DK167365B1

DK167365B1 - Process for preparing a maltoheptaose derivative

Info

Publication number: DK167365B1
Application number: DK149186A
Authority: DK
Inventors: E Rauscher; U Neumann; A W Wahlefeld; A Hagen; W Gruber; J Ziegenhorn; E Schaich; U Deneke; G Michal; G Weimann
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1977-09-13
Filing date: 1986-04-02
Publication date: 1993-10-18
Also published as: DK149186A; DK149186D0

Description

i DK 167365 B1in DK 167365 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde af den i patentkravet omhandlede art.The invention relates to a method of the kind claimed.

Bestemmelsen af or-amylasespejlet i serum er en vigtig klinisk parameter for bugspytkirtlens funktion. De i handelen værende 5 reagenser til bestemmelse af α-amylase er overvejende baseret på et system, ved hvilket stivelse nedbrydes af a-amylasen, og de dannede brudstykker bestemmes i det synlige område eller i UV-området, alt efter om man anvender farvet stivelse eller nativ stivelse som amylasesubstrat ved prøven. En væsentlig 10 ulempe ved denne fremgangsmåde eller dette reagens beror på, at stivelsen som makromolekyle kun kan karakteriseres og standardiseres utilstrækkeligt, således at omsætningsgraden af de enkelte partier falder meget forskelligt ud, og at der ved målingerne altid må medføres en standard. For at opnå bedre 15 resultater ville et mere ensartet substrat, som giver pålidelige resultater ved spaltningen, være nødvendigt.Determination of serum amylase levels is an important clinical parameter for pancreatic function. The commercially available 5 reagents for the determination of α-amylase are predominantly based on a system by which starch is broken down by the α-amylase and the fragments formed are determined in the visible or UV region, depending on whether colored starch is used. or native starch as amylase substrate by the sample. A major disadvantage of this method or reagent is that the starch as a macromolecule can only be characterized and standardized insufficiently so that the degree of conversion of the individual batches falls very differently and that a standard must always be introduced in the measurements. To achieve better results, a more uniform substrate that provides reliable results in cleavage would be needed.

Et skridt fremad i retning af et mere ensartet substrat gav anvendelsen af maltopentaose. Dette spaltes af a-arnylasen til en maltotriose og maltose, og maltotriose og maltose omdannes 20 af α-glucosidase til glucose, som så kan bestemmes efter ønskede metoder, f.eks. med den kendte hexokinasemetode.A step forward towards a more uniform substrate provided the use of maltopentaosis. This is cleaved by the α-arnylase to a maltotriose and maltose, and maltotriose and maltose are converted by α-glucosidase to glucose which can then be determined by desired methods, e.g. with the known hexokinase method.

Foruden maltopentaose er også maltotetraose og maltohexaose foreslået som substrat (amerikanske patenter nr. 3.879.263 og 4.000.042). Herved blev dog med tetraosen opnået tydeligt 25 dårligere resultater end med pentaosen, og med hexaosen endnu dårligere resultater end med tetraosen. Således angives for maltotetraose og -pentaose endnu en støkiometrisk reaktion, medens der for hexaosen blev konstateret lige netop tolerer-bare afvigelser fra den støkiometriske reaktion.In addition to maltopentaose, maltotetraose and maltohexaose have also been proposed as substrates (U.S. Patents Nos. 3,879,263 and 4,000,042). However, with the tetraose, 25 results were significantly worse than with the pentaose, and with the hexaose even worse results than with the tetraose. Thus, for another case of maltotetraose and pentaose, a stoichiometric reaction is indicated, while just the tolerable deviations from the stoichiometric reaction were found for the hexaose.

30 En ulempe ved maltopentaosen, der også forekommer ved tetraosen, er imidlertid, at der optræder en betydelig reagenstom-værdi, dvs. at målereaktionen forløber allerede før den prøve, som skal bestemmes, tilsættes. Hertil kommer, at også denne DK 167365 B1 2 reagens tomværdi ikke er konstant ved højere substratkoncentrationer, men forandrer sig i mere end 25 minutter, før der fås konstans af denne sidereaktion. Det har også vist sig, at den antagne forskellige spaltning af maltopentaosen med pankreas-5 cv-amylase og spyt-α-amylase, som havde muliggjort en adskillelse, faktisk ikke er til stede (J. BC, 1970, 245 3917 til 3927 J. Biochem. 51 p.XVIII 1952).However, one disadvantage of the maltopentaose, which also occurs with the tetraosis, is that a significant reagent body value occurs, ie. that the measurement reaction proceeds even before the sample to be determined is added. In addition, the vacancy value of this DK 167365 B1 2 reagent is also not constant at higher substrate concentrations, but changes for more than 25 minutes before constancy of this side reaction is obtained. It has also been found that the assumed different cleavage of the maltopentaose with pancreatic 5 cv amylase and salivary α-amylase, which had allowed a separation, is in fact not present (J. BC, 1970, 245 3917 to 3927 J Biochem. 51 p.XVIII 1952).

Det er derfor den foreliggende opfindelses opgave at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse, 10 der er velegnet som substrat til bestemmelse af a-amylase, som har en bedre renhed og ensartethed end de kendte substrater, er let tilgængeligt og med hensyn til tomværdi uden serum, varighed af LAG-fasen (dvs. den tid, der går før der optræder en lineær kinetik) og opnåelig maksimal aktivitet tilfreds-15 stiller kravene.It is therefore the object of the present invention to provide a process for the preparation of a compound suitable as a substrate for the determination of α-amylase, which has a better purity and uniformity than the known substrates, is readily available and of no value. without serum, duration of the LAG phase (i.e., the time elapsed before a linear kinetics occurs) and attainable maximal activity satisfy the requirements.

Ifølge opfindelsen løses denne opgave ved en fremgangsmåde til fremstilling af et maltoheptaosederivat med den almene formel IAccording to the invention, this problem is solved by a process for the preparation of a maltoheptaose derivative of the general formula I

CH2°h CH2OHCH2 ° h CH2OH

—o—i OH OH 5—O — in OH OH 5

HOHAY

hvor R er en phenylglucosid-, mononitrophenylglucosid- eller 20 dinitrophenylglucosid-gruppe, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.wherein R is a phenylglucoside, mononitrophenylglucoside or dinitrophenylglucoside group, the process being characterized by the characterizing part of the claim.

Phenyl grupperne kan stå i a- eller /3-stilling.The phenyl groups can be in the a or a 3 position.

Hos dinitrophenylglucosidgruppeme kan de to nitrogrupper være DK 167365 B1 3 i vilkårlige stillinger, f.eks. som 2,4-, 2,6- eller 3,5-sub-stituenter.In the dinitrophenylglucoside groups, the two nitro groups may be in any position, e.g. as 2,4-, 2,6- or 3,5-substituents.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af phenyl-derivater sker ved transglucosidering af phenylglucosidet 5 eller det tilsvarende nitrerede phenylglucosid med a-cyklodex-trin, amylose eller opløseligt stivelse i nærværelse af en specifik mikrobiel transferase. Hertil anvendes en transferase af Bacillus macerans, nemlig Bacillus macerans-amylase, f.eks. Bacillus macerans (E.C. 2.4.1.19. DSM 24; isolering: J. A. de 10 Pinto L.L. Campbell, Biochemistry 7, (1968) 114,- transfer reaktion: Methods in Carbohydr. Chemistry, bind II, 347), som ved siden af sin hydrolytiske og cykliserende virkning vitterlig også har en glucosyltransfererende virkning.The process of the invention for the preparation of phenyl derivatives is by transglucosidation of the phenylglucoside 5 or the corresponding nitrated phenylglucoside with α-cyclodex step, amylose or soluble starch in the presence of a specific microbial transferase. For this, a transferase of Bacillus macerans, namely Bacillus macerans amylase, e.g. Bacillus macerans (EC 2.4.1.19. DSM 24; isolation: JA de 10 Pinto LL Campbell, Biochemistry 7, (1968) 114, - transfer reaction: Methods in Carbohydr. Chemistry, Vol. II, 347), which in addition to its hydrolytic and cyclizing action also has a glucosyl transferring effect.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er analog med den fremgangs-15 måde, der er beskrevet i J. Amer. Chem. Soc. 76, 2387 ff (1954) , som beskriver omsætning af a-cyklodextrin med et phenylglucosid i nærværelse af Bacillus macerans-amylase. Ved denne kendte fremgangsmåde sker der en hurtig homologisering af det primære G7-produkt, hvilket fører til en blanding af 20 flere meget ensartede og dermed vanskeligt adskillelige oligo-merer. Det har overraskende vist sig, at en sådan homologisering ikke finder sted ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.The method of the invention is analogous to the method described in J. Amer. Chem. Soc. 76, 2387 et al. (1954), which describes the reaction of α-cyclodextrin with a phenylglucoside in the presence of Bacillus macerans amylase. In this known process, a rapid homologation of the primary G7 product occurs, leading to a mixture of 20 more highly uniform and thus difficult to separate oligomers. Surprisingly, it has been found that such homologization does not occur in the process of the invention.

Med fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås således den ønskede forbindelse i en renhed på ca. 94 vægt%, mens der ved den 25 kendte metode kun opnås en renhed på 17 vægt% af den ønskede forbindelse.Thus, with the process according to the invention, the desired compound is obtained in a purity of approx. 94% by weight, while in the known method only a purity of 17% by weight of the desired compound is obtained.

Overraskende har det også vist sig, at de ifølge opfindelsen fremstillede maltoheptaosederivater har overlegne egenskaber som substrat for a-amylasen, selv om der hos de til dette 30 formål allerede foreslåede oligomaltoser kunne konstateres et væsentligt fald i egnethed fra maltopentaose til maltohexaose, da der med den opnås væsentligt dårligere resultater end med pentaosen. Man skulle derfor have ventet, at med en yderligere forlængelse af maltose-oligosaccharidkæden ville der optræde DK 167365 B1 4 fejl, som ikke mere kunne tolereres. Overraskende opnås imidlertid bedre resultater end med pentaosen. Således er reagens-tomværdien ved 0,02 ml prøve med maltopentaose som substrat 73%, med maltoheptaose derimod kun 13% beregnet på slutværdien 5 af bestemmelsen i normalområdet.Surprisingly, it has also been found that the maltoheptaose derivatives prepared according to the invention have superior properties as a substrate for the α-amylase, although a significant decrease in fitness from maltopentaose to maltohexaose was already found for this purpose. it achieves significantly worse results than with the pentaosis. It would therefore have been expected that with a further extension of the maltose oligosaccharide chain, errors would occur which could no longer be tolerated. Surprisingly, however, better results are obtained than with the pentaosis. Thus, the reagent blank value at 0.02 ml sample with maltopentaose as substrate is 73%, with maltoheptaose, on the other hand, only 13% calculated on the final value of the determination in the normal range.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er således særligt velegnede til anvendelse ved den i DK fremlæggelsesskrift nr. 153.335 beskrevne fremgangsmåde til bestemmelse af oi-amylase.Thus, the compounds prepared by the process according to the invention are particularly well suited for use in the process described for DK-A-153,335 for the determination of o-amylase.

10 De ifølge opfindelsen fremstillede substrater er med opfindelsen gjort let tilgængelige i høj renhed. De egner sig til bestemmelse af a-amylase i biologiske væsker, såsom serum, hepa-rinplasma, urin og lignende eller i andre flydende eller fast materialer.The substrates made according to the invention are easily accessible in high purity with the invention. They are suitable for the determination of α-amylase in biological fluids such as serum, heparin plasma, urine and the like or in other liquid or solid materials.

15 Det følgende eksempel belyser opfindelsen.The following example illustrates the invention.

Eksempel p-nitrophenyl-of-maltooligosaccharid ved enzymatisk syntese med Bacillus macerans-amylase (E.C.2.4.1.19 af Bac. mac. DSM 24).Example p-Nitrophenyl-of-maltooligosaccharide by enzymatic synthesis with Bacillus macerans amylase (E.C.2.4.1.19 of Bac. Mac. DSM 24).

Bacillus macerans-amylase har foruden hydrolytisk og cyklise-20 rende virkning også glucosyl-transfererende egenskaber, som kan udnyttes til syntese af oligosaccharider og -derivater (Methods in Carbohydrate Chemistry II, 347) . Til syntese af para-nitrophenyl-oligosaccharider blev denne fremgangsmåde optimeret som følger: 25 680 mg Bacillus macerans-amylase (E.C.2.4.1.19 af Bac. mac.In addition to hydrolytic and cyclizing activity, Bacillus macerans amylase also has glucosyl-transferring properties which can be utilized for the synthesis of oligosaccharides and derivatives (Methods in Carbohydrate Chemistry II, 347). For the synthesis of para-nitrophenyl oligosaccharides, this procedure was optimized as follows: 25 680 mg of Bacillus macerans amylase (E.C.2.4.1.19 of Bac. Mac.

DSM 24) (lyofilisat) (0,46 U/mg afvejning, proteinindhold af afvejningen 28,5%, fri for p-nitrophenyl-a-D-glucosidspaltende aktivitet).DSM 24) (lyophilisate) (0.46 U / mg tradeoff, protein content of tradeoff 28.5%, free of p-nitrophenyl-α-D-glucoside cleavage activity).

400 mg a-D-nitrophenylglucosid 30 3,5 g α-cyklodextrin, og400 mg of α-D-nitrophenylglucoside 3.5 g of α-cyclodextrin, and

Claims

Process for the preparation of maltoheptaose derivative of the general formula I CH 2 OH CH 2 OH.-1 OH OH 5 HO wherein R is a phenylglucoside, mononitrophenylglucoside or dinitrophenylglucoside group, characterized in that the phenylglucoside or nitrated phenylglucoside or nitrated phenyl is reacted. cyclodextrin, amylose or soluble starch in the presence of Bacillus macerans amylase free from p-nitrophenyl-αD-glucoside cleavage activity.