤＳカラムクロマトグラフィー
により精製し、エタノール−水混液（容量比１：９）で
溶出した目的区分を濃縮し、水から再結晶すると、６−
Ｏ−トシル−β−シクロデキストリンが２５．３ｇ（１
９．６ｍｍｏｌ，収率４４．４％）得られた。

【００５１】融点（℃）：１７２．０〜１７４．０（分
解） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^−１）：３４００，２９３
０，１６４２，１６３２，１６００，１４２４，１３６
０，１３００，１１７８，１１５６，１０７８，１０２
８

【００５２】核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐ
ｐｍ：（ＤＭＳＯ−ｄ_６）２．４４（３Ｈ，ｓ），３．
１５〜４．４５（ｍ），４．７６（２Ｈ，ｂｒ．ｓ），
４．８５（５Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝８．８Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈ
ｚ）

【００５３】高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）
製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ
ＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリ
ル／水＝３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ］：Ｒ^ｔ＝５．５ｍｉｎ

【００５４】（ｂ） （ａ）で得られた６−Ｏ−トシル
−β−シクロデキストリン１６．９ｇ（１３．１ｍｍｏ
ｌ）を水５００ｍｌ及び１，４−ジオキサン２５０ｍｌ
の混液に溶解し、アジ化ナトリウム３４．１ｇ（５２５
ｍｍｏｌ）を加え、８５℃で４時間反応させた。次いで
反応液を減圧下１／２量まで留去し、得られた濃縮液を
ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供して精製し、エタ
ノール−水混液（容量比１：９）で溶出した目的区分を
濃縮し水から再結晶すると、６−アジド−６−デオキシ
−β−シクロデキストリンが１４．３ｇ（１２．３ｍｍ
ｏｌ，収率９３．９％）得られた。

【００５５】融点（℃）：２１５．０〜２１８．０（分
解） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^−１）：３３９０，２９２
０，２１２０，１６４２，１４１４，１３７０，１３４
０，１３０４，１１５６，１０８０，１０３０

【００５６】高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）
製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ
ＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリ
ル／水＝３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ］：Ｒ^ｔ＝６．６ｍｉｎ

【００５７】比旋光度［α］：（ｃ ０．５１０，１，
４−ジオキサン／Ｈ_２Ｏ＝１：１（ｖ／ｖ）；＋１４５
° 元素分析値：Ｃ_４２Ｈ_６９Ｎ_３Ｏ_３４として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４３．４９ ６．００ ３．６２ 実測値（％） ４３．２８ ６．１１ ３．５３

【００５８】（２）シクロデキストリナーゼの調製 １％（ｗ／ｖ）β−シクロデキストリン、１％（ｗ／
ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ及び０．１
％（ｗ／ｖ）イーストエキスから成る液体培地（水道水
使用、ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラ
スコに入れ、１２０℃で２０分間、殺菌処理を行った。
これに、バチルス・スフェリカスＥ−２４４（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２４５８）の保存スラントより１白金耳接種
し、３０℃で１日間振とう培養した。この培養液５０ｍ
ｌを、前記と同様の培地組成と殺菌条件により調製した
２０００ｍｌの培地を含有する３０００ｍｌ容ミニジャ
ーに接種して３０℃、１ｖｖｍ、３５０ｒｐｍの条件で
２日間通気かくはん培養を行い、培養終了後、この培養
液から８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離処理により
菌体を分離し、２％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含
有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍｌ
に菌体を懸濁して２５℃で１日間かきまぜた。該懸濁液
から１２０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離処理により
菌体残渣を除去したのち、上清液を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に対して１６時間透析した。得られた
透析物を１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離処理して
不溶物を除去し、上清を粗酵素液（１）とした。

【００５９】次いで、この粗酵素液（１）約５００ｍｌ
（総活性２００単位、タンパク量２０８３ｍｇ、比活性
０．１、ｐＨ７．０）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロース充填カラム
（φ３４×１７０ｍｍ）に供し、酵素を吸着させたの
ち、０〜１．５ＭＮａＣｌのグラジェント勾配により溶
出を行った。このようにして得られた活性フラクション
を集めて粗酵素液（２）１０５ｍｌ（総活性１４５単
位、比活性０．５８、収率７２．５％）を得た。

【００６０】続いて、この粗酵素液（２）２０ｍｌ（総
活性３１単位、タンパク量２９ｍｇ）を１Ｍ硫酸ナトリ
ウム含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡
化したエーテル５ＰＷ充填カラム（φ２１．５×１５０
ｍｍ）に供し、酵素を吸着させたのち、１Ｍ〜０硫酸ナ
トリウムのグラジェント勾配により溶出を行った。この
ようにして得られた活性フラクションを集めて粗酵素液
（３）５０ｍｌ（総活性７２単位、比活性２．９３、収
率３６％）を得た。

【００６１】（３）６^ｐ−アジド化マルトヘプタオース
（ｐ＝１〜７）の製造 （１）で得た６−アジド−６−デオキシ−β−シクロデ
キストリン２５ｇ（２１．６ｍｍｏｌ）を、あらかじめ
４０℃に加温しておいた１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝
７．８）１．０ｌ中にかきまぜながら投入し、完全に溶
解した。そこへ前記（２）と同様にして得たシクロデキ
ストリナーゼの粗酵素液（３）（４９０単位）を加え、
４０℃で２時間かきまぜながら反応を行った。反応終了
後、反応液を８０℃で１０分間かきまぜながら加熱し
た。続いて反応液を室温まで冷却し、ラジオライト（＃
１００）、さらにメンブランフィルター（０．４５μ
ｍ）でろ過を行ったのち、１１５ｍｌまで減圧下濃縮し
た。得られた濃縮液をＯＤＳカラムクロマトグラフィー
に供して精製し、エタノール−水混液（容量比０％→３
５％グラジェント）で溶出し、濃縮乾固して６^ｐ−アジ
ド−６^ｐ−デオキシマルトヘプタオース（ｐ＝１〜７）
を１１．６ｇ（９．８６ｍｍｏｌ，収率４５．６％）得
た。

【００６２】高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）
製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ
ＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリ
ル／水＝３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ］：Ｒ^ｔ＝９．４及び１０．３ｍｉｎ

【００６３】（４）６^５−アジド−６^５−デオキシ−Ｄ
−マルトペンタオースの製造 （３）で得た６^ｐ−アジド化マルトヘプタオース（ｐ＝
１〜７）１１．６ｇ（９．８６ｍｍｏｌ）を、２０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．５）２５０ｍｌ中にかきまぜな
がら溶解し、そこへグルコアミラーゼ８ｍｇ（２５０
ｕ、生化学工業（株）製）を加え、４０℃で４時間かき
まぜながら反応を行った。反応終了後、反応液を９０℃
で２０分間かきまぜながら加熱した。続いて反応液を室
温まで冷却し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）
でろ過を行ったのち、５５ｍｌまで減圧下濃縮した。得
られた濃縮液を活性炭カラムクロマトグラフィーに供し
て精製し、エタノール−水混液（容量比５％→４５％グ
ラジェント）で溶出し、約３０％エタノールの溶出画分
を凍結乾燥して６^５−アジド−６^５−デオキシ−Ｄ−マ
ルトペンタオース１．７９ｇ（２．１０ｍｍｏｌ，収率
２１．３％）を得た。

【００６４】融点（℃）：１７６．０〜１７９．０ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^−１）：３４００，２９２
０，２１１０，１６２８，１４０６，１３６０，１２７
８，１２４０，１１４４，１０７６，１０２２

【００６５】核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐ
ｐｍ（Ｄ_２Ｏ）：２．８０〜４．００（ｍ），４．６４
（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），５．２３（０．５
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），５．３５（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．５Ｈｚ）

【００６６】高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）
製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ
ＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリ
ル／水＝３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ］：Ｒ^ｔ＝６．９ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５４４，Ｈ_２Ｏ）；＋１６
９° 元素分析値：Ｃ_３０Ｈ_５１Ｎ_３Ｏ_２５として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４２．２１ ６．０２ ４．９２ 実測値（％） ４２．０３ ６．１３ ４．６９

【００６７】実施例２ ６^３−アジド−６^３−デオキシ−Ｄ−マルトトリオース
の製造 実施例１（４）においてエタノールグラジェントによる
約２３％の溶出画分を採取した以外は実施例１と同様の
操作を行い、６^３−アジド−６^３−デオキシ−Ｄ−マル
トトリオース７４０ｍｇ（１．４０ｍｍｏｌ，収率１
４．２％）を得た

【００６８】融点（℃）：１３７．０〜１４０．０ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^−１）：３４００，２９１
０，２１１０，１６２８，１４０６，１３５８，１２８
４，１２３６，１１４４，１０７０，１０３０

【００６９】核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐ
ｐｍ（Ｄ_２Ｏ）：２．８０〜４．００（ｍ），４．６５
（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．２３（０．５
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），５．３６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．９Ｈｚ）

【００７０】高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）
製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ
ＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリ
ル／水＝３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ］：Ｒ^ｔ＝４．８ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５４４，Ｈ_２Ｏ）；＋１４
３° 元素分析値：Ｃ_１８Ｈ_３１Ｎ_３Ｏ_１５として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４０．８３ ５．９０ ７．９４ 実測値（％） ４０．６４ ６．０７ ７．７３

【００７１】実施例３ ６^４−アジド−６^４−デオキシ−Ｄ−マルトテトラオー
スの製造 実施例１（４）においてエタノールグラジェントによる
約２７％の溶出画分を採取した以外は実施例１と同様の
操作を行い、６^４−アジド−６^４−デオキシ−Ｄ−マル
トテトラオース１．２２ｇ（１．７７ｍｍｏｌ，収率１
８．０％）を得た。

【００７２】融点（℃）：１６３．０〜１６６．０ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-１）：３４００，２９１
０，２１２０，１６３４，１４００，１３６０，１２８
６，１１４６，１１１０，１０７２，１０３０

【００７３】核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐ
ｐｍ（Ｄ_２Ｏ）：２．８２〜４．０３（ｍ），４．６４
（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），５．２８（０．５
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．３５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ）

【００７４】高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）
製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ
ＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリ
ル／水＝３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ］：Ｒ^ｔ＝５．７ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５３２，Ｈ_２Ｏ）；＋１６
１° 元素分析値：Ｃ_２４Ｈ_４１Ｎ_３Ｏ_２０として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４１．６８ ５．９８ ６．０８ 実測値（％） ４１．５０ ６．０８ ５．９９

【００７５】実施例４ ６^６−アジド−６^６−デオキシ−Ｄ−マルトヘキサオー
スの製造 実施例１（４）においてエタノールグラジェントによる
約３３％の溶出画分を採取した以外は実施例１と同様の
操作を行い、６^６−アジド−６^６−デオキシ−Ｄ−マル
トヘキサオース８４０ｍｇ（０．８２８ｍｍｏｌ，収率
８．４％）を得た。

【００７６】融点（℃）：１９６．０〜１９９．０（分
解） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-１）：３３６０，２９３
０，２１２０，１６３０，１４１０，１３６０，１２９
６，１２３６，１１４８，１０８０，１０２２

【００７７】高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）
製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ
ＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリ
ル／水＝３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ］：Ｒ^ｔ＝７．８ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５２２，Ｈ_２Ｏ）；＋１７
０° 元素分析値：Ｃ_３６Ｈ_６１Ｎ_３Ｏ_３０として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４２．５６ ６．０５ ４．１４ 実測値（％） ４２．３１ ６．１９ ４．１６

【００７８】実施例５ ６^７−アジド−６^７−デオキシ−Ｄ−マルトヘプタオー
スの製造 実施例１（４）においてエタノールグラジェントによる
約３７％の溶出画分を採取した以外は実施例１と同様の
操作を行い、６^７−アジド−６^７−デオキシマルトヘプ
タオース２．４２ｇ（２．０６ｍｍｏｌ，収率２０．９
％）を得た。

【００７９】融点（℃）：２０５．０〜２０８．０ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-１）：３３９０，２９２
０，２１２０，１６３４，１４０６，１３６０，１３０
０，１２３６，１１４６，１０７４，１０２０

【００８０】高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）
製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ
ＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリ
ル／水＝３：２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ］：Ｒ^ｔ＝９．４ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５６６，Ｈ_２Ｏ）；＋１７
８° 元素分析値：Ｃ_４２Ｈ_７１Ｎ_３Ｏ_３５として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４２．８２ ６．０７ ３．５７ 実測値（％） ４２．７２ ６．１１ ３．４８

【００８１】参考例１ ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６^５−アジド−６^５
−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシドの製造 実施例１の（４）で得た６^５−アジド−６^５−デオキシ
マルトペンタオース５．０ｇ（５．８６ｍｍｏｌ）をピ
リジン１００ｍｌに溶解し、無水酢酸５０ｍｌ（５２９
ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間反応させた。次いで反
応液のピリジン、無水酢酸、酢酸を留去したのち、精製
することなくこの残渣をジクロロメタン３０ｍｌに溶解
し、三臭化リン５５６μｌ（５．８６ｍｍｏｌ）、及び
水２１１μｌ（１１．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０
時間かきまぜながら反応させた。次いで反応液に無水炭
酸カリウム１８．６ｇ（１３５ｍｍｏｌ）を加え、室温
で１５分間かきまぜながら反応させた。不溶物をグラス
フィルターでろ別し、これをジクロロメタン２００ｍｌ
で３回洗った。ろ液と洗液を合わせてここに含まれるジ
クロロメタンを留去した。精製することなくこの残渣を
アセトニトリル１００ｍｌに溶解し、２−クロロ−４−
ニトロフェノール５．０９ｇ（２９．３ｍｍｏｌ）を加
えたのち、さらに酸化銀（Ａｇ_２Ｏ）６．８０ｇ（２
９．３ｍｍｏｌ）を加え、３５℃で１７時間かきまぜな
がら反応させた。次いで反応液をグラスフィルターでろ
別し、これをジクロロメタン５０ｍｌで３回洗った。ろ
液と洗液を合わせて減圧下濃縮し、このろ液に含まれる
アセトニトリルとジクロロメタンを留去した。その残渣
にジクロロメタン３００ｍｌを加え、綿栓ろ過したの
ち、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２００ｍｌで１
回、飽和食塩水でそれぞれ２００ｍｌで３回洗浄し、次
いで無水硫酸ナトリウム１０ｇを加えて乾燥し、綿栓ろ
過したのち減圧下濃縮し、ここに含まれるジクロロメタ
ンを留去した。精製することなくその残渣をメタノール
６０ｍｌ、２８％アンモニア水３０ｍｌ、水１５ｍｌの
混液に懸濁し、３５℃で２０時間かきまぜながら反応さ
せた。次いで反応液を減圧下濃縮し、ここに含まれる
水、及びメタノールを留去した。得られた残渣をＯＤＳ
ゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、エタノー
ル−水混液（容量比１：４）で溶出した目的区分を濃縮
し、水から再結晶して目的の２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル＝６^５−アジド−６^５−デオキシ−β−Ｄ−マル
トペンタオシドを２．４７ｇ（２．４５ｍｍｏｌ，収率
４１．８％）得た。

【００８２】融点（℃）：１３０．０〜１３５．０
（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ（ＭｅＯＨ中） ］（ｎｍ）＝２９０（ｌｏｇε＝
３．９８），２２７（ｌｏｇε＝３．９９），２０９
（ｌｏｇε＝４．２０）

【００８３】赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-１）：３４１
０，２９３０，２１１０，１５８４，１５２０，１４８
４，１２７４，１１５０，１０７８，１０２４

【００８４】核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐ
ｐｍ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：３．０５〜３．９０（ｍ），
４．２０〜４．５５（ｍ），４．７４（１Ｈ，ｂｒ．
ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），４．９６（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ
＝５．４Ｈｚ），５．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈ
ｚ），５．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．２
５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．２５〜５．６０
（ｍ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．
１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２．７Ｈｚ），
８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）

【００８５】高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）
製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ
ＩＤ×２５０ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリ
ル／水＝３：１（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ］：Ｒ^ｔ＝６．７ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５１６，Ｈ_２Ｏ）；＋９
２．４° 元素分析：Ｃ_３６Ｈ_５３ＣｌＮ_４Ｏ_２７として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４２．８４ ５．２９ ５．５５ 実測値（％） ４２．８８ ５．３１ ５．５９

【００８６】参考例２ ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６^５−アジド−６^５
−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシドを用いるα−
アミラーゼ活性の測定 （１） 基質液の調製 参考例１で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６^５
−アジド−６^５−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシ
ド（Ｍｗ１００９）を２．２８ｍＭの濃度になるよう
に、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ_２を含有
する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。

【００８７】（２） 共役酵素液の調製 酵母由来の市販α−グルコシダーゼ及びアーモンド由来
の市販β−グルコシダーゼをそれぞれ１１７ｕ／ｍｌ、
１３ｕ／ｍｌの濃度になるように４０ｍＭ−ＮａＣｌ及
び２ｍＭ−ＭｇＣｌ_２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に混合して溶解した。なお、これら市販
のα−及びβ−グルコシダーゼは東洋紡績（株）製を使
用した。

【００８８】（３） 標品α−アミラーゼ液の調製 市販のヒトα−アミラーゼ（Ｐ：Ｓ＝１：１）に精製水
を加え、０，１４８，２８４，４０１，５２５ＩＵ／ｌ
の濃度に溶解して標品α−アミラーゼ液とした。なお、
この市販のヒトα−アミラーゼは国際試薬（株）製キャ
リブザイム・ＡＭＹを使用した。また、α−アミラーゼ
の活性は、３７℃、１分間に１μｍｏｌの２−クロロ−
４−ニトロフェニル＝β−Ｄ−マルトペンタオシド（市
販品）を分解する酵素量を１国際単位（ＩＵ）として定
義した。

【００８９】（４） 試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とする。固体の場合は通常、試料５００ｍｇを正
確に秤量し、精製水を加えて全量を５ｍｌとして試料液
とした。必要に応じて、不溶物をろ過などの操作で除去
してから用いた。

【００９０】（５） 検量線の作成 標品α−アミラーゼ液２５０μｌに共役酵素液１．０ｍ
ｌを加えてかきまぜ、３７℃で１分間加温したのち、基
質液２．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で２分間加温
したのち、２分間の４００ｎｍにおける吸光度の変化量
を測定した。各標品α−アミラーゼ液の活性と、吸光度
の変化量の関係より検量線を作成した。その結果検量線
の式は Ｕ＝８．６６・△Ａ×１０^３−６．７ ［Ｕ；酵素活性（ＩＵ／ｌ）、△Ａ；吸光度の変化量］ となった。そのグラフを図１に示す。

【００９１】（６） 試料液中のα−アミラーゼ活性の
測定 試料液２５０μｌに共役酵素液１．０ｍｌを加えてかき
まぜ、３７℃で１分間加温したのち、基質液２．０ｍｌ
を加えてかきまぜ、３７℃で２分間加温したのち、２分
間の４００ｎｍにおける吸光度の変化量を測定した。こ
の測定値と（５）で作成した検量線から算出して試料中
のα−アミラーゼ活性の測定を行うことができる。な
お、試料液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲（０〜
５２５ＩＵ／ｌ）を越えた場合は精製水を用いて相当す
る倍数の希釈を行ったのち、再測定を行う。

【００９２】なお、前記（１）の基質は、前記（２）の
共役酵素と反応することなく、測定系内で安定に存在す
ることが確認されている。

【図面の簡単な説明】

【図１】 参考例２におけるα−アミラーゼ活性の測定
に用いる検量線のグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 冨倉 正 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 小谷 一夫 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一化 学薬品株式会社東京技術センター内 (72)発明者 戸辺 光一朗 千葉県野田市野田339番地 盛進製薬株式 会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中のｎは１〜６の整数である）で表わされる非還元
   末端アジド化マルトオリゴ糖。
2. 【請求項２】 ６−アジド−６−デオキシシクロデキス
   トリンに、（イ）シクロデキストリンを開裂し、シクロ
   デキストリンのグルコース重合度に由来するマルトオリ
   ゴ糖を生成させる作用及び（ロ）シクロデキストリンに
   対する水解速度又は親和性が多糖類あるいはシクロデキ
   ストリンと同じ重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質
   特異性を有するシクロデキストリナーゼを作用させると
   同時に、又は作用させたのちに、エキソ型糖化酵素類を
   作用させることを特徴とする請求項１記載の非還元末端
   アジド化マルトオリゴ糖の製造方法。