JPH0650996B2

JPH0650996B2 - α−アミラ−ゼ活性測定用基質及び測定方法

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Publication number: JPH0650996B2
Application number: JP27770286A
Authority: JP
Inventors: 善資小川
Original assignee: 善資小川
Priority date: 1986-11-20
Filing date: 1986-11-20
Publication date: 1994-07-06
Anticipated expiration: 2009-07-06
Also published as: JPS63129997A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は新規なα−アミラーゼ活性測定用基質及びそれ
を用いたα−アミラーゼ活性測定方法に関するものであ
る。

［従来の技術］急性すい炎、耳下腺炎等の診断のために、血清や尿中の
α−アミラーゼ活性を測定する手法がある。

α−アミラーゼ活性測定用基質として、従来はでんぷん
が用いられてきたが、精度の点で難点があった。このた
め、でんぷんに代って、近年、マルトペンタオース（Ｇ
_５）に代表されるマルトオリゴ糖がアミラーゼ活性測定
用基質として採用されつつある。即ち、α−アミラーゼ
の共役酵素として、α−グルコシダーゼを用いると、次
の方法によってα−アミラーゼの活性を測定することが
できる。

ここで生成したグルコース（Ｇ_１）は、例えばグルコー
スオキシダーゼ／パーオキシダーゼ／色素系又はヘキソ
キナーゼ／ホスホグルコムターゼ／グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ系等により定量
され、α−アミラーゼ活性が測定される。

また、最近になって、還元末端のグルコースにアグリゴ
ンとしてパラニトロフェノール等のフェノール系化合物
を導入し、アグリゴンを遊離させてそのスペクトル吸収
を測定することにより、α−アミラーゼ活性を測定する
方法も提案されている（特公昭５７−５３０７９）。

［発明が解決しようとする問題点］しかしながら、前述のマルトオリゴ糖をアミラーゼ活性
測定基質として用いる場合には、試料である血清や尿中
に内因性のグルコースやマルトースが存在するため、そ
の影響を受け、測定誤差が生じることになる。このた
め、マルトオリゴ糖を基質として用いる場合には、試料
中のグルコース等を予めヘキソナーゼ等を用いて処理す
る必要があった。

一方、特公昭５７−５３０７９の方法において、アグリ
ゴンとしてフェノール系化合物を用いた場合には、遊離
した発色基は試料中に共存する種々の物質によって作用
を受け、吸光度が変動しやすくなり、その結果、測定精
度が劣る場合があった。

このように、従来のα−アミラーゼ活性測定方法は、い
ずれも操作性や測定精度等に問題を有するものであっ
た。

［問題点を解決するための手段］本発明者は、これら従来技術の問題点を解決するべく、
鋭意研究を行なった結果、内因性のグルコースやマルト
ースの影響を受けず、かつ、精度の高い吸光度の測定が
可能なα−アミラーゼ活性測定用基質及びそれを用いた
α−アミラーゼ活性測定方法を見出し、本発明を完成さ
せた。

即ち、本発明は、下記一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖を含むこ
とを特徴とするα−アミラーゼ活性測定用基質Ａ−Ｇ_ｎ−Ｂ …… （Ｉ）（式中、Ａは、又はを、Ｂはグルコース以外の単糖類又はその誘導体を、Ｇ
はグルコースを、ｎは４〜８の整数をそれぞれ表わす。
ただし（II）式又は（III）式において、Ｒ_１〜Ｒ_４は
水素原子、低級アルキル基又は（ＣＨ_２）_ｙＣＯＯＭ
（ｙは０、１又は２、Ｍは水素原子又はアルカリ金属を
表わす。）を、Ｘ_１〜Ｘ_４は酸素原子又はイオウ原子を
それぞれ表わす。）及び上記一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖と試料と
をグルコシダーゼの共存下に接触させ、遊離するＢを測
定することにより、試料中のα−アミラーゼ活性を測定
することを特徴とするα−アミラーゼ活性測定方法、を
要旨とするものである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明のα−アミラーゼ活性測定用基質において、前記
一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖の、非還元末
端であるＡは、未置換グルコースでも良いし、グルコー
スの４位及び／又は６位を置換したものでも良い（即
ち、前記一般式（II））。更にグルコースの４位と６位
が一緒になってアルキレン橋を形成しているものでも良
い（即ち、前記一般式（III））。

このように、一般式（Ｉ）において、Ａは無修飾（未置
換）及び修飾（置換）されたグルコースを含むものであ
る。Ａが無修飾のグルコースの場合でも、後掲の実施例
４に示す如く、本発明の基質は従来の基質に比べて、は
るかに精度よくα−アミラーゼ活性を測定し得るもので
あるが、後述の理由により修飾グルコースであることが
好ましい。

修飾された非還元末端としては、前記一般式（II）又は
（III）において、下記第１表（ａ）、（ｂ）に示すよ
うな置換基を導入したものが例示される。

一般式（Ｉ）において、還元末端となるＢはグルコース
以外の単糖類又はその誘導体を表わす。Ｂがグルコース
を含まないのは前述の通り内因性のグルコースと区別す
るためである。Ｂの具体例としては、フルクトース、マ
ンノース、ガラクトース、ソルボース、タガトース等が
例示され、その誘導体としては、リン酸基を導入したも
のが挙げられる。これらのうち、フルクトースが入手容
易性や反応性等から最も好ましい。

また、一般式（Ｉ）においては、ｎは４〜８であり、具
体例としてマルトペンタオース（Ｇ_５）、マルトオクタ
ノース（Ｇ_８）等が挙げられる。このようにｎ＝４〜８
で、基質全体の単糖数が６〜１０のものは水溶性に優れ
るうえに２種のアイソエンザイムの作用を均等に受ける
可能性が高いため、基質として好ましい。

本発明のα−アミラーゼ活性測定用基質としては、一般
式（Ｉ）で表わされる化合物が、次の一般式（IV）で表
わされる化合物であることが最も好ましい。

（式中、Ｚ_１、Ｚ_２は水素原子又はリン酸基を表わ
す。）以下において、上記一般式（IV）の化合物を、ＭｅＧ_５
Ｆと略すことがある。

次に一般式（Ｉ）のマルトオリゴ糖の製造方法の一例を
述べる。

まず、サイクロデキストリン（α、β、γのいずれでも
良い。）と、グルコースを除く単糖類、例えばしょ糖
（Ｇ＋Ｆ）とをサイクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼの共存下に反応させる。その結果、サイクロ
デキストリンが開環し、その還元末端にしょ糖が転移
し、新たに還元末端がフルクトースとなる。もっとも、
この際、デキストリンの分断も行なわれるので、得られ
るデキストリンは原料のサイクロデキストリンのグルコ
ース数のものに限らず、それ以下のグルコース数のもの
も生成する。マルトオリゴ糖のグルコース数が、この操
作で所望のものよりも少なければ、マルトース以上のオ
リゴ糖と、得られた転位デキストリンとを再度サイクロ
デキストリングルカノトランスフェラーゼの共存下に反
応させれば良い。

なお、非還元末端のグルコースＡは、前述の通り、その
４位及び／又は６位が修飾されている方が、測定誤差が
少なくなるので好ましいものである。非還元末端の４位
及び／又は６位を修飾する場合には、上述の方法で得ら
れた単糖類転移マルトオリゴ糖を、酸触媒の存在下にジ
メトキシトルエンやジメトキシプロパンと反応させる。
その結果、一般式（III）で示される非還元末端が得ら
れる。

一方、一般式（II）で示される非還元末端を導入する場
合には、上記一般式（III）の化合物の６位及び／又は
４位を触媒存在下にＯＨ基とし、次いで、ハロゲン化ア
ルキルを反応させ、接触還元すればよい。また、Ｘ_１〜
Ｘ_４のいずれかをＳにしたい場合には、（II）式又は
（III）式の化合物をスルホン酸エステル化し、メルカ
プタン類を反応させれば良い。

なお、前述の例で、非還元末端にフルクトースを導入す
る場合の原料としてしょ糖を用いる例を示したが、マル
トシルシュクロースを原料としても良い。また、サイク
ロデキストリンのかわりに市販のマルトオリゴ糖を用い
ても良い。サイクロデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼとしては、バチルズ・マセランス、バチルス・メ
ガテリウム、バチルス・サーキュランス及びバチルス・
オーベンシス等を起源とするものを使用できる。

このようにして得られた反応生成液から、所望のマルト
オリゴ糖を分離精製する手段としては、ＧＰＣ、イオン
交換クロマトグラフィー、合成吸着剤による方法等が挙
げられる。

次に、一般式（Ｉ）で示されるマルトオリゴ糖を用い
て、本発明の方法により試料中のα−アミラーゼ活性を
測定する方法について説明する。

体液等の試料に、基質及び共役酵素としてグルコシダー
ゼを加えると、下記のように反応が進む（なお、以下に
おいては一般式（Ｉ）の具体例として一般式（IV）で示
されるＭｅＧ_５Ｆを用いる）。

ここで遊離したフルクトースを例えばマンニトールデヒ
ドロゲナーゼ（ＭＤＨ）やソルビトールデヒドロゲナー
ゼ（ＳＤＨ）と、ＮＡＤＨ共存下に反応させることによ
りＮＡＤを生成させ、その吸光度の変化によりフルクト
ース量が測定できる。

このように、本発明では還元末端にグルコース以外の単
糖類を導入し、この還元末端を測定するため、内因性の
グルコースの影響を受けることはなく、非還元末端がグ
ルコースであっても、置換グルコースであっても、上述
の通り検出対象糖は還元末端側であることから、基本的
には影響を受けることはない。

本発明の基質では、非還元末端Ａが無修飾（未置換又は
非置換）グルコースであっても、内因性グルコースの影
響を受けないことを、本発明の基質として単糖数６のＧ
_５Ｆ（前記一般式（IV）において、非還元末端のメチル
基が水素原子となったもの）を用いる場合を例示して、
以下に説明する。

Ｇ_５Ｆを基質として用い、共役酵素としてα−グルコシ
ダーゼを加えると、下記のように反応が進行し、本発明
では遊離したＦを測定する。

即ち、一般にα−グルコシダーゼはマルトオリゴ糖の場
合、非還元末端から順にＧ（グルコース）１個単位で切
断するのに対して、α−アミラーゼは２〜３糖単位で切
断する。また、α−グルコシダーゼは単糖数５までのマ
ルトオリゴ糖を比較的速やかに切断するが、単糖数６以
上になると極端に作用する力が弱くなる。

従って、Ｇ_５Ｆの場合、単糖数としては６であり、α−
グルコシダーゼだけの存在下ではなかなか切断されな
い。

しかしながら、例えば、本発明の基質を試薬キットの形
で組成物化する場合、マルトオリゴ糖と共役酵素である
α−グルコシダーゼとが一剤化された形となる。この場
合には、いかにＧ_６以上の基質が切断されにくいとはい
え、１ヵ月以上の長期間保管状態に置かれると、ごく一
部の非還元末端のＧの切断が生じ、更に反応が進むと５
Ｇ＋Ｆに分解される。この状態で試料に加えると、当然
既に遊離しているＦをも測定することとなり誤差を与え
る。

基質の非還元末端を置換グルコースとすると、この反応
もおさえられるが、非置換でも、従来のＧ_５基質に比べ
るとはるかに精度良くなる理由は上述の通りである。

なお、非置換型の本発明の基質（Ｇ_５Ｆ）と、従来の基
質（Ｇ_５）との安定性、精度については、後掲の実施例
４において比較試験を行って、本発明の優位性を示し
た。

［作用」一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖は試料中のα
−アミラーゼ及び共役酵素のグルコシダーゼにより切断
されてフルクトース等の単糖類を生じる。この単糖類を
例えばＭＤＨやＳＤＨ等で定量することにより、試料中
のα−アミラーゼ活性を測定できる。

［実施例］以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ MeＧ_５Ｆの製造市販のＧ_５２９．５ｇにピリジン１４０ｍｌと無水酢酸
１４０ｍｌを加え、室温で４８時間反応させることによ
り、パーアセテート化Ｇ_５５１．８ｇを得た。得られた
パーアセテート化Ｇ_５２５．０ｇをクロロホルム１６５
ｍｌに溶かし、１０℃以下で３０％ＨＢｒ−酢酸と２時
間反応させることにより、パーアセテート化Ｇ_５ブロマ
イド２４．５ｇを得た。このパーアセテート化Ｇ_５ブロ
マイドをベンゼン中、Ｈｇ（ＣＮ）_２６．７ｇ、ベンジ
ルアルコール３３ｍｌと２時間還元反応させることによ
り、パーアセテート化Ｇ_５ベンジルグリコシドを得た。
次いで、パーアセテート化Ｇ_５ベンジルグリコシドをメ
タノール中、ナトリウムメトキシドで室温加水分解する
ことにより、ベンジルグリコシド化Ｇ_５１９．９ｇを得
た。

ベンジルグリコシド化Ｇ_５１９．９ｇをＤＭＦ中、ベン
ズアルデヒドジメチルアセタール１４．８ｇと、ｐ−ト
ルエンスルホン酸触媒下８５〜９０℃で４時間反応を行
なうことにより、非還元末端４，６−Ｏ−ベンジリデ
ン，ベンジルグリコシド化Ｇ_５を得た。

非還元末端４，６−Ｏ−ベンジリデン，ベンジルグリコ
シド化Ｇ_５を、ピリジン１００ｍｌ、無水酢酸１００ｍ
ｌと室温で４８時間反応させ、非還元末端４，６−Ｏ−
ベンジリデン，ベンジルグリコシド化Ｇ_５パーアセテー
ト２６．２ｇを得た。非還元末端４，６−Ｏ−ベンジリ
デン，ベンジルグリコシド化Ｇ_５パーアセテート２６．
２ｇを、ジオキサン３７０ｍｌ中で、ＫＯＨ１８０ｇと
ともに塩化ベンジル１８０ｍｌと１０５〜１１０℃で６
時間反応させることにより、非還元末端４，６−Ｏ−ベ
ンジリデンパーベルジル化Ｇ_５を得た。更に、非還元末
端４，６−Ｏ−ベンジリデンパーベンジル化Ｇ_５を、ア
セトン７５０ｍｌ、１Ｎ−ＨＣｌ１６０ｍｌ中、湯浴上
で環流させ、ベンジリデンをはずすことにより、非還元
末端４，６−ＯＨパーベンジル化Ｇ_５７．６ｇを得た。

この非還元末端４，６−ＯＨパーベンジル化Ｇ_５７．６
ｇにＢａＯ２３．１ｇ、Ｂａ（ＯＨ）_２・８Ｈ_２Ｏ９．
４ｇとともヨウ化メチル８４ｍｌをＤＭＦ２４０ｍｌ中
で光遮断下、４８時間室温にて反応させ、非還元末端
４，６−Ｏ−メチルパーベンジル化Ｇ_５を得、非還元末
端４，６−ジ−Ｏ−メチルパーベンジル化Ｇ_５を、メタ
ノール／酢酸エチル中でＰｄによる室温、常圧接触還元
を行なうことにより、非還元末端４，６−ジ−Ｏ−メチ
ル化Ｇ_５１．２ｇを得た。

次に、この非還元末端４，６−ジ−Ｏ−メチル化Ｇ_５を
１０％ｗ／ｖの溶液とし、これにしょ糖液４％ｗ／ｖを
等量混合し、バチルス・オーベンシス起源のサイクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼを添加し、３７
℃、ｐＨ６．０の条件下で１６時間静置し、反応させ
た。１６時間後、この反応液をカラムクロマトグラフィ
ー法で精製したところ、MeＧ_５Ｆ（ただし、Ｚ_１及びＺ
_２は水素原子）０．１２ｇが得られた。

実施例２ α−アミラーゼ活性測定例下記配合にて試薬Ｉを調製した。

試薬Ｉ上記で得られた基質１ｍｍｏｌ／（最終濃度） α−グルコシダーゼ２５Ｕ／ｍｌ（〃）マンニトールデヒドロゲナーゼ４０Ｕ／ｍｌ（〃）ＮＡＤＨ 0.16ｍｍｏｌ／（〃）ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）１００ｍｍｏｌ／（〃）上記試薬１８００μｌに、α−アミラーゼ活性が９０ｍ
Ｕ／ｍｌ、及び２７０ｍＵ／ｍｌをそれぞれ含む検体血
清１００μｌを加えて、３７℃で１０分間インキュベー
ションしながら、３４０ｎｍで吸光度変化を測定した。

結果を第１図に示す。

第１図から、本発明の方法によれば、６分以降におい
て、いずれの濃度でも良好な直線関係が得られているこ
とから、本発明によれば、α−アミラーゼ活性の安定か
つ高精度な測定が可能であることがわかる。

実施例３実施例２において、各検体血清に更に、グルコースを１
００ｍｇ／ｍｌ添加したこと以外は、同様の手順で測定
を行なった。

その結果、第１図と殆ど同一の結果が得られた。

このことから、本発明は内因性のグルコース等によって
は全く影響を受けないことがわかる。

実施例４基質としてＧ_５又はＧ_５Ｆを用いて、実施例２と同様に
して試薬を調製し、管理血清（EXA Normal,Abnormal
（共に三光純薬社製））及びプール血清について、同様
にα−アミラーゼ活性の測定を行い、測定値の日内変動
を調べた。日内変動は、１０点／１日の測定の平均値，
標準変差，変動係数を求めて比較した。また、１日１回
の測定を１０日間行った場合についても、同様に比較し
た。

なお、Ｇ_５については、まず、サンプル中の内因性グル
コースをヘキソキナーゼで消去後、ヘキソキナーゼを失
活し、次にサンプルをＧ_５を含むキットに加え、グルコ
ースオキシダーゼを作用させ、遊離してくるグルコース
を発色系に導いて測定した。

結果を第２表，第３表に示す。

第２，３表より次のことが明らかである。

即ち、標準変差及び変動係数は小さいほど測定精度が高
いことを意味し、従って、Ｇ_５よりもＧ_５Ｆの方がはる
かに精度が高く、Ｇ_５は内因性のグルコースの影響を受
けていることがわかる。

即ち、Ｇ_５では内因性グルコースの影響を小さくするた
めに、グルコースの希釈比を大きくとる必要がある。つ
まり、定量の試薬量に対して添加するサンプル量を減ら
す必要がある。例えば、通常の場合、サンプル０．１ｍ
ｌを試薬に加えて全体で１ｍｌとするが、Ｇ_５の場合に
は、サンプル０．０１ｍｌを試薬に加えて全体で１ｍｌ
とする。

このように、サンプルの希釈比を大きくすることは、測
定精度を悪化させることとなる。

実施例２で求めた第１図のように、実際の測定では吸光
度変化の直線角度（時間変化）からα−アミラーゼ活性
を判断するが、希釈比を大きくすると、この角度が小さ
くなり、α−アミラーゼ活性を判断しにくくなる。

このような測定精度の悪化は、第２，３表に示すよう
に、日内変動ないし経時変動として表れることとなる。

［発明の効果］以上詳述した通り、本発明のα−アミラーゼ測定用基質
は、一般式（Ｉ）に示すマルトオリゴ糖を含むものであ
って、このマルトオリゴ糖は、試料中のα−アミラーゼ
及び共役酵素のグルコシダーゼにより切断されてフルク
トース等の単糖類を生じ、これにより定量が可能となる
が、その際、糖の還元末端にグルコースを除く単糖類を
転位させてあるので、試料中に含まれる内因性グルコー
スやマルトース等の影響を受けることがない。従って、
本発明のα−アミラーゼ測定用基質によれば、正確にか
つ効率良くα−アミラーゼ活性を測定することが可能と
される。更に、一般式（Ｉ）の非還元末端に修飾したグ
ルコースを導入すると、より測定精度を上げることがで
きる。

また、本発明のα−アミラーゼ活性測定方法は、一般式
（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖と試料とをグルコシ
ダーゼの共存下に接触させ、遊離する還元末端を測定す
ることにより、試料中のα−アミラーゼ活性を測定する
ものであって、α−アミラーゼ活性の安定かつ高精度な
測定を容易に行なうことができる。特に遊離した還元末
端の単糖類をＮＡＤ又はＮＡＤＨ共存下酵素処理すると
こによりＮＡＤ又はＮＡＤＨが得られるが、この際の吸
光度測定は、試料中の他の夾雑物により影響を受けず、
安定して測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２で得られた吸光度変化の測定結果を示
すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリ
ゴ糖を含むことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定用
基質。Ａ−Ｇ_ｎ−Ｂ …… （Ｉ）（式中、Ａは、又はを、Ｂはグルコース以外の単糖類又はその誘導体を、Ｇ
はグルコースを、ｎは４〜８の整数をそれぞれ表わす。
ただし、（II）式又は（III）式において、Ｒ_１〜Ｒ_４
は水素原子、低級アルキル基又は（ＣＨ_２）_ｙＣＯＯＭ
（ｙは０、１又は２、Ｍは水素原子又はアルカリ金属を
表わす。）を、Ｘ_１〜Ｘ_４は酸素原子又はイオウ原子を
それぞれ表わす。）
【請求項２】前記（Ｉ）式中、Ｂがフルクトースである
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の基質。
【請求項３】マルトオリゴ糖は下記一般式（IV）で表わ
されるものであることを特徴とする特許請求の範囲第１
項又は第２項に記載の基質。（式中、Ｚ_１、Ｚ_２は水素原子又はリン酸基を表わ
す。）
【請求項４】下記一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリ
ゴ糖と試料とをグルコシダーゼの共存下に接触させ、遊
離するＢを測定することにより、試料中のα−アミラー
ゼ活性を測定することを特徴とするα−アミラーゼ活性
測定方法。Ａ−Ｇ_ｎ−Ｂ …… （Ｉ）（式中、Ａは、又はを、Ｂはグルコース以外の単糖類又はその誘導体を、Ｇ
はグルコースを、ｎは４〜８の整数をそれぞれ表わす。
ただし、（II）式又は（III）式において、Ｒ_１〜Ｒ_４
は水素原子、低級アルキル基又は（ＣＨ_２）_ｙＣＯＯＭ
（ｙは０、１又は２、Ｍは水素原子又はアルカリ金属を
表わす。）を、Ｘ_１〜Ｘ_４は酸素原子又はイオウ原子を
それぞれ表わす。）
【請求項５】前記（Ｉ）式中、Ｂがフルクトースである
ことを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の測定方
法。
【請求項６】マルトオリゴ糖は下記一般式（IV）で表わ
されるものであることを特徴とする特許請求の範囲第４
項又は第５項に記載の測定方法。（式中、Ｚ_１、Ｚ_２は水素原子又はリン酸基を表わ
す。）