JPS63170393A - 非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体の新規な製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、α−アミラーゼ活性測定用基質として有用な
非還元末端修飾オリゴサツカライド誘導体の新規な製造
法、並びに、α−アミラーゼ活性測定用基質として有用
な新規なオリゴサツカライド誘導体に関する。

〔発明の背景〕

試料、特にヒト生体内の唾液、膵液、血液、尿中のα−
アミラーゼ活性の測定は医学上の診断において重要であ
る。例えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎においては、血液
や尿中のα−アミラーゼ活性は通常の値に比べて著しい
上昇を示す。

α−アミラーゼ活性の測定方法については、これまで種
々の方法が発表されているが、大別すると、でんぷん、
アミロース、アミロペクチン等の長鎖の天然物及びその
修飾物を使用する方法と、グルコース残基数が４〜７個
のオリゴサツカライド及びその誘導体を使用する方法の
２種に分けられる。

しかしながら、最近では、例えばマルトテトラオース、
マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプ
タオース等のオリゴサッカライＰを基質に用いる方法（
特開昭５０−５６９９８号公報、特開昭５３−３７０９
６号公報）やｐ−ニトロフェノール等の色原体を還元末
端に結合したオリゴサッカライＰを用いる方法（特開昭
５４−５１８９２号公報）等、均一で構造の明確な基質
を用いる方法がこれまで多く使用されてきたデンプンを
用いる方法に代わってアミラーゼ測定法の主流となりつ
つある。

これらの方法では通常、測定用共役酵素としてα−グル
コシダーゼ（Ｅ、Ｃ，３，２，１，２０；α−Ｄ−グル
コシドグルコヒドロラーゼ）又はグルコアミラーゼ（Ｅ
、Ｃ，３，２，１，３；　１．４−α−Ｄ−グルカング
ルコヒＦロラーゼ）、又はβ−グルコシダーゼ（Ｅ、Ｃ
。

３．２．１．２１　；β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロ
ラーゼ）を必要とする。

これらの共役酵素は、α−１，４−グルコシド結合を有
する糖鎖の非還元性末端からα−１，４−グルコシド結
合を加水分解するエキソタイプの酵素であり、α−アミ
ラーゼ反応に関係なく基質を分解してしまう欠点を有す
る。この為これら共役酵素を用いる上記測定法に於ては
、測定用試液が不安定で、試薬盲検値が極めて高くそれ
により測定精度を著しく悪くしていた。さらに測定に充
分な量のグルコアミラーゼ、あるいはα−グルコシダー
ゼを使用できず、正確で且つ精度の高い測定法の組立が
困難であった。

かかる問題点を解決すべく、本発明者らは、これまで数
種の新規な修飾オリゴサッカライＰを合成し、これらを
用いるα−アミラーゼ活性の測定法について特許出願し
ている。

例えば、α−アミラーゼ活性を測定するに際し、グルコ
ースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサッカライト°の
非還元末端グルコースの６位の一級アルコール（−ＣＨ
２０Ｈ）が一般式−ＣＨ２Ｒで表わされる基で置換され
た下記構造式を有するオリゴサツカライド誘導体を基質
として使用するα−アミラーゼ活性の測定法がある（特
開昭５９−５１８００号）。

（式中、右端のグルコース単位は還元性基、ｋは２〜５
の整数であり、Ｒば、例えば２−ピリジルアミノ基を表
わす。） これらの基質は、均一で構造が明確でありα−グルコシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ又ハクルコアミラーゼの基
質とならない点に特徴を有している。しかしながら、こ
れらの基質を用いてα−アミラーゼ活性を測定するには
、高速液体クロマトグラフィー法によるか、或はα−グ
ルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラー
ゼを共役酵素に用いて生成するグルコースを測定する方
法によらねばならず、前者は特殊な機器を必要とする点
、後者は検体中に含まれるグルコースにより影響を受け
る点等に問題があった。

そこで、本発明者らは更に研究を重ね、このような問題
のないα−アミラーゼ活性測定法を見出し、これを特許
出願している（特開昭６１−８３１９５号）。

即ち、グルコースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサツ
カライドの非還元末端グルコースの６位の一級アルコー
ル（−ＣＨ２０Ｈ）が−ＣＨ２Ｒｏ１で示されるウンベ
リフェリル基で置換された、下記構造式〔１〕、を表わ
す。（但し、Ｒｏ３〜Ｒｏ６　　は水素、低級アルキル
基、低級アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、ス
ルホン酸基又は）・ログンを表わし、夫夫同じであって
も異なっていても良く、Ｒｏ７は水素、低級アルコキシ
基、ノ・ログン又はニトロ基を表わす。また、Ｒｏ８は
水素、メチル基又はトリフルオロメチル基を表わす。）
〕 で示されるオリゴサッカライＰ誘導体を基質として用い
るα−アミラーゼ活性測定法がそれである。

この測定法は従来のα−アミラーゼ活性測定法が有する
種々の問題点を全て解決した優れた測定法ではあるが、
基質として用いる非還元末端修飾オリゴサッカライＰが
、デキストリンやアミロースを出発原料とする従来の製
法によってでは極めて低収率でしか得ることができず、
その製法が反応工程が長く煩雑な製法であることと相俟
って実用化（企業化）に際し問題が残る。一方、シクロ
マルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（Ｅ、
Ｃ，２゜４．１．１９）が、シクロデキストリンとアク
セプターに作用し、還元末端にアクセプターが結合した
直鎖状オリゴサツカライドを生成することは以前から知
られていた（Ｊ、Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　７２
巻。

１２０２〜１２０５頁、１９４９年）。しかしながら修
飾したシクロデキストリンとアクセプターにこれを作用
させた場合に同様に還元末端にアクセプターが結合した
直鎖状オリゴサッカライＰが得られるか否かについては
詳らかではなく、特開昭６０−２３７９９８号公報には
これの可能性を示唆する記載があるが、同公報に開示さ
れている方法に従ってこれを行っても実際には目的物は
得られない。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、α−アミラーゼ活性測定用基質として
有用な非還元末端修飾オリゴサッカライｒが容易に且つ
収率よ〈得られる製造方法を提供することにある。

〔発明の構成〕

本発明は、修飾シクロデキストリンにアクセプターの存
在下シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラ
ーゼを作用させ、然る後、グルコアミラーゼ又はα−グ
ルコシダーゼを作用させることを特徴とする非還元末端
修飾オリゴサッカライｔの製造法、並びに、式〔Ｉ〕 〔式中、Ｒ１はアルコキシメチル基、ベンジルオキシメ
チル基、アミノメチル基、カルボキシル基又はハロメチ
ル基を表わし、Ｒ２は （但し、Ｒ３−Ｒ６は水素、低級アルキル基、低級アル
コキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スルホン酸基又
は）・ロケ゛ンを表わし、夫々同じであっても異なって
いても良く、また、Ｒ３とＲ５又はＲ４とＲ６とが結合
して芳香環を形成していても良い。Ｒ７ハ水素、低級ア
ルコキシ基、ノ・ロケ°ン又はニトロ基を表わす。また
、Ｒ８は水素、メチル基又はトリフルオロメチル基を表
わし、Ｒ９は水素又はノ・ロケ゛ンを表わす。）を表わ
し、ｎは２〜５の整数を表わす。〕 で示されるオリゴサツカライド誘導体の発明である。

本発明の製造法で用いられる修飾シクロデキストリンと
しては１分子中に１個の修飾グルコースを有するものが
好ましいが、２個又はそれ以上のものが混在していても
特にこれを妨げない。

修飾グルコースとしては、グルコースの水酸基が、例え
ば、２−ピリジルアミノ基、３−ピリジルアミノ基等の
如く螢光性を有する置換基、アニリノ基、メチルアニリ
ノ基、ヒＰロキシアニリノ基　カルボキシフェニルアミ
ノ基の如くＵＶ吸収を有する置換基、メトキシ基、エト
キシ基等のアルコキシ基、カルボキシメトキシ基、ヒド
ロキシエトキシ基、ベンジルオキシ基、フェネチルオキ
シ基、ピリジルメチルオキシ基等の置換アルコキシ基、
塩素、臭素等の）・ロケ°ン原子、ヒドラゾノ基、フェ
ニルヒドラゾノ基又はアミノ基等で置換された修飾グル
コース、若しくはグルコースの６位の−ＣＨ２０Ｈ基が
一〇〇〇Ｈ基で置き換ったグルクロン酸等が挙げられる
。

本発明の製造法で用いられるアクセプターとしテハ、ク
ルコース、マルトース、マル）　ｌ−’Ｊオース及びこ
れらの誘導体が挙げられる。マルトテトラオース以上の
オリゴサツカライドでは反応が遅く、且つ副反応が起る
ので好ましくない。一方、グルコース鎖が長くなると、
反応初期の主生成物のグルコース鎖も長くなる。従って
、目的物のグルコース鎖長に従って、上記グルコース鎖
長１〜３のアクセプターを適宜選択して用いればよい。

アクセプターとしてグルコース誘導体を用いる場合、置
換基の位置は１位が好ましく、１位であればα−置換、
β−置換のいずれにてもよいが、２．３．６位置換のも
のは反応が進み難いのであまり好ましくない。２，３．
６位置換のものが欲しい場合にはマルトースの還元末端
グルコースの２．３．６位に置換基を導入したものを用
いればよい。

アクセプターとして用いられる修飾グルコースの１位水
酸基の置換基としては、例えば（但し、Ｒ５−Ｒ６は水
素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、カ
ルボキシル基、スルホン酸基又はハロケ゛ンを表わし、
夫々同じであっても異なっていても良く、また、Ｒ３と
Ｒ５又はＲ４とＲ６とが結合して芳香環を形成していて
もよい。Ｒ７は水素、低級アルコキシ基、）・ログン又
はニトロ基を表わす。また、Ｒ８は水素、メチル基又は
トリフルオロメチル基を表わし、Ｒ９は水素又はノ・ロ
ケ。

ンを表わす。）で示される、置換基を有していてもよい
フェノキシ基、置換基を有していてもよいナフトキシ基
、置換基を有していてもよいウンベリフェリル基又は置
換基を有していてもよいインドキシル基等が挙げられる
。また、これら１位水酸基の置換基の具体例としては、
例えば、ｐ−ニトロフェノキシ基、ｍ−ニトロフェノキ
シ基、〇−クロロフェノキシ基、ｐ−クロロフェノキシ
基、２．６−ジクロロフェノキシ基、０−メトキシフェ
ノキシ基、ｐ−メトキシフェノキシ基、０−メチルフェ
ノキシ基、〇−カルボキシフェノキシ基、０−スルホフ
ェノキシ基、１−ナフトキシ基、２−スルホ−１−ナフ
トキシ基、２−カルボキシ−１−ナフトキシ基、ウンベ
リフェリル基、４−メチルウンベリフェリル基、インド
キシル基等が挙げられるが、これらに限定されるもので
はない。

本発明の製造法で用いられるシクロマルトデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ（以下、ＣＧＴａｓｅと略
す。）の起源、由来に特に限定はなく、例えば、バチル
ス　マセランス由来のもの、ノＺチルス　メガテリウム
由来のもの、クレブシェラニューモニエ由来のもの、ア
ルカリ細菌由来のもの等、いずれの由来のものにてもよ
い。

また、本発明の製造法で用いられるグルコアミラーゼ又
はα−グルコシダーゼの起源、由来についても特に限定
はない。

本発明の製造法で用いられる修飾シクロデキストリンは
、α、β又はγ−シクロデキストリンを原料とし、例え
ば、メソツＰ　イン　カーボ／ＳイＰレイトケミストリ
ー１　（１９６２）〜Ｖ　（１９６５）アカデミツク　
プレス　等に記載の各種修飾グルコースの製法に準じて
、これを目的とする修飾基を導入するための各種反応試
剤と反応させることにより容易に得られる。α、β、ｒ
−いずれのシクロデキストリンを選ぶかは任意であり目
的とする修飾オリゴサツカライド誘導体のグルコース鎖
長に応じてそれらが最も収率よ〈得られるものを適宜選
択すればよい。

アクセプターの存在下修飾シクロデキストリンにＣＧＴ
ａｓｅを作用させて反応させる際の反応時のＰＨは用φ
るＣＧＴａｓｅの由来により若干具なるが、通常６〜８
である。同ＰＨに保つために用いられる緩衝剤は酵素反
応を阻害しないものであればいずれにてもよく、例えば
、グツト°の緩衝剤、酢酸アンモニウム、炭酸塩、リン
酸塩等が挙げられる。

本発明の製造法で用いられる修飾シクロデキストリンの
濃度は通常１〜５０　ｍ　ｍｏｌＡ、またアクセプター
の濃度は通常５　ｍ　ｍｏｌ／１以上、溶解度限界まで
であるが、修飾シクロデキストリンとアクセプターのモ
ル比は前者１に対し後者が５以上であることが望ましい
。また、本発明の製造法で用いられるＣＧＴａｓｅの使
用量は通常５０〜５０００Ｕ／ｒｎｌであり、反応は通
常２０〜５０℃で行われる。ＣＧＴａｓｅによる酵素反
応終了後は加熱によりこれを失活させる（例えば９０℃
以上で１０分間以上）か、ＰＨを変動させて（例えばｐ
Ｈ４，０以下）その作用を失わしめる。

グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼによる反応は
、通常その至適ｐＨ（通常４〜６）で行われ、その使用
量は、いずれも通常５〜１００　Ｕ／ｍｌである。

本発明の製造法によれば、α−アミラーゼ活性測定用基
質として、或はヒトα−アミラーゼの各アイソザイム活
性の分別測定用基質として有用な非還元末端修飾オリゴ
サツカライドを簡単な反応操作で、収率よ〈得ることが
できる。

また、本発明に係る式〔Ｉ〕 〔式中、Ｒ１はアルコキシメチル基、ペンノルオキシメ
チル基、アミノメチル基、カルボキシル基又はハロメチ
ル基を表わし、Ｒ２は （但し、Ｒ３−Ｒ９は前記と同じ。）を表わし、ｎは２
〜５の整数を表わす。〕で示されるオリゴサッカライＰ
誘導体はいずれも文献未載の新規化合物であり、いずれ
もα−アミラーゼ活性測定用基質として、或はヒトα−
アミラーゼの各アイソザイム活性の分別測定用基質とし
て極めて有用な化合物である。

本発明に係るオリゴサツカライド誘導体を基質として用
いるα−アミラーゼ活性測定法の測定原理は概路次の通
りである。

グルコアミラーゼ （式中、Ｇはグルコース単位を表わし、Ｒ１は非還元末
端グルコースの６位の置換基を表わし、ｍｌとｍ２はそ
の和が２から５である１以上の整数を表わし、ＯＲ２は
還元末端グルコースの１位に置換された置換基を有して
いてもよいフェノキシ基、置換基を有していても良いナ
フトキシ基、置換基を有していてもよいウンベリフェリ
ル基又は置換基を有していてもよいインドキシル基を表
わす。）即ち、先ず始めに、本発明に係るオリゴサツカ
ライド誘導体に試料中のα−アミラーゼが作用して、非
還元末端グルコースの６位の一級アルコーＩ 元末端グルコースの１位に置換基を有していてもよいフ
ェノキシ基、置換基を有していても良いナフトキシ基、
置換基を有していてもよいウンベリフェリル基又は置換
基を有していてもよいインドキシル基がついたＧｍ２−
Ｇ−ＯＲ２が生成し、次いで、こノＧｍ２−Ｇ−ＯＲ２
にグルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グル
コシダーゼ等の共役酵素が作用して、（ｍ２＋１）Ｇと
Ｒ２−ＯＨが生成する。このＲ２−ＯＨを、例えばＲ２
−ＯＨがｐ−ニトロフェノールの如きニトロフェノール
類の場合には、直接その吸収スペクトルを（例えば４０
５　ｎｍに於ける吸光度を）測定することにより、また
、Ｒ２−ＯＨが、例えばフェノール、ｏ−クロロフェノ
ール、２．６−シクロロフエノール、ｐ−メトキシフェ
ノール等の如きニトロ基をもたないにトロ基をもってい
ても良いが）フェノール類或はナフトール類の場合には
、カテコールオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ
又はモノフェノールオキシダーゼの如き酸化酵素類又は
ヨウ素酸、過ヨウ素酸の如き酸化剤を作用させて、４−
アミノアンチピリン、３−メチル−２−ペンゾチアゾリ
ノンヒにラゾ／（ＭＢＴＨ）等のカプラーとカップリン
グ（酸化縮合）させ、生成する色素の吸収スペクトルを
測定することにより、或はＲ−ＯＨがウンベリフェロン
、４−メチルウンベリフェロンの如く螢光を有する化合
物の場合には、その螢光強度を測定することにより、更
にはＲ２−ＯＨがインＰキシルの場合には、酸化されて
生成するインノボ色素の吸収スペクトルを測定すること
により、夫々試料中のα−アミラーゼ活性を求めること
ができる。

本発明のオリゴサツカライド誘導体を基質として用いる
α−アミラーゼ活性測定法に於て、基質として用いるオ
リゴサツカライド誘導体の濃度は特に限定されるもので
はないが、通常約０．１〜１０ｍＭが好ましく用いられ
る。

本発明のオリゴサンカライド誘導体を基質として用いる
α−アミラーゼ活性測定法に於て測定対象となる試料は
、α−アミラーゼを含有する検体なら何れを用いてもよ
く、例えば生体成分として血液、血清、尿等があげられ
る。

共役酵素のグルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ又は
β−グルコシダーゼとしては、特に限定されないが例え
ば動物、植物、微生物由来のものが利用出来、夫々単独
で、或は組み合せて用いられる。これら共役酵素の使用
量は通常０．５〜５０単位／　ｍｌ、好ましくは２〜２
０単位／　ｍｌである。

また、本発明を実施する測定条件として、反応温度は特
に限定されないが、好ましくは約２５〜４０℃であり、
反応時間は目的により自由に選択できる。

至適ＰＨとしては特に限定されないが、ＰＨ約６〜８が
好ましい例である。至適ＰＨを維持する緩衝剤は自由に
選択でき、例えば、リン酸塩、トリスハイドロキシメチ
ルアミノメタン−塩酸、グツドの緩衝剤などが任意に選
ばれる。

さらにα−アミラーゼの賦活剤として、例えば塩化ナト
リウム、塩化カルシウム、塩化カリウム等が使用される
。

共役酵素の作用により遊離したフェノール類又はナフト
ール類とカップリング（酸化縮合）させるカプラーとし
ては、４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）　、ｐ−アミノ
−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン等が挙げられるが、これら
に限定されるものではない。フェノール類又はナフトー
ル類とカプラーとをカップリング（酸化縮合）させる為
の酸化酵素としては、ラッカーゼ、カテコールオキシダ
ーゼ、チロシナーゼ又はモノフェノールオキシダーゼ等
が挙げられるが、これらは例えば、動物、植物、微生物
由来のものが、いずれも利用でき、通常０．２〜１０単
位／　ｍｌ、好ましくは０．５〜４４位／　ｒｎｌの範
囲で使用される。また、カップリング（酸化縮合）させ
る為の酸化剤としては、ヨウ素酸又は／及びその塩、過
ヨウ素酸又は／及びその塩、過酸化水素等が挙げられる
が、これらに限定されない。

本発明に係るオリゴサツカライド誘導体は、その非還元
末端グルコースの６位の一級アルコール（−ＣＨ２０Ｈ
）が−Ｒ１なる基に置換されている為、そのままではグ
ルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシ
ダーゼの基質とはならず、しかも水に易溶で、α−アミ
ラーゼとの親和性に優れているので、α−アミラーゼの
良好な特異基質となる。従って、本発明のオリゴサツカ
ライド誘導体を基質として用いる測定法に於ては、副反
応が起らず試薬盲検値は極めて小さく、測定用試液が極
めて安定である。また、単一の化合物を基質とすること
から、反応の化学量論が成立し、α−アミラーゼの動力
学的検知が可能となる。

また、本発明のオリゴサツカライド誘導体を基質として
用いるα−アミラーゼ活性測定法に於ては、グルコアミ
ラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソマルターゼ又はβ−
グルコシダーゼ等の共役酵素を充分に使用することがで
きるので、α−アミラーゼ反応以降の反応速度が速く、
より正確で精度のよいα−アミラーゼ活性の測定を行う
ことができる。

更に、本発明に係る測定法に於ては、検出を遊離してく
るニトロフェノール類若しくはインノコ゛色素類の吸収
スペクトルを測定するか、若しくは遊離してくるフェノ
ール類又はナフトール類を４−アミノアンチビリン、Ｍ
ＢＴＨ等と酸化カップリングし、その色素の吸収スペク
トルを測定するか、又は遊離してくるウンベリフェロン
頌の螢光強度を測定することにより行なうので、検体中
に共存するグルコース、マルトース等の糖類や、アスコ
ルビン酸、ビリルビン等の還元性物質の影響を殆んど受
けない。

本発明に係るアミラーゼ活性の測定方法は、一定条件で
の反応速度を測定するレイトアッセイでも、あるいは反
応停止剤を使用するエンドポイントアッセイとしてもよ
く、いずれの測定方法も実施可能である。

まだ、本発明に係る測定法は自動分析装置への適応性も
良く、必要に応じて用手法、自動分析のいずれにて行な
うも可である。

更にまた、本発明の基質を用いた場合には、色素の呈色
を測定する、所謂比色法で測定を行なうことができるの
で、簡便な試験紙法や反応試薬を含有させた多層分析シ
ート（多層一体型定量分析フィルム）を使用する所謂乾
式定量法にも応用することができる。

本発明に係るオリゴサツカライド誘導体は、また、本発
明者らが別に特許出願した特願昭６１−１８１５６４号
に記載の唾液腺由来のび一アミラーゼと膵由来のび一ア
ミラーゼの分別測定法、即ち、α−アミラーゼの加水分
解作用を受けて生じる分解生成物に、基質特異性の異な
る２種以上の共役酵素を作用させ、生じる成績体を測定
することによって、ヒト膵由来のα−アミラーゼとヒト
唾液腺由来のα−アミラーゼの分別測定を行う、α−ア
ミラーゼアイソザイムの分別測定法にも効果的な基質と
して充分使用可能である。

以下に実施例及び参考例を示すが本発明はこれら実施例
、参考例により何ら限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例ｔ、　　ｐ−ニトロフェニル　０−６−ジオキシ
−６−（（２−ピリジル）アミノ〕−α−り一グルコピ
ラノシル−（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシル
ー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→
４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−α
−Ｄ−グルコピラノシＰ（以下、ＦＧ５Ｐと略す。）の
合成（１）モノ−６−デ万キシ−６〔（２−ピリノル）
アミノツーβ−シクロデキストリン（以下、Ｆ−β−Ｃ
Ｄと略す。） の合成 β−シクロデキストリン２０　ｇ、　ＤＣＣ（ノシクロ
ヘキシルカルボノイミ）”）３０．４ｇをＤＭＳＯ（ジ
メチルスルホキシド）１２０ｍｌに溶解し、ジクロル酢
酸２．６　ｍｌを加えて室温で３０分攪拌した。シュウ
酸１２．８ｇをメタノール５　Ｑ　ｍｅに溶解したもの
をこれば加え、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液でＰＨ９とし
た。２−アミノピリジン１．６タを水２００　ｍｌに溶
解したものをこれに加え、更にピリジルボラン３．６１
を加えて６５〜７０℃で２時間反応させた。

水７００ｖＬｌを加えて不溶物を戸去し、塩酸でｐＨ７
とした後水素化ホウ素ナトリウム２．４ｇを加え室温で
１時間反応させた。塩酸を加えｐＨ３として過剰の水素
化ホウ素ナトリウムを分解し、後アンモニア水を加えて
ｐＨ７，０とした。アセトン２１を加え析出した沈澱を
戸数してＦ−β−ＣＤ３．０ｇを得た。

元素分析　Ｃ４７Ｈ７４０３４Ｎ２ Ｃチ　　　Ｈ％　　８％　　０％ 計算値　４６．６１　　６，１６　　２．３１　４４．
９２実測値　４６．６１　６，１７　２．４２　４４．
８０（２）ＦＧ５Ｐの合成 Ｆ−β−ＣＤＩ（１，９−二トロフェニル　α−グルコ
シ２１０ｇを１０　ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
６，５）Ｉｌに溶解しＣＧＴａｓｅ　１０００ｋＵを添
加して３７℃ｆ’５時間反応させた。次いで酢酸でＰＩ
（４，０とした後、グルコアミラーゼ（リゾプス　ニベ
ウス由来）を２０　ｋＵ添加し、３７℃で１０時間反応
させた。反応液を凍結乾燥後、５０ｍＭ酢酸で平衡化し
たＢｉｏ　−Ｇｅｌ　Ｐ−２（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ社）を
充填したカラム（３０ＸＩ　５０．０ｒＨＲ）で精製を
行ない、ＦＧ５Ｐ１、ＩＩを得た。

ｐ−ニトロフェニル　α−グルコシｙ１ｏｙの代すにｐ
−ニトロフェニル　β−グルコシｒ１０Ｉを用い、同様
に反応、後処理を行ってＦＧ５Ｐのβ体２，５ｙを得た
。

尚、構造の確認は特開昭６１−８３１９５号公報に記載
の同化合物の確認方法に従って行った。

実施例２．　　ｐ−ニトロフェニル　０−（２−０−カ
ルボキシメチル）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（ｌ→４）−〇
−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ
−グルコピラノシルー（１→４）−α−Ｄ−グルコピラ
ノシＰ（以下、Ｃ二ｖＩＧ５　Ｐと略す。）の合成 （１）モノー〇−カルボキシメチルーβ−シクロデキス
トリン（以下、ＣＭ−β−ＣＤと略す。）の合成β−ン
クロデキストリン１５．（１，水酸化ナトリウム１３．
５．７を水１２０ｒｎｌに溶解し、１０％モノクロル酢
酸水溶ｆｌ　９　Ｑ　ｍｌを加えて２５℃で５時間攪拌
した。６Ｎ塩酸でｐＨ７，０としたのちアセトン６００
　ｖｒｌを那えて析出した結晶を戸数し、ＣＭ−β−Ｃ
Ｄ１２ｇを得た。

元素分析　Ｃ４４Ｈ７５０３７ＮＣ４４Ｈ７５０３７Ｎ
塩）Ｃ多　　　　　Ｈ矛　　　　Ｏチ　　　　Ｎチ計算
値　４３．６７　６．２５　４８．９２　１．１６実測
値　４３．６６　６．２８　４８．８６　１．２０（２
）ＣＭＧ５Ｐの合成 ＣＭ−β−ＣＤＩＯＮ、ｐ−ニトロフェニルグルコシｒ
’０．ｐを１０　ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６
，５）１１に溶解し、ＣＧＴａｓｅ　１０００ｋＵを添
加して３７℃で５時間反応させた。次いで酢酸でｐＨ４
，０とした後、グルコアミラーゼを２０　ｋＵ添加し、
３７℃で１０時間反応させた。反応液を凍結乾燥後、５
０ｍＭ酢酸で平衡化したＢｉｏ　−Ｇｅｌ　Ｐ−２（Ｂ
ｉｏ　−Ｒａｄ社）を充填したカラム（３０Ｘ１５００
ｍｍ）で精製を行ない、ＣＭＧ５Ｐ　３　ｇを得た。

実施例３、　フェニル　０−（α−Ｄ−グルコピラノシ
ルウロニクク酸）−（ｌ→４）−〇−α−Ｄ−グルコピ
ラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシル
ー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→
４）−α−Ｄ−グルコピラノシｒ（以下、カルボキシル
Ｇ５Ｐと略すっ　）の合成 （１）モノカルボキシル−β−シクロデキストリノ（以
下、カルボキシル−β−ＣＤと略す。）の合成β−シク
ロデキストリン５０．９を水１１に溶解し、プラチナ−
カーボン（１０％）５１イソプロパツール２．５　ｍｌ
　、を加えて、攪拌下、７０℃で空気を５０　ｍ４／′
ｍｉｎの流速で通じた。１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液を
滴下してＰＨを中性に保ちなから２．５時間反応させた
後、濾過し、涙液をイオン交換クロマトグラフィー（Ｄ
ｏｗｅｘ　［）に付し、カルボキシル−β−ＣＤ１０．
５Ｆを得た。

元素分析　Ｃ４２Ｈ７１０，６ＸＭＷ１１６５（ＮＨ４
塩）Ｃ％　　　Ｈ％　　　０％　　　Ｎ係 計算値　４３．２５　６．１４　４９．４１　１．２０
実測値　４３．３０　６．１６　４９．４０　１．１４
（２）カルボキシルＧ５Ｐの合成 カルボキシル−β−ＣＤ　Ｉ　０．９　、　　フェニル
グルコシド１０Ｉを１０　ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液
（ｐＨ６，５）Ｉｌに溶解し、ＣＧＴａｓｅ　１０００
　ｋＵを添加して３７℃で１時間反応させた。次いで酢
酸でＰＨ４０とした後グルコアミラーゼを２０　ｋＵ添
加し、３７℃で１０時間反応させた。反応液を凍結乾燥
後２０　ｍＭ酢酸で平衡化したＢｉｏ　−Ｇｅｔ　Ｐ−
２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を充填したカラム（３０Ｘ２４
００ｍｍ）で精製を行ない、カルボキシルＧ５Ｐ　１．
２　ｇ　ヲ得ｋ。

得られたカルボキシルＧＳＰ中のｐ−＝）ロフェニル基
に対するグルコース“残基の数を次のようにして測定し
た。がルボキシルＧ５Ｐを１．４　Ｎ塩酸−メタノール
で９０℃、２時間メタツリシスした。

濃縮後、トリメチルシリル化し、２喝０Ｖ−１７（０，
４×２００Ｃｒｎ）のカラムを用い、１１０℃から２５
０℃まで４℃／分の昇温プログラムを用いて、グルコー
ス量を定量した。また、フェニル基は、０．１　Ｍ酢酸
中での２６５　ｎｍの吸光度から定量した。その結果カ
ルボキシルＧ５Ｐのグルコース／フェノールの比は３．
９であった。

上で得た結果と、カルボキシルＧ５Ｐがグルコアミラー
ゼの作用を受けないことがら、カルボキシルＧ５Ｐの構
造は、次のものであると考えられる。

本化合物のマススペクトルを第１図に示す。

実施例４．０−６−ジオキシ−６−（：（２−ピリジル
）アミノ〕−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−
Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グル
コピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノ
シルー（１→４）−ｐ−グルシトール（以下、ＦＧ６Ｒ
と略す。）の合成 実施例１の（１ンと同様にして得たＦ−β−ＣＤ１０＆
及びマルトトリイトール５０．９を１０ｍＭ酢酸アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ６，５）ＩＪに溶解し、ＣＧＴａｓ
ｅｌｏｏｏ　ｋＵを添加して３７℃で５時間反応させた
。

次いで酢酸でＰＨ４，０とした後グルコアミラーゼを２
０　ｋＵ添加し、３７℃で１０時間反応させた。反応液
を凍結乾燥後、５０　ｍＭ酢酸で平衡化したＢｌｏ−Ｇ
ｅ１Ｐ−２（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ社）を充填しだカラム（
３０Ｘ　１５００ｗ＋）で精製を行ない、ＦＧ６Ｒ１，
２、！９を得だ。

実施例５．　　フェニル　０−（６−アミノ−６−デオ
キシ）−α−Ｄ−グルコピラノンルー（１→４）−〇−
α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−
グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピ
ラノシルー（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシド（以
下、アミノＧ５Ｐと略す。）の合成 （１）モノ−６−０−ｐ−）ルエンスルホニル　シクロ
デキストリンの合成 β−シクロデキストリン５．０ｇをピリノン１００ｒｎ
ｌ　ニ溶解し、ｐ−）ルエンスルホニルクロＩＪ　ｒｏ
、ｓＩを加えて４℃で１５時間攪拌した。減圧濃縮後、
活性炭を充填したカラム（５ｘ６０ＣｎＩ）にチャージ
し、水、３０チエタノール、２５％ｎ−プロ／Ｊ？７ノ
ール、各々３１で溶出させた。２５％ｎ−ブロックノー
ル画分を集め減圧濃縮し６−Ｏ−ｐ−）ルエンスルホニ
ル　シクロデキストリン０．７．７を得た。

（２）モノ−６−アット−６−デオそンーβ−ンクロデ
キストリンの合成 ６−Ｏ−ｐ−）ルエンスルホニル　シクロデキストリン
１．０ｇを８０ｒｎｌの水に溶解し、窒化ナトリウム１
ｇを加えて９５℃、９０分反応させた。

反応後反応液を減圧濃縮しグル濾過（Ｂｉｏ　−Ｇｅｌ
　Ｐ−２戸ζより分離精製してモノ−６−アジトー６−
デオキンーβ−シクロデキストリン０．７Ｆを得た。

（３）アミノＧ５Ｐの合成 モノ−６−アツドー６−デオキシーβ−シクロテキスト
リンｏ、ｓｙ、フェニル　α−Ｄ−グルコピラノシｌ’
　０．５　ｇを１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝’ｆＧ　
（ｐＨ６，５）　５０ｒａｌに溶解し、ＣＧＴａｓｅ　
５０　ｋＵを添加して３７℃で２時間反応させた。次い
で酢酸でＰＨ４，０とした後グルコアミラーゼ１　ｋＵ
を添加し、３７℃で１０時間反応させた。反応液に１０
係−パラジウム−カーボン０．１＆を加え２５℃で攪拌
下水素ガスを８時間吹き込んだ。反応液を凍結乾燥後、
ケ゛ル濾過（Ｂｉｏ　−Ｇｅｌ　Ｐ−２）により分離精
製してアミノＧ５Ｐ　８０■を得た。

得られたアミノＧＳＰ中のフェニル基に対するグルコー
ス残基の数を次のようにして測定した。アミノＧ５Ｐを
１．４　Ｎ塩酸−メタノールで９０℃、２時間メタツリ
シスした。濃縮後、トリメチルシリル化し、２％０Ｖ−
１７（０，４Ｘ２００ｃ！ｎ）のカラムを用い、１１０
℃から２５０℃まで４℃／分の昇温プログラムを用いて
、グルコース量を定量した。また、フェニル基は０．１
Ｍ酢酸中での２６５　ｎｍの吸光度から定量した。その
結果、アミノＧ５Ｐのグルコース／フェノールの比は３
．６であった。

上で得た結果と、アミノＧ５Ｐがグルコアミラーゼの作
用を受けないこと及びＴＬＣ板上でニンヒ１リンによる
発色が観察されたことより、アミノＧ５Ｐの構造は次の
ものであると考えられる。

本化合物のマススペクトルを第２図に示す。

実施例６、　ｐ−ニトロフェニル　ｏ−（６−０−ベン
ジル）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（ｌ→４）−〇−
α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−
グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピ
ラノシルー（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシド（以
下、ＢＧ５Ｐと略す。）の合成 （１）モノー〇−ベンジルーβ−シクロデキストリン（
以下、ベンツルーβ−ＣＤと略す。）の合成β−シクロ
デキストリン１５ｇ、水酸化ナトリウム１３．５５’を
水１２０ｍ１に溶解し、塩化ベンジル１５ｍ１を加えて
１０℃で２時間攪拌反応させた。

反応後６Ｎ塩酸でｐＨ７，０としたのちアセトン１１を
加えて析出した沈澱を戸数し、ベンジル−β−ＣＤ　５
　＃を得た（２位、３位、６位置換体の混合物）。

（２）　ＢＧ５Ｐの合成 ベンジル−β−ＣＤＩＯＦ、Ｉ）−二トロフェニルα−
Ｄ−グルコピラノシドＩＣＭ？を１０ｍＭ酢酸アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ６，５）Ｉｌに溶解し、ＣＣ；Ｔａ５
ｅ１０００　ｋＵを添加して３７℃で５時間攪拌反応さ
せた。次いで酢酸でＰＨ４，０とした後、グルコアミラ
ーゼを２０　ｋＵ添加し、３７℃で１０時間反応させた
。反応液を凍結乾燥後、５０　ｍＭ酢酸で平衡化したＢ
ｉｏ　−Ｇｅ１Ｐ−２（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ社）を充填し
たカラム（３０Ｘ１５００間）で精製を行ない粗ＢＧ５
Ｐ　（２位、３位、６位置換体の混合物）１．６Ｆを得
だ。これを、逆相の高速液体クロマトグラフィーで分離
精製し、６位置換体１８０ｍ９を得た。（２位置換体７
００ダ、３位置換体６５０　ｍ９　） ＨＰＬＣ：含量９６チ〔カラム：充填剤シリカケ゛ルＺ
−ＯＤＳ　、　５ＣＩＢ　（和光紬薬工業（株）商品名
、１０Ｘ１０Ｘ３００．溶出液１０　％　ＣＨ３ＣＮ　
　０．１　％　ＡｃＯＨと９０％ＣＨ３ＣＮ−０，１％
ＡｃＯＨとの直線的グラノエント、流速３　ｍＡ！／ｍ
ｉｎ　、　３０５　ｎｍで測定〕工Ｒ：第３図の通り。

１Ｈ−ＮＭＲ：第４図の通り。

まだ、実施例３．実施例５と同様にして求めたＢＧ５Ｐ
のグルコース／ｐ−ニトロフェノールの比ハ３．８であ
った。

上で得た結果と、ＢＧ５Ｐがグルコアミラーゼの作用を
受けないことから、ＢＧ５Ｐの構造は、次のものである
と考えられる。

実施例７．　　ｐ−ニトロフェニル　０−（６−０−メ
チル）−α−Ｄ−グルコ♂ラノシルー（１→４）−〇−
α−Ｄ−グルコピラノフルー（１→４）−〇−α−Ｄ−
グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピ
ラノシルー（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシド（以
下、ＭＧ５Ｐと略す。）の合成 （１）モノー〇−メチルーβ−シクロデキストリン（以
下、メチル−β−ＣＤと略す。）の合成β−シクロデキ
ストリンｌ０Ｉｉ、水酸化ナトリウム１３．１を水１２
ｏｎｌｌに溶解し、・ツメチル硫酸２．７１を加えて１
０℃で２時間攪拌反応させた。

反応後６Ｎ塩酸でＰＨ７，０としたのちアセトン１１を
加えて析出した沈澱を戸数し、メチル−β−ＣＤ２ｇを
得た。

（２）　ＭＧ５Ｐの合成 メチル−β−ｃＤ１０Ｌｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グ
ルコピラノシド１０ｇを１０ｍＭ酢酸７７％＝ウム緩衝
液（ｐＨ６，５’）Ｉｌに溶解し、ＣＣ；Ｔａ５ｅ１０
００ｋＵを添加して３７℃で５時間攪拌反応させた。次
いで酢酸でｐＨ４，０とした後、グルコアミラーゼを２
０　ｋＵ添加し、３７℃で１０時間反応させた。反応液
を凍結乾燥後、５０　ｍＭ酢酸で平衡化したＢｉｏ　−
Ｇｅｌ　Ｐ−２（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ社）を充填したカラ
ム（３０Ｘ１５００ｗｎ）で精製を行ない粗ＭＧ５Ｐ　
（２位。

３位、６位置換体の混合物）１．５９を得た。これを逆
相の高速液体クロマトグラフィーで分離精製し、６位置
換体１６（ｌりを得た。（２位置換体６８０■、３位置
換体５６０■）。

ＨＰＬＣ：含量９３％（測定条件は実施例６と同じ。）
。

また、実施例３．実施例５と同様にして求めたＭＧ５Ｐ
のグルツース／ｐ−ニトロフェノールの比は３．９であ
った。

上で得た結果と、ＭＧ５Ｐがグルコアミラーゼの作用を
受けないことから、ＭＯＳ　Ｐの構造は、次のものであ
ると考えられる。

実施例８．　　ｐ　−＝　）　ロフェニル　０−（６−
ブロモ−６−デオキシ）−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（工→４
）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−
α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−α−Ｄ−グル
コピラノシド（以下、ＢｒＧ５Ｐと略す。）の合成 （１）モノ−６−ブロモ−６−デオキシ−β−シクロデ
キストリン（以下、Ｂｒ−β−ＣＤと略す。）の合成 実施例５の（１）の方法に準じて合成したモノ−６０−
ｐ−トルエンスルボニル　シクロテキスト！ｊ　７５　
ｇヲＤＭＦ　２５０　ｍｌ　Ｋ溶解しリチウムプロマイ
Ｐ１５１を加えて２時間還流反応させた。反応液を減圧
濃縮後アセトン５００ｍＪを加えて析出した沈澱を戸数
しモノ−６−ブロモー６−デオキシ−β−シクロデキス
トリン２．３ｇを得た。

（２）ＢｒＧ５Ｐの合成 りｒ−β−ｃｐｉｙ、ｐ−二トロフェニル　α−Ｄ−グ
ルコピラノシＰ１．９を１０ｍＭ酢酸アンモニ゛ウム緩
衝液（ｐＨ６，５）　１００ｍｌに溶解しＣＧＴａｓｅ
ｌｏｏｋＵを添加して３７℃で５時間攪拌反応させた。

次いで酢酸を加えてｐＨ４，０とした後、グルコアミラ
ーゼを２０００Ｕ加えて３７℃で１０時間攪拌反応させ
た。反応液を濃縮し５０ｍＭ酢酸で平衡化したＢｉｏ　
−Ｇｅｌ　Ｐ−２（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ社）を充填したカ
ラム（３０Ｘ１５００＋ｎ＋ｎ）で精製をおこないＢｒ
Ｇ５Ｐ　０．１６９を得た。

ＨＰＬＣ：含量９７％（測定条件は実施例６と同じ。）
。

’Ｈ−ＮＭＲ：第５図の通り。

また、実施例３．実施例５と同様にして求めたＢｒＧ５
Ｐ　（ｆ）　クルコース／ｐ−ニトロフェノールノ比は
３．６であった。

上で得た結果と、ＢｒＧ５Ｐがグルコアミラーゼの作用
を受け々いことから、ＢｒＧ５Ｐの構造は、次のもので
あると考えられる。

参考例１．　α−アミラーゼ活性の測定〔測定試液〕 実施例６で得たＢＧ５Ｐ　３０　ｒｎ９をグルコアミラ
ーゼ４００単位、α−グルコシダーゼ３００単位及び２
０　ｍ　ｍｏｌＡ塩化カルシタカルシウム　０　ｍ　ｍ
ｏｌ／１２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（Ｍ
ＥＳ）−ＮａＯＨ緩衝液（ＰＨ６，９）　３　ｏｍｚに
溶解し、測定試液とした。

〔測定操作〕

測定試液２　ｍｌに検体血清１００μｌを加え、３７℃
に加温し、この反応液の波長４０５　ｎｍに於ける吸光
度変化を測定した。

別に、α−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い、上記
と同様に操作し、検量関係を求め、この検量線から検体
のα−アミラーゼ活性を求めた。

このときの標準検体の各希釈段階に於けるα−アミラー
ゼ活性（Ｓｏｍｏｇｙｉ単位／ｄｉ）と波長４０５　ｎ
ｍ　Ｉ／Ｃ於ける１分間当りの吸光度増加量（ΔＡ）と
の関係を第６図に示す。

第６図より明らかな如く、α−アミラーゼ活性（Ｓｏｍ
ｏｇｙｉ単位／ｄｌ）に対してプロットした吸光度増加
量（ΔＡ／ｍ１ｎ）を結ぶ検量線は原点を通る直線とな
り、検量線は良好な定量性を示している。

参考例２．　α−アミラーゼ活性の測定〔測定試液〕 実施例６と同様にして得たＢＧ６Ｐ３６ｍｑをグルコア
ミラーゼ４００単位、α−グルコシダーゼ３００単位及
び２０　ｍ　ｍｏｌＡ塩化カルシタカルシウム０ｍ　ｍ
ｏｌ／１ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，９）　３０
ｒｎｉに溶解し、測定試液とした。

〔測定操作〕

測定試液２’ｍｌに検体血清１００μｌを加え、３７℃
に加温し、この反応液の波長４０５　ｎｍに於ける吸光
度変化を測定した。

別に、α−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い、上記
と同様に操作し、検量関係を求め、この検量線から検体
のα−アミラーゼ活性を求めた。

このときの標準検体の各希釈段階に於けるα−アミラー
ゼ活性（Ｓｏｍｏｇｙｉ単位／ｄｉ）と波長４０５　ｎ
ｍに於ける１分間当りの吸光度増加量（ΔＡ）との関係
を第７図シて示す。

第７図より明らかな如く、α−アミラーゼ活性（Ｓｏｍ
ｏｇｙｉ単位７ｄｌりに対してプロットした吸光度増加
量（ΔＡ／ｍ　ｉ　ｎ　）を結ぶ検量線は原点を通る直
線となり、検量線は良好な定量性を示している。

参考例３　α−アミラーゼ活性の測定 〔測定試液〕 実施例８で得たＢｒＧ５Ｐ　３０■をグルコアミラーゼ
４００単位、α−グルコシダーゼ３００単位及び２０　
ｍ　ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウムを含む５０　ｍ　ｍｏｌ
／１ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，９）　３０ｍｌ
に溶解し、測定試１夜とした。

〔測定操作〕

測定試液２　ｍｌに検体血清１００μｌを加え、３７℃
に加温し、この反応液の波長４０５ｎｍにおける吸光度
変化を測定した。

別に、α−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い、上記
と同様に操作し、検量関係を求め、この検量線から検体
のα−アミラーゼ活性を求めた。

このときの標準検体の各希釈段階に於けるα−アミラー
ゼ活性（Ｓｏｍｏｇｙｉ単位／ｄｉ）と波長・↓０５　
ｎｍに於ける１分間当りの吸光度増加量（ΔＡ）との関
係を第８図に示す。

第８図より明らかな如く、α−アミラーゼ活性（Ｓｏｍ
ｏｇｙｉ単位／ｄｅ）に対してプロットした吸光度増加
量（ΔＡ）を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量
線は良好な定量性を示している。

〔発明の効果〕

本発明は、α−アミラーゼ活性測定用基質として、或は
ヒトα−アミラーゼの各アイソザイム活性の分別測定用
基質として有用な非還元末端修飾オリゴサツカライドの
新規で且つ効果的な製造法と、新規なオリゴサツカライ
ド誘導体を提供するものであり、本発明の方法によれば
、 ■非還元末端修飾オリゴサツカライドが簡単な反応操作
で、収率よ〈得ることもできるので、これらを基質とし
て用いるα−アミラーゼ活性測定法或は同アイソザイム
の分別測定法の実用化（企業化）に寄与するところ甚だ
犬なる点。及び■本発明のオリゴサツカライド誘導体は
従来のα−アミラーゼ活性測定用基質が有する問題点を
一切有さす、しかも合成が容易で収率よくこれを得るこ
とができるので、実用化（企業化）が可能な優れたα−
アミラーゼ活性測定法を提供し得るものである点。

に顕著な効果を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は夫々実施例３及び実施例４で得られ
た本発明オリゴサツカライド誘導体のＦＡＢ−マスク４
クトルを示す（装置Ｊｅｏ目（Ｘ−１００）。 第３図は実施例６で得られた本発明オリゴサツカライド
誘導体のＩＲチャートを示す。 第４図及び第５図は、夫々実施例６及び実施例８で得ら
れた本発明オリゴサツカライド誘導体の’Ｈ−ＮＭＲチ
ャートを示す。 第６図、第７図及び第８図は、夫々参考例１゜参考例２
及び参考例３に於て得られた検量線を示し、横軸の各α
−アミラーゼ活性（Ｓｏｍｏｇｙｉ単位／ｄｉ　）につ
いて得られた吸光度増加量（ΔＡ／′ｍ１ｎ）を縦軸に
沿ってプロットした点を結んだものである。 特許出願人　　和光純薬工業株式会社 が　　架　暢 第６図 ｄ−アミラーｔｓ引生（＆血喰ｉ単位／ａυ第７図 メーアミラーゼ′名檎（Ｓｏｍｏｇｙ　＋年ａ／ｄｆＬ
）第８図 久−アミラーｉ　ｓｔｙ　ａ　（Ｓｏｍｏｇｙｉ単ｉａ
。 手続補正書 昭和６２年１０月６日 特許庁長官　殿　　　　　　　　　　　　　　　　■１
、事件の表示 昭和６２年　特許類　第００２７３０号２、発明の名称 非還元末端修飾オリゴサッカライＰ誘導体の新規な製造
法並びに新規なオリゴサッカライＰ誘導体住所　大阪府
大阪市東区道修町３丁目１０番地連絡先　特許課（東京
）　置０３−２７０−８５７１自　　　発 ５、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄及び発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）特許請求の範囲を別紙の通り補正する。 （２）明細書２０頁１２行目に記載の「作用させて」の
後に「或はまた、・ξ−オキシダーゼと過酸化水素とを
作用させて」を挿入する。 （３）明細書２３頁６行目から７行目にかけて記載の「
、過酸化水素」を削除する。 （４）明細書２７頁１６行目に記載の「ピリジルボラン
」を「ぎリジンボラン」と補正する。 （５）明細書３１頁１７行目から１８行目にかけて記載
ノ「フェニルグルコシドＪｔ−ｒフェニル　α−グルコ
シＰ」と補正する。 （６）明細書３２頁６行目から７行目にかけて記載の「
ｐ−ニトロフェニル基」を「フェニル基」と補正する。 （７）明細書３４頁１０行目から１１行目にかけて記載
ノ「モノ−６−０−ｐ−トルエンスルホニルシクロデキ
ストリノ」を「モノ−６−０’−ｐ−トルエンスルホニ
ル　β−シクロデキストリン」ト補正する。 （８）明細書３４頁１８行目から１９行目にかけて記載
のｒ６−０−ｐ−）ルエンスルホニル　？りロデキスト
リンＪをｒ６−０−ｐ−）ルエンスル−０−１）−トル
エンスルホニル　シクロテキストリンＪをｒ６−０−ｐ
−）ルエンスルホニル　β−シクロデキストリン」と補
正する。 ００明細書４１頁１８行目から２０行目にかけて記載の
「モノ−６−０−ｐ−）ルエンスルホニルシクロデキス
トリン」を「モノ−６−０−ｐ−トルエンスルホニル　
β−シクロテキストリン」ト補正する。 以上 別　　　紙 ２、特許請求の範囲 （１）修飾シクロデキストリンにアクセプターの存在下
シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ
を作用させ、然る後、グルコアミラーゼ又はα−グルコ
シダーゼを作用させることを特徴とする非還元末端修飾
オリゴサツカライドの製造法。 （２）修飾シクロデキストリンが１分子当９１個の修飾
グルコースを含む修飾シクロデキストリンである特許請
求の範囲第１項に記載の製造法。 （３）修飾グルコースが、その水酸基を２−ピリジルア
ミノ基、３−ピリジルアミノ基の如く螢光性を有する置
換基、アニリノ基、メチルアニリノ基。 ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフェニルアミノ基の
如くＵＶ吸収を有する置換基、メトキシ基。 エトキシ基等のアルコキシ基、カルボキシメトキシ基、
ヒドロキシエトキシ基、ベンジルオキシ基。 フェネチルオキシ基、ピリゾルメチルオキシ基等の置換
アルコキシ基、塩素、臭素等のハロケ゛ン原子、ヒｒラ
ゾノ基、フェニルヒＰラゾノ基又はアミノ基で置換した
修飾グルコース、若しくはグルクロン酸である特許請求
の範囲第２項に記載の製造法。 （４）アクセプターがグルコース、マルトース、マルト
トリオース若しくはそれらの誘導体である特許請求の範
囲第１項〜第３項のいずれかに記載の製造法。 （５）弐ｍ 〔式中　Ｒ１はアルコキシメチル基、ベンジルオキシメ
チル基、アミノメチル基、カルボキシル基又はハロメチ
ル基を表わし　Ｒ２は （但し、Ｒ３−Ｒ６は水素、低級アルキル基、低級アル
コキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スールホン酸基
又はハロゲンを表わし、夫々同じであっても異なってい
ても良く、また、Ｒ５とＲ５又はＲ４とＲ６とが結合し
て芳香環を形成していても良い。Ｒ７は水素、低級アル
コキシ基、〕・ログン又はニトロ基を表わす。また、Ｒ
８は水素、メチル基又はトリフルオロメチル基を表わし
　Ｒ９は水素又はハロゲンを表わす。）を表わし、ｎは
２〜５の整数を表わす。〕 で示されるオリゴサツカライド誘導体。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）修飾シクロデキストリンにアクセプターの存在下
   シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ
   を作用させ、然る後、グルコアミラーゼ又はα−グルコ
   シダーゼを作用させることを特徴とする非還元末端修飾
   オリゴサッカライドの製造法。
2. （２）修飾シクロデキストリンが１分子当り１個の修飾
   グルコースを含む修飾シクロデキストリンである特許請
   求の範囲第１項に記載の製造法。
3. （３）修飾グルコースが、その水酸基を２−ピリジルア
   ミノ基、３−ピリジルアミノ基の如く螢光性を有する置
   換基、アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニ
   リノ基、カルボキシフェニルアミノ基の如くＵＶ吸収を
   有する置換基、メトキシ基、エトキシ基等のアルコキシ
   基、カルボキシメトキシ基、ヒドロキシエトキシ基、ベ
   ンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、ピリジルメチル
   オキシ基等の置換アルコキシ基、塩素、臭素等のハロゲ
   ン原子、ヒドラゾノ基、フェニルヒドラゾノ基又はアミ
   ノ基で置換した修飾グルコース、若しくはグルクロン酸
   である特許請求の範囲第２項に記載の製造法。
4. （４）アクセプターがグルコース、マルトース、マルト
   トリオース若しくはそれらの誘導体である特許請求の範
   囲第１項〜第３項のいずれかに記載の製造法。
5. （５）式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 〔式中、Ｒ＾１はアルコキシメチル基、ベンジルオキシ
   メチル基、アミノメチル基、カルボキシル基又はハロメ
   チル基を表わし、Ｒ＾２は ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
   表等があります▼又は▲数式、化学式、表等があります
   ▼ （但し、Ｒ＾３〜Ｒ＾６は水素、低級アルキル基、低級
   アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スルホン酸
   基又はハロゲンを表わし、夫々同じであっても異なって
   いても良く、また、Ｒ＾３とＲ＾５又はＲ＾４とＲ＾６
   とが結合して芳香環を形成していても良い。Ｒ＾７は水
   素、低級アルコキシ基、ハロゲン又はニトロ基を表わす
   。また、Ｒ＾８は水素、メチル基又はトリフルオロメチ
   ル基を表わし、Ｒ＾９は水素又はハロゲンを表わす。）
   を表わし、ｎは２〜５の整数を表わす。〕 で示されるオリゴサッカライド誘導体。