JPH0676430B2 - α−アミラ−ゼ活性の新規測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は、α−アミラーゼ活性測定用基質として有用な
新規なオリゴサッカライド誘導体と、これを基質として
用いるα−アミラーゼ活性測定法に関する。

〔発明の背景〕

ヒト生体内の唾液、膵液、血液、尿中のα−アミラーゼ
活性の測定は医学上の診断において重要である。例え
ば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎においては、血液や尿中の
α−アミラーゼ活性は通常の値に比べて著しい上昇を示
す。

α−アミラーゼ活性の測定方法については、これまで種
々の方法が発表されているが、最近では従来のでんぷ
ん、アミロース、アミロペクチン等の長鎖の天然物及び
その修飾物を使用する方法に代って、グルコース残基数
が４〜７個のオリゴサッカライド（オリゴ糖）誘導体を
使用する方法が主流となりつつある。

なかでも、還元末端と非還元末端の両端のグルコースを
修飾したオリゴサッカライド誘導体は、α−グルコシダ
ーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ等の共役
酵素の基質とならず、しかも、検出を、遊離してくる発
色物質の量を測定することにより行なうことができるの
で、α−アミラーゼ活性測定用基質としての優位性が特
に高い。

このようなオリゴサッカライド誘導体の選択条件とし
て、松井らは、第２回日本臨床化学会夏期セミナー1982
年７月 199〜202頁に於て以下の点を挙げている。

α−アミラーゼの水解部位が一ケ所であること。

アイソザイムにより水解部位及び水解率が異ならない
こと。

水解生成物が更にα−アミラーゼの作用を受けないこ
と。

水解速度が速いこと。

etc. そうして、これらの条件を全て満足し得る理想的な基質
として下記の如きものを想定、提示している。

即ち、Ｇが４以下のものは水解速度が遅く、またＧが６
以上になると水解位置が複数になるのでどちらも好まし
くなく、Ｇは５が最適であるとしている。

しかしながら、X,Yがついていないマルトペンタオシド
（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ）の場合には、水解部位が一ケ所
で、しかも水解速度も速いが、これに、修飾基Ｘ及びＹ
がついた修飾マルトペンタオシドになると、水解部位が
複数となり、水解速度も遅くなる傾向がある（修飾基に
よっては水解しない）ことがその後の研究で明らかとな
った。即ち、例えば特開昭60−237998号公報、特開昭61
−83195号公報等に開示されている、Ｇが５個でＸがピ
リジルアミノ基、メチル基或はカルボキシメチル基のも
のはいずれも水解速度が遅くなり、水解部位も複数とな
っている。また、特開昭60−54395号公報、特開昭60−8
7297号公報、特開昭61−63299号公報等に於て開示され
ている、Ｘが環状アセタール系のものではＧが５の場合
には殆ど水解反応が起らず、Ｇは実際上６以上でなけれ
ばならない（但し、この場合には水解部位が複数となる
ことは言うまでもない。）。

〔発明の目的〕

本発明は、α−アミラーゼ活性測定用基質として用いた
場合に水解部位が一ケ所で、水解速度も速い両末端修飾
オリゴサッカライド誘導体とこれを用いるα−アミラー
ゼ活性の新規測定法を提供することを目的とする。

〔発明の構成〕

本発明は、一般式［Ｉ］ 〔式中、R¹は、 （但し、R²〜R⁵は水素原子、低級アルキル基、低級アル
コキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スルホン酸基又
はハロゲン原子を表わし、夫々同じであっても異なって
いても良く、また、R²とR⁴又は／及びR³とR⁵とが結合し
て芳香環を形成していても良い。R⁶は水素原子、低級ア
ルコキシ基、ハロゲン原子又はニトロ基を表わす。ま
た、R⁷は水素原子、メチル基又はトリフルオロメチル基
を表わし、R⁸は水素原子又はハロゲン原子を表わす。）
を表わす。〕で示されるオリゴサッカライド誘導体、及
びこれを基質として用い、１以上の共役酵素の共存下に
α−アミラーゼ活性を測定することを特徴とするα−ア
ミラーゼの活性測定法の発明である。

即ち、本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重
ねた結果、一般式［Ｉ］で示されるオリゴサッカライド
（オリゴ糖）誘導体が、α−アミラーゼにより水解を受
ける部位がほぼ一ケ所で、しかもアイソザイムによる水
解率の差が殆どなく、また水解速度も速い等の性質を有
することを見出し、本発明を完成させるに到った。

本発明に係る一般式［Ｉ］で示されるオリゴサッカライ
ド誘導体に於て、R¹で示される のR²〜R⁵としては、水素原子、例えばメチル基，エチル
基，プロピル基，ブチル基等の低級アルキル基、例えば
メトキシ基，エトキシ基，プロポキシ基，ブトキシ基等
の低級アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スル
ホン酸基、又は例えば塩素，臭素，沃素等のハロゲン原
子等が挙げられ、またR²とR⁴又は／及びR³とR⁵とが結合
して芳香環を形成していてもよく、R⁶の例としては、水
素原子、例えばメトキシ基，エトキシ基，プロポキシ
基，ブトキシ基等の低級アルコキシ基、例えば塩素，臭
素，沃素等のハロゲン原子又はニトロ基等が挙げられ
る。しかしながら、R¹足り得る置換フェニル基、置換ナ
フチル基は上記した如き置換基を有するものに限定され
るものではなく、オリゴサッカライドの還元末端にOR¹
として結合し、グルコアミラーゼ［E.C.3.2.1.3.］、α
−グルコシダーゼ［E.C.3.2.1.20.］、β−グルコシダ
ーゼ［E.C.3.2.1.21.］、イソマルターゼ［E.C.3.2.1.1
0.］又はβ−アミラーゼ［E.C.3.2.1.2.］等の作用を受
けて加水分解され得るものであり、更に、水解後は、ニ
トロフェノール類の如くそれ自体可視部に吸収を有する
ものか、又はカテコールオキシダーゼ，ラッカーゼ，チ
ロシナーゼ又はモノフェノールオキシダーゼ等の酸化酵
素の作用を受けてカプラーとカップリングして色素を生
ずるか、或は酸化剤によりカプラーとカップリングして
色素を生ずるものであればいずれにても良い。

一般式［Ｉ］に於てR¹で示される のR⁷としては、水素原子、メチル基又はトリフルオロメ
チル基が挙げられる。

また、同じくR¹で示される のR⁸としては水素原子又は例えば塩素，臭素，沃素等の
ハロゲン原子が挙げられる。

本発明に係る一般式［Ｉ］で示されるオリゴサッカライ
ド誘導体は、例えば以下の如くして得ることができる。

即ち、例えばモノ−Ｏ−ベンジル−β−シクロデキスト
リンにアクセプターとしての修飾グルコースの存在下シ
クロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを
作用させ、然る後、グルコアミラーゼ又はα−グルコシ
ダーゼを作用させる。反応後はカラムクロマトグラフィ
ー等常法により単離精製を行うことにより目的物を得る
ことができる。

アクセプターとして用いられる修飾グルコースは、１位
の水酸基が-OR¹（但し、R¹は前記と同じ。）に置換され
ているものが用いられることは言うまでもない。そのよ
うな-OR¹の具体例としては、例えばｐ−ニトロフェノキ
シ基、ｍ−ニトロフェノキシ基、ｏ−クロロフェノキシ
基、ｐ−クロロフェノキシ基、2,6−ジクロロフェノキ
シ基、ｏ−メトキシフェノキシ基、ｐ−メトキシフェノ
キシ基、ｏ−メチルフェノキシ基、ｏ−カルボキシフェ
ノキシ基、ｏ−スルホフェノキシ基、１−ナフトキシ
基、２−スルホ−１−ナフトキシ基、２−カルボキシ−
１−ナフトキシ基、ウンベリフェリル基、４−メチルウ
ンベリフェリル基、インドキシル基等が挙げられるが、
これらに限定されるものでないことは言うまでもない。

シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ
（以下、CGTaseと略す。）の起源、由来に特に限定はな
く、例えばバチルスマセランス由来のもの、バチルス
メガテリウム由来のもの、クレプシェラニューモニエ由
来のもの、アルカリ細菌由来のもの等、いずれの由来の
ものにてもよい。

また、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼの起
源、由来についても特に限定はない。

モノ−Ｏ−ベンジル−β−シクロデキストリンは、β−
シクロデキストリンを原料とし、例えばメゾット イン
カーボハイドレイトケミストリーＩ（1962）〜Ｖ（19
65）アカデミック プレス等に記載の各種修飾グルコー
スの製法に準じて、これをベンジル基を導入するための
各種反応試剤と反応させることにより容易に得られる。

アクセプターの存在下モノ−Ｏ−ベンジル−β−シクロ
デキストリンにCGTaseを作用させて反応させる際の反応
時のpHは用いるCGTaseの由来により若干異なるが、通常
６〜８である。同pHに保つために用いられる緩衝剤は酵
素反応を阻害しないものであればいずれにてもよく、例
えばグッドの緩衝剤、酢酸アンモニウム、炭酸塩、リン
酸塩等が挙げられる。

モノ−Ｏ−ベンジル−β−シクロデキストリンの濃度は
通常１〜50mmol/、またアクセプターの濃度は通常5mm
ol/以上、溶解度限界までであるが、モノ−Ｏ−ベン
ジル−β−シクロデキストリンとアクセプターのモル比
は前者１に対し後者が５以上であることが望ましい。ま
た、CGTaseの使用量は通常50〜5000U/mlであり、反応は
通常20〜50℃で行われる。CGTaseによる酵素反応終了後
は加熱によりこれを失活させる（例えば90℃以上で10分
間以上）か、pHを変動させて（例えばpH4.0以下）その
作用を失わしめる。

グルコアミラーゼ又はα−グルコシターゼによる反応
は、通常その至適pH（通常４〜６）で行われ、その使用
量は、いずれも通常５〜100U/mlである。

また、本発明に係る一般式［Ｉ］で示されるオリゴサッ
カライド誘導体は還元末端グルコースの１位水酸基が前
記R¹で示される基で置換された、式［II］ で示される還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体を原
料として、例えば下記の如き方法によっても合成するこ
とができる。

即ち、まず、式［II］で示されるオリゴサッカライド誘
導体にベンズアルデヒドジメチルアセタール、ベンズア
ルデヒドジエチルアセタール等のアセタール類を作用さ
せて非還元末端グルコースの４位と６位との間に還状ア
セタール基を形成させる。式［II］で示されるオリゴサ
ッカライド誘導体は、市販品をそのまま用いてもよい
し、例えば特開昭54−51892号公報等に記載の方法に準
じてこれを合成しても良い。アセタール類の使用モル比
は通常、オリゴサッカライド誘導体に対し１〜100倍モ
ル程度である。反応は通常、ｐ−トルエンスルホン酸，
塩化亜鉛等のルイス酸触媒の存在下、例えば、ジメチル
ホルムアミド（DMF）等適当な溶媒中で行われ、反応温
度は通常、室温及至還流温度、反応時間は、反応温度に
より若干異なるが、通常0.5〜12時間程度である。

かくして得られた環状アセタール化物は、通常、アシル
化により、他の水酸基を修飾した後、還元工程に付され
る。

アシル化反応は、例えば、ピリジン等の塩基の存在下ア
シル化剤として無水酢酸、アセチルクロリド、ベンゾイ
ルクロリド等を用い、常法に従ってこれを行えば足り
る。

アシル化反応は必須ではないが、次工程（還元工程）の
反応溶媒に対する溶解性を高める意味で好ましい。

還元工程は、通常、還元剤としてナトリウムシアノボロ
ハイドライド，リチウムアルミニウムハイドライド，ピ
リジンボラン，ジメチルアミンボラン，トリメチルアミ
ンボラン,t−ブチルアミンボラン，ジボラン等を用い、
塩化アルミニウム，三弗化ホウ素，塩化亜鉛,p−トルエ
ンスルホン酸，メタンスルホン酸，塩化水素ガス等の酸
触媒の存在下、適当な溶媒〔例えば、テトラヒドロフラ
ン（THF）等〕中、通常、０〜50℃で数十分及至数時間
反応させることにより行われる。還元剤の使用量は通
常、オリゴサッカライド誘導体に対し１〜1000倍モル、
また酸触媒の使用量は還元剤に対し、通常、0.5〜５モ
ル程度である。

アシル保護してある場合は、還元後、常法により、例え
ば0.01〜1.0Nナトリウムメチラート・メタノール溶液等
で数時間及至数十時間０〜40℃で処理するなどして脱ア
シル化すれば、目的とする本発明に係るオリゴサッカラ
イド誘導体が容易に得られる。各工程に於ける反応後の
後処理等は常法に従ってこれを行えばよく、また、最終
生成物の精製もカラムクロマトグラフィー等常法に従っ
てこれを行えば足りる。

本発明に係るオリゴサッカライド誘導体は従来の両末端
修飾オリゴサッカライド誘導体と異なりα−アミラーゼ
により水解される部位がほぼ一ケ所で、しかも水解速度
も速く、またアイソザイムによる水解率の差も殆どない
のでα−アミラーゼ活性測定用の基質として極めて有用
である。

本発明に係るオリゴサッカライド誘導体を基質として用
いるα−アミラーゼ活性測定法の測定原理は概略次の通
りである。

＊共役酵素：(i) α−グルコシダーゼ （式中、Ｇはグルコース単位を表わし、 は非還元末端グルコースの６位の水酸基がベンジルオキ
シ基に置換されたグルコースを表わし、OR¹は還元末端
グルコースの１位に置換された置換基を有していてもよ
いフェノキシ基、置換基を有していても良いナフトキシ
基、置換基を有していてもよいウンベリフェリル基又は
置換基を有していてもよいインドキシル基を表わす。） 即ち、先ず始めに、本発明に係るオリゴサッカライド誘
導体に試料中のα−アミラーゼが作用して、非還元末端
グルコースの６位の水酸基がベンジルオキシ基で置換さ
れた 還元末端グルコースの１位に置換基を有していてもよい
フェノキシ基、置換基を有していても良いナフトキシ
基、置換基を有していてもよいウンベリフェリル基又は
置換基を有していてもよいインドキシル基がついたＧ−
Ｇ−OR¹が生成し、次いで、このＧ−Ｇ−OR¹に前記の如
き共役酵素が作用して、2GとR¹−OHが生成する。このR¹
−OHを、例えばR¹−OHがｐ−ニトロフェノールの如きニ
トロフェノール類の場合には、直接その吸収スペクトル
を（例えば405nmに於ける吸光度を）測定することによ
り、また、R¹−OHが、例えばフェノール、ｏ−クロロフ
ェノール、2,6−ジクロロフェノール、ｐ−メトキシフ
ェノール等の如きニトロ基をもたない（ニトロ基をもっ
ていても良いが）フェノール類或はナフトール類の場合
には、カテコールオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナ
ーゼ又はモノフェノールオキシダーゼの如き酸化酵素類
又はヨウ素酸、過ヨウ素酸の如き酸化剤又はパーオキシ
ダーゼと過酸化水素を作用させて、４−アミノアンチピ
リン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
（MBTH）等のカプラーとカップリング（酸化縮合）さ
せ、生成する色素の吸収スペクトルを測定することによ
り、或はR¹−OHがウンベリフェロン、４−メチルウンベ
リフェロンの如く螢光を有する化合物の場合には、その
螢光強度を測定することにより、更にはR¹−OHがインド
キシル類の場合には、酸化されて生成するインジゴ色素
の吸収スペクトルを測定することにより、夫々試料中の
α−アミラーゼ活性を求めることができる。

本発明のオリゴサッカライド誘導体を基質として用いる
α−アミラーゼ活性測定法に於て、基質として用いるオ
リゴサッカライド誘導体の濃度は特に限定されるもので
はないが、通常約0.1〜10mMが好ましく用いられる。

本発明のオリゴサッカライド誘導体を基質として用いる
α−アミラーゼ活性測定法に於て測定対象となる試料
は、α−アミラーゼを含有する検体なら何れを用いても
よく、例えば生体成分として血液、血清、尿等があげら
れる。

共役酵素のグルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β
−グルコシダーゼ又はイソマルターゼとしては、特に限
定されないが例えば動物、植物、微生物由来のものが利
用出来、夫々単独で、或は組み合せて用いられる。これ
ら共役酵素の使用量は通常0.5〜1000U/ml、好ましくは
２〜500U/mlである。

また、本発明を実施する測定条件として、反応温度は特
に限定されないが、好ましくは約25〜40℃であり、反応
時間は目的により自由に選択できる。

至適pHとしては特に限定されないが、pH約６〜８が好ま
しい例である。至適pHを維持する緩衝剤は自由に選択で
き、例えば、リン酸塩、トリスハイドロキシメチルアミ
ノメタン−塩酸、グッドの緩衝剤などが任意に選ばれ
る。

さらにα−アミラーゼの賦活剤として、例えば塩化ナト
リウム、塩化カルシウム、塩化カリウム等が使用され
る。

共役酵素の作用により遊離したフェノール類又はナフト
ール類とカップリング（酸化縮合）させるカプラーとし
ては、４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）、ｐ−アミノ−N,N
−ジエチルアニリン等が挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。フェノール類又はナフトール類とカ
プラーとをカップリング（酸化縮合）させる為の酸化酵
素としては、ラッカーゼ、カテコールオキシダーゼ、チ
ロシナーゼ又はモノフェノールオキシダーゼ等が挙げら
れるが、これらは例えば、動物、植物、微生物由来のも
のが、いずれも利用でき、通常0.2〜10U/ml、好ましく
は0.5〜4U/mlの範囲で使用される。またカップリング
（酸化縮合）させる為の酸化剤としては、ヨウ素酸又は
／及びその塩、過ヨウ素酸又は／及びその塩、過酸化水
素等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に係るオリゴサッカライド誘導体は、その非還元
末端グルコースの６位の水酸基がベンジルオキシ基に置
換されている為、そのままではグルコアミラーゼ、α−
グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はイソマルター
ゼの基質とはならず、しかも水に易溶で、α−アミラー
ゼとの親和性に優れているので、α−アミラーゼの良好
な特異基質となる。従って、本発明のオリゴサッカライ
ド誘導体を基質として用いる測定法に於ては、副反応が
起らず試薬盲検値は極めて小さく、測定用試液が極めて
安定である。また、単一の化合物を基質とすることか
ら、反応の化学量論が成立し、α−アミラーゼの動力学
的検知が可能となる。

また、本発明のオリゴサッカライド誘導体を基質として
用いるα−アミラーゼ活性測定法に於ては、グルコアミ
ラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソマルターゼ又はβ−
グルコシダーゼ等の共役酵素を充分に使用することがで
きるので、α−アミラーゼ反応以降の反応速度が速く、
より正確で精度のよいα−アミラーゼ活性の測定を行う
ことができる。

更に、本発明に係る測定法に於ては、検出を遊離してく
るニトロフェノール類若しくはインジゴ色素類の吸収ス
ペクトルを測定するか、若しくは遊離してくるフェノー
ル類又はナフトール類を４−アミノアンチピリン、MBTH
等と酸化カップリングし、その色素の吸収スペクトルを
測定するか、又は遊離してくるウンベリフェロン類の螢
光強度を測定することにより行なうので、検体中に共存
するグルコース、マルトース等の糖類や、アスコルビン
酸、ビリルビン等の還元性物質の影響を殆ど受けない。

本発明に係るアミラーゼ活性の測定方法は、一定条件で
の反応速度を測定するレイトアッセイでも、あるいは反
応停止剤を使用するエンドポイントアッセイとしてもよ
く、いずれの測定方法も実施可能である。

また、本発明に係る測定法は自動分析装置への適応性も
良く、必要に応じて用手法、自動分析のいずれにて行な
うも可である。

更にまた、本発明の基質を用いた場合には、色素の呈色
を測定する、所謂比色法で測定を行なうことができるの
で、簡便な試験紙法や反応試薬を含有させた多層分析シ
ート（多層一体型定量分析フィルム）を使用する所謂乾
式定量法にも応用することができる。

以下に実施例及び実験例を示すが本発明はこれら実施
例、実験例により何ら限定されるものではない。

〔実施例〕

実験例 1.各種オリゴ糖基質のα−アミラーゼによる水
解速度の測定 オリゴ糖基質として下記のものを使用した。

ｎ＝2: BG4P ｎ＝3: BG5P（本発明のオリゴサッカライド） ｎ＝4: BG6P ｎ＝5: BG7P ｎ＝2: G4P ｎ＝3: G5P（標準） ｎ＝4: G6P ｎ＝5: G7P ｎ＝2: BDG4P ｎ＝3: BDG5P ｎ＝4: BDG6P ｎ＝5: BDG7P （操作法） 各基質の1.0mM溶液（pH7.0）に人膵由来α−アミラーゼ
（HPA）又は人唾液腺由来のα−アミラーゼ（HSA）を作
用させて各々の水解速度を測定した。

（結果） 測定結果を表１に示す。尚、結果は、G5Pに対する水解
速度を１とした相対値で表示した。

実験例 2.各種オリゴ糖基質のα−アミラーゼによる水
解位置の検索 実験例１で用いたオリゴ糖基質について夫々水解位置を
調べた。

（操作法） 50mMBES［N,N−ビス（２−ハイドロキシエチル）−２−
アミノエタンスルホン酸］−NaOH緩衝液（pH7.6,20mMNa
Cl及び2mMCaCl₂含有）に基質を1.2mM溶解させた溶液200
μｌと、α−アミラーゼ溶液20μｌを混合し、37℃で５
分間加温した。反応混合物25μｌを５％酢酸溶液500μ
ｌ中に注入し、酵素反応を停止させた。該溶液中のα−
アミラーゼによる水解生成物量の測定は高速液体クロマ
トグラフィ（HPLC）により行った。

（結 果） 測定結果を表２に示す。尚、表中の値は各水解生成物の
生成比率（％）を示す。

以上実験例１及び２の結果から明らかな如く、本発明に
係るオリゴサッカライド誘導体のBG5Pは、α−アミラー
ゼ活性測定用基質として、(1)水解速度が速い、(2)水解
される位置がほぼ１ヶ所である、(3)アイソザイムによ
る水解率の差がない、のいずれをも満足していることが
判る。

実施例 1.p−ニトロフェニル ６−Ｏ−ベンジル−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシド（BG5P）の合成 (1)モノ−Ｏ−ベンジル−β−シクロデキストリン（以
下、ベンジル−β−CDと略す。）の合成 β−シクロデキストリン15g、水酸化ナトリウム13.5gを
水120mlに溶解し、塩化ベンジル15mlを加えて10℃で２
時間攪拌反応させた。反応後6N塩酸でpH7.0としたのち
アセトン１を加えて析出した沈澱を取し、ベンジル
−β−CD5gを得た（２位,3位,6位置換体の混合物）。

(2)BG5Pの合成 ベンジル−β−CD10g、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グ
ルコピラノシド10gを10mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH
6.5）１に溶解し、CGTase1000kUを添加して37℃で５
時間攪拌反応させた。次いで酢酸でpH4.0とした後、グ
ルコアミラーゼを20kU添加し、37℃で10時間反応させ
た。反応液を凍結乾燥後、50mM酢酸で平衡化したBio−G
el Ｐ−２（Bio−Rad社）を充填したカラム（30×1500
mm）で精製を行ない粗BG5P（２位,3位,6位置換体の混合
物）1.6gを得た。これを、逆相の高速液体クロマトグラ
フィーで分離精製し、６位置換体180mgを得た。（２位
置換体700mg,3位置換体650mg） HPLC:含有96％［カラム：充填剤シリカゲルＺ−ODS,5C
₁₈（和光純薬工業（株）商品名,10×300mm），溶出液10
％CH₃CN−0.1％AcOHと90％CH₃CN−0.1％AcOHとの直線的
グラジェント，流速３ml/min,305nmで測定］ IR:第１図の通り。¹ H−NMR:第２図の通り。

また、BG5Pのグルコース残基、６−Ｏ−ベンジル置換グ
ルコース残基及びｐ−ニトロフェニル基の構成比率を、
ガス−液体クロマトグラフ法（G.L.C.法）により、下記
の如く測定した。

G.L.C.法分析：試料を1.4M HCl−メタノール溶液中で
加メタノール分解し、更にヘキサメチルジシラザンとト
リメチルシリルクロライドを含むピリジン溶液中でトリ
メチルシリル化した。これをG.L.C.法［カラム;0.4×20
0cm,充填剤;2％OV−17on Chromosorb Ｗ（和光純薬工
業（株）製）、測定温度;110〜250℃（１分間当り４℃
上昇）］により測定した。ｐ−ニトロフェニル基濃度は
0.1M酢酸溶液に於ける305nmの吸光度から定量した。こ
の濃度を１として各成分の構成比率を測定した。

グルコース残基/6−Ｏ−ベンジル置換グルコース残基/p
−ニトロフェニル基＝3.8/0.9/1.0。

上で得た結果と、BG5Pがグルコアミラーゼの作用を受け
ないことから、BG5Pの構造は、次のものであると考えら
れる。

実施例 2.BG5Pの合成 ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトペンタオシド3gを
DMF50mlに溶解後、ベンズアルデヒドジメチルアセター
ル15ml、ｐ−トルエンスルホン酸（無水）1gを加え、50
℃で３時間攪拌反応させた。反応後、ピリジン100mlを
加え室温で、ベンゾイルクロリド60mlを滴下して反応さ
せ、反応液を200mlの飽和重炭酸水素ナトリウム溶液に
あけて反応を停止させた。クロロホルム200mlで抽出し
飽和食塩水で２回洗浄後、溶媒を留去した。得られたシ
ロップを１４頸コルベンに移し、THF250mlに溶解後、
ジメチルアミンボラン3gを加え溶解した。この溶液に、
ジエチルエーテルに塩酸ガスを加え0.5Nとした溶液10ml
を攪拌下滴下し、反応液を200mlの飽和重炭酸水素ナト
リウム溶液にあけて反応を停止させた後、クロロホルム
200mlで抽出した。飽和食塩水で２回洗浄後溶媒を留去
し、0.1Nナトリウムメチラートを含むメタノール溶液50
0mlを加え25℃で４時間攪拌後酢酸を加えて中和した。
溶媒留去後50mM酢酸溶液20mlを加え、50mM酢酸で平衡化
したBio−Gel Ｐ−２ （Bio−Rad社、2cmφ×150cm）
カラムにチャージしてBG5Pの画分を集め凍結乾燥を行っ
た。

収量 450mg。

IR:実施例１に同じ。¹ H−NMR:実施例１に同じ。

HPLC:含量 95％（実施例１と同様の方法により測定し
た。）。

G.L.C.法分析：実施例１と同様の方法により測定を行
い、同様の結果を得た。

実施例 3.α−アミラーゼ活性の測定 （測定試液） 実施例１で得たBG5P30mgをグルコアミラーゼ400U、α−
グルコシダーゼ300U及び20mmol/塩化カルシウムを含
む50mmol/２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
（MES）−NaOH緩衝液（pH6.9）30mlに溶解し、測定試液
とした。

（測定操作） 測定試液２mlに検体血清100μlを加え、37℃に加温し、
この反応液の波長405nmに於ける吸光度変化を測定し
た。

別に、α−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い、上記
と同様に操作して検量関係を求め、この検量線から検体
のα−アミラーゼ活性を求めた。このときの標準検体の
各希釈段階に於けるα−アミラーゼ活性（Somogyi単位
／dl）と波長405nmに於ける１分間当りの吸光度増加量
（ΔＡ）との関係を第３図に示す。

第３図より明らかな如く、α−アミラーゼ活性（Somogy
i単位／dl）に対してプロットした吸光度増加量（ΔA/m
in）を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量線は良
好な定量性を示している。

実施例 4.α−アミラーゼ活性の測定 （測定溶液） 下記物質を蒸留水に溶解して、測定試液原液とした（pH
7.3）。

N,N−ビス（２−ハイドロキシエチル）−２−アミノエ
タンスルホン酸（BES） 2.1g NaCl 230mg CaCl₂ 58mg NaOH 500mg BG5P（実施例２により得られたもの） 125mg 測定試液A;上記測定試液原液50mlにα−グルコシダーゼ
25,000Uを加えて溶解し、測定試液Ａとした。

測定試液B;上記測定試液A20mlにグルコアミラーゼ1,000
Uを加えて溶解し、測定試液Ｂとした。

（試 料） 人血清５検体を試料とした。

（測定操作） 測定試液Ａ又はB2mlに試料50μｌを加え、37℃に加温
し、この反応液の波長405nmに於ける吸光度変化を測定
した。

（結 果） 結果を表３に示す。尚、表中の値は、波長405nmに於け
る１分間当りの吸光度の増加量を示す。

表３から明らかな如く、本発明に係るオリゴサッカライ
ド誘導体（BG5P）を基質として用いれば、共役酵素が１
種類でも測定が可能であることがわかる。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明は、α−アミラーゼ活性測定用
基質として用いた場合に(1)α−アミラーゼによる水解
速度が速い、(2)水解部位が殆ど１ヶ所である、(3)アイ
ソザイムによる水解率の差が殆どない等の優れた性質を
有する新規なオリゴサッカライド誘導体と、これを基質
として用いたα−アミラーゼ活性のより精度の高い測定
方法を提供するものであり、斯業に貢献するところ大な
る発明である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた本発明オリゴサッカライド
誘導体のIRチャートを示す。 第２図は実施例１で得られた本発明オリゴサッカライド
誘導体のNMRチャートを示す。 第３図は、実施例３に於て得られた検量線を示し、横軸
の各α−アミラーゼ活性（Somogyi単位／dl）について
得られた吸光度増加量（ΔA/min）を縦軸に沿ってプロ
ットした点を結んだものである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式［Ｉ］ （但し、R²〜R⁵は水素原子、低級アルキル基、低級アル
   コキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スルホン酸基又
   はハロゲン原子を表わし、夫々同じであっても異なって
   いても良く、また、R²とR⁴又は／及びR³とR⁵とが結合し
   て芳香環を形成していても良い。R⁶は水素原子、低級ア
   ルコキシ基、ハロゲン原子又はニトロ基を表わす。ま
   た、R⁷は水素原子、メチル基又はトリフルオロメチル基
   を表わし、R⁸は水素原子又はハロゲン原子を表わす。）
   を表わす。〕 で示されるオリゴサッカライド誘導体。
2. 【請求項２】一般式［Ｉ］ （但し、R²〜R⁵は水素原子、低級アルキル基、低級アル
   コキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スルホン酸基又
   はハロゲン原子を表わし、夫々同じであっても異なって
   いても良く、また、R²とR⁴又は／及びR³とR⁵とが結合し
   て芳香環を形成していても良い。R⁶は水素原子、低級ア
   ルコキシ基、ハロゲン原子又はニトロ基を表わす。ま
   た、R⁷は水素原子、メチル基又はトリフルオロメチル基
   を表わし、R⁸は水素原子又はハロゲン原子を表わす。）
   を表わす。〕 で示されるオリゴサッカライド誘導体を基質として用
   い、１以上の共役酵素の共存下にα−アミラーゼ活性を
   測定することを特徴とするα−アミラーゼの活性測定
   法。