CS236751B2 - Processing of substrates for determining of alpha-amylase - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových sloučenin, které jsou substráty pro· a-amylázu a jsou obzvláště vhodné pro· její stanovení.

Stanovení hladiny α-amylázy v séru je důležitým klinickým ukazatelem funkce slinivky břišní. Komerční činidla ke stanovení a-amylázy se zakládají převážně na postupu, při němž se škrob odbourá α-amylázou a vzniklé štěpné produkty se stanoví ve viditelném· nebo ultrafialovém rozsahu, podle toho, zda se při stanovení použije obarveného nebo přírodního škrobu jako.amylázového substrátu. Podstatnou nevýhodou těchto způsobů, popřípadě činidel je, že škrob jakožto makromolekulu lze jen nedostatečně charakterizovat a standardizovat, takže stupeň konverze jednotlivých vsázek vychází velmi rozdílný a při stanovení měřením· je nutno vždy použít současně standardu. Pro dosažení lepších výsledků by bylo zapotřebí jednotnějšího substrátu, který při štěpení skýtá spolehlivé výsledky.

Krok vpřed k jednotnějšímu substrátu přineslo· použití maltopentózy. Maltopentóza je štěpena α-amylázou v maltotriózu a maltózu, maltotrióza a maltóza se převedou působením α-glukozidázy v glukózu, kterou je pak možno· stanovit libovolnými postupy, například známou metodou používající hexokinázy.

Kromě maltopentózy byla jako substrát již navržena mialtopentóza a maltohexóza (patentové spisy USA 3 879 263 a 4 000· 042). Přitom^ však bylo s tetrózou dosaženo· zřetelně horších výsledků než s pentózou a hexózou ještě horších výsledků než s tetrózou. Tak se pro· maltotetrózu a maltopentózu uvádí ještě stechiometrická reakce, zatímco pro· hexózu byly již zjištěny odchylky od stechiometrické reakce, které jsou právě ještě v mezích přípustnosti.

Nevýhodou maltopentózy, která je též nevýhodou u tetrózy, vsak je, že vzniká značná slepá hodnota činidla, tj. že měřicí reakce již probíhá dříve, než se přidá vzorek, jenž se má stanovit. K tomu přistupuje, že ani tato· slepá hodnota činidla není při vyšších koncentracích substrátu konstantní, nýbrž se mění po dobu delší než 25 minut, dříve než se dosáhne konstantnosti této· vedlejší reakce. Rovněž se ukázalo, že k předpokládanému rozdílnému štěpení maltopentózy α-amylázou ze slinivky břišní a a-amylázou ze slin, kteréžto štěpení by bylo umožnilo rozlišení obou těchto amyláz, ve skutečnosti nedochází (J. BC. 1970, 245, str. 3917 až 3927; J. Biochem. 51, str. XVIII, 1952). ...........

3 6 7 5 1

Podnětem k vynálezu byl proto úkol, poskytnout způsob výroby substrátu ke stanovení «-amylázy, kterýžto substrát by se vyznačoval lepší čistotou a jednotností než známé substráty, byl ' by snadno· dostupný a odpovídal by potřebným požadavkům, pokud jde o slepou hodnotu bez séra, dobu trvání fáze lag a dosažitelnou maximální aktivitu. Dále má být umožněn jednoduchý postup stanovení bez drahé a složité aparatury, jakož i vhodnost pro okamžité stanovení, například v podobě zkušebních proužků.

Vynález řeší tento úkol způsobem výroby sloučeniny obecného¹ vzorce I,

OH

(l ) (i) kde

R znamená fenylglukozidovou, minonitrofenylglukozidovou nebo dinitrofenylglukozidovou skupinu, kterýžto· . způsob se vyznačuje tím, že se příslušný . fenylglukozid, popřípadě nitrovaný fenylglukozid, nechá reagovat s «-cyklodextrinem, amylázou nebo rozpustným škrobem v přítomnosti amylázy · z Bacíllus macerans.

Způsob podle vynálezu k enzymatické výrobě fenylových derivátů se provádí transglukozidací fenylglukozidu, popřípadě příslušných nitrovaných fenylglukozidů a-cyklodextrinem, amylázou nebo· rozpustným škrobem v přítomnosti specifické mikrobiální transferázy. Výhodně .se k tomu používá transferázy z. Bacillus macerans. Přitom je možno· pro tuto transglukozidaci použít známé· amylázy z Bacillus.· macerans (E. C. 2. 4. 1. 19. DSM 24; izolace: J. A. de Pinto, L. L. Campbell, Bioc-hemistry 7 [1968] str. 114; transferové reakce: . Methods in Carbohydr. Chemistry, sv. II, str. 347], která se kromě svého hydrolytického a cyklizujícího· účinku vyznačuje zřejmě i účinností pro · přenos glukozylu.

Sloučeniny, které je možno připravit způsobem, podle vynálezu, se obzvlášť hodí pro způsob stanovení α-amylázy podle čs. patentu č. 236 758.

Sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu jsou snadno · dostupné a získají se ve· vysoké čistotě. Jsou vhodné pro stanovení «-amylázy v biologických kapalinách, jako· jsou sérum, heparinové plazma, moč apod., nebo v jiných kapalných nebo tuhých látkách.

Vynález je blíže objasněn dále uvedenými příklady.

Příklad 1

Výroba, a-fenylmaltoheptozidu a ] Tride.kosacetyl-3-D-maltoheptóza

57,6 g (50 mmolů) maltoheptózy a 41 g (500· mmolů) octanu sodného (bezvodého) se suspenduje v 543 ml (5,75 molu) anhydridu kyseliny octové a směs se intenzívně míchá bez přístupu vlhkosti 4 hodiny při teplotě 1-QO ^eC. Po · ochlazení na teplotu přibližně· 60· °C se reakční směs vmíchá přibližně do 1 litru ledové· vody. V míchání se pokračuje přes noc při teplotě 4 °C, přičemž se vyloučí tuhá polokrystalická hmota. Po odlití kapaliny nad hmotou se zbytek znovu rozmíchá v ledové· vodě. Přitom· produkt zcela vykrystaluje. Po izolování se promyje. · a vysuší.

Výtěžek činí 80,7 g (76 % teorie) -bezbarvých krystalů.

[a^D²⁰ = +137,5° (c = 1,15, chloroform), teplota tání 150· °C (neostrá).

Matečný louh (dekantát) se odpaří do sucha za sníženého· tlaku a zbytek se rovněž rozetře s ledovou vodou á nechá vykrystalovat.

Výtěžek činí 22,3 g.

[«jjd²⁰ = 136° [c = 1, chloroform), teplota tání 150· °C. Celkový výtěžek je 103 g, · tj. přibližně 97 · % teorie.

Získaný produkt je možno překrystalovat z ethanolu, přičemž se ani po několikanásobném· překrystalování teplota tání ani otáčivost nemění. Produkt je tedy na prvém atomu uhlíku opticky jednotně [-3) konfigurován.

b) Do(de'kosacetyllα-fenyl-D-maItoheptozid

Směs 9,54 g (4,5 mmolu) tridekosacetyl-./3-D-maaloheiptó.zy, 0,61 g (4,5 mmolu) čerstvě roztaveného chloridu zinečnatého ZnCiz a 4,23 g (45 mmolů) destilovaného fenolu se za nepřístupu vlhkosti míchá 2,5 hodiny při teplotě 100 °C Pak se směs ještě za tepla rozpustí v ethylacetátu a dvakrát promyje vždy 100^; ml vody, třikrát vždy 100 ml 1 N roztoku hydroxidu sodného, 100· ml 1 N kyseliny octové a 100· ml nasyceného· roztoku chloridu sodného. Zpočátku hnědý roztok se přitom· odbarví na světle žluto. Po vysušení síranem hořečnatým se reakční směs odpaří do sucha a zbytek se rozpustí ve 30 ml teplého methanolu. Stáním přes noc se vyloučí sirupovitá látka, která se nechá vykrystalovat z ethanolu.

Výtěžek: 8,7 g (90· ·% teorie).

Teplota tání 155 až 165 ^CC (za rozkladu). [a2jb²°· = +147° (c = 8, v chloroformu).

c) Fenylla-D-malto·heρtozid

10,8 g (5 · mmolů) peracetyl-l-fenyl-a-D-maltoheptozidu se za tepla rozpustí ve 200 mililitrech bezvodého methanolu a k roz236751 toku se při teplotě místnosti Z3 přidání malého množství dioxanu přidá za míchání 30· ml 0,1 N natriummefhoxidu, palk se směs míchá 16 hodin při teplotě místnosti. Po 20 minutách se začne vylučovat polokrystalický produkt. Nakonec se přidá 200 ml acetonu, směs se ochladí na teplotu 4 °C a produkt se· odsaje. Ten se pak rozpustí ve 160 mililitrech vody, vzniklý roztok se odbarví aktivním uhlím a zbaví solí v kationtovém iontoměniči (Dowex 50· H+).

Výtěžek činí 5,6 g (91 °/o teorie) bezbarvého lyofilizátu.

l«2]fo²⁰ = +176° (c = 10, ve vodě), volné maltoheptózy a — podle vysokotlaké kapalinové chromatografické analýzy (detekce při 254 nm) — ještě 2 UV-pozitivní nečistoty. Tyto se Oddělí chromatograficky na zesíleném dextranu (Sephadex LH 20) s vodou jakožto· elučním činidlem.

Příklad 2

Výroba p-nitrofenyl-a-D-ina.ltoheptozidu

a) Peracetyl-p-nitrofenyl-aa-D-maltoheptozid

13,6 g (20^: mmolů) peracetylmaltoheptózy, připravené postupem popsaným· v příkladu la), se spolu s 11,9 g (100 mmolů) p-nitrofenolu rozpustí v 90 ml bezvodého benzenu a za míchání bez přístupu vlhkosti se přidá 10,4 g = 4,5 ml (40 mmolů) chloridu cíničitého SnCli. Přitom se vyloučí objemná hmota, která se však zahříváním opět rozpustí. Reakční hmota se zahřívá k varu 1 hodinu pod zpětným chladičem. O-chlazením se vyloučí tuhá hmota, která se po přidání 80 ml ethylacetátu opět rozpustí. Po vmíchání roztoku do' 180 ml 2 N roztoku uhličitanu sodného NazCOj se vyloučí hydrát kysličníku cínu, který se oddělí za přidání malého množství aktivního uhlí. Vodná fáze se oddělí a organická fáze se dobře promyje, nakonec nasyceným roztokem chloridu sodného. Po vysušení a odpaření roztoku se získá pryskyřičný produkt, který vykrystaluje z ethanolu.

Výtěžek činí 6,2 g (41 % teorie).

Teplota tání 100 °C (za rozkladu).

«2] :_d ²° = +131° (c = 1, v chloroformu).

Tento produkt se rovněž získá, -když· se násada provede do chloroformu .nebo· s chloridem titan-čitým TiCh místo chloridu cíničitého SnCU.

b) p-nitrofenyl--z-D-malloheptozid

5,5 g (7 mmolů) peracetyl-p-nitrofe.nylmaltoheptozidu se suspenduje ve 100 m.l bezvodého methanolu a k suspenzi se přidá 5 ml přibližně 1N roztoku natriummethoxidu. Výchozí látku se stane medovitou a pomalu se rozpustí. Po určité době počne krystalické vyplučování desacetylovaného produktu, které je po míchání přes noc skončeno. Pak se produkt odsaje, promyje 'i^e^tl^anolem· a

Výtěžek činí 2,8 g (86 % teorie). = +124° (c = 0.6, ve vodě).

Produkt se přečistí na zesítěném dextranu (Sephadex LH 20) s vodou jakožto elučním činidlem. Získá se 1,2 g (45 % teorie) výše popsané sloučeniny, která je aktivní při enzymatickém testu. Kromě toho se tato· sloučenina získá i nitnací a-fenylmaltoheptozidu z příkladu 1 nitrační kysehnou podle postupu popsaného v časopisu Bull. Chem. Soc. Japan, 34, (1961) str. 718.

Použitím dinitroíenolu místo mononitrofenolu· se získají příslušné dinitrofenylové sloučeniny.

Příklad 3

P-nitrofenyl-a'--aaltOΌllgosacharidy enzymatickou syntézou pom-ocí amylázy z Bacillus maaerans (E. C. 2. 4. 1. 19. z Bac. mac. DSM 24)

Amyláza z Bacillus macerans má kromě hydrolytického· a cyklizujícího účinku i glykczyltransfrračm vlastnosti, kterých je možno využít k syntéze oligosacharidů a jejich derivátů (Methods in C^ibo]hy(^j^:ate Chemistry, sv. II, str. 347). Pro syntézu p-nitrofenyloligosacharidů byl tento způsob optimalizována takto: '

680· mg amylázy z Bacillus macerans (E. C. 2. 4. 1. 19. z Bac. mac. DSM 24) (ly-ofill· zát) (0,4-6 j./mg · navážky, obsah proteinu v navážce 28,5 °/o, bez aktivit štěpících p-nitrofenyl-a-D-glukozid) se smísí s 400' -mg a-D-p-nitrofenylglukozldu, 3,5 g a-cyklodextrinu a 70 ml Soorensenova fosfátového pufru o pH 6,2; 0,01 M. Násada se ponechá 24 hodiny v inkubátoru při teplotě 37 °C. Pro přečištění se pak oddělí a- a vzniklý β-cyklodextrin, nejprve přes trtrachlorethyI lenovou komplexní sloučeninu. Po chromatografickém zpracování na zesítěném dextranu (Sephadex LH 20) se získá 50· mg lyofilizátu p-nitrofenylm.alloheploztdu, vysoce aktivního v amylázovém testu.

Příklad 4

Výroba maltoheptitu g maltoheptózy se rozpustí v 50· ml vody, k roztoku se po· částech přidají 2 g natri^umborbydridu NaBHj a směs se míchá 75 minut při teplotě místnosti (zkouška na redukovaný cukr negativní). Chrom atograficky se na .kationtovém iontoměniči (Dowex 50 H+) odstraní sodný ion Na+ (hodnota pH roztoku po průchodu· iontoměničem rovná se 3,5). Prošlý roztok se odpaří za sníženého tlaku do · sucha · a několikrát se opětovně rozpustí směsí me^^hanolu a vody (přídavek vody k roztoku produktu) a odpaří k odstranění kyseliny borité v podobě methylesteru. Roztok, který je po skončení tohoto· postupu neutrální, se lyofilizuje.

Výtěžek činí 9 g (90 ·°/o teorie) produktu neobsahujícího· redukující cukry. Obsah (stanoveno enzymaticky) podílu z glukózy 86,1 procenta, ze sorbitolu 89,0 · %ť voda 8,5 %.

Příklad 5

Výroba kyseliny maltoheptonové

Do 150 ml vody se vnese 11,5 g (0,01 molu) ma.ltoheptózy 6 g benzoanu barnatého. Zia míchání a chlazení se přidá 1 ml bromu a v míchání sa pokračuje 36 hodin. Po odehnání · nadbytku bromu dusíkem se k reakční směsi přidají 4 ml 4 N kyseliny sírové a malé množství aktivního uhlí, směs se zfiltruje a filtrát · se extrahuje chloroformem k odstranění kyseliny benzoové. K vodnému roztoku se přidá 3,2 g uhličitanu stříbrného AgžCOs a směs se míchá při neutrálním pH. Nerozpustné soli se odfiltrují a čirý roztok se nechá projít přes 20 ml Amber.litu JRH + . Kyselý eluát se ihned zneutralizuje hydroxidem sodným a· lyofilizuje.

Výtěžek činí 8 g (72 % teorie).

Obsah (stanoveno enzymaticky) podílů z glukózy 85 ·%, z kyseliny glukonové 80 %, vody 9,3 °/o.

Příklad 6

Důkaz α-amyálzy za použití fenyl-a-maltoheptozidu jakožto substrátu

Fenyl-a-maltoh.eptozid se α-amylázou štěpí na fenyl-α -maltotriid nebo fenyl-a-maltotetraid, které se pomocí a-glukozidázy přemění ve fenol a _Zglukózu. Uvolněný fenol se monofenoloxidázou oxidačně kopuluje s nukleo-filním· činidlem, 3-methyl-6-sulfonyl-benzthiazolonhydrozonem-(2) (HSK) za vzniku červeného · barviva, jehož rychlost tvorby je úměrná amylázové aktivitě ve vzorku a může být fotometricky sledována.

Princip testu:

1.

a) fenyl-a-maltoheptozid + a-amyláza + 1HO--------> fenyl-a-D-tri-(tetra)glukopyranozid + maltotetra- (tri) -óza

b) fenyl-a-D-trii(tetra)glukopyranozid + a-glukozidáza + 3 (4) H2O----------> fenol +

4- 3 (popřípadě 4) glukózy

c) fenol + HSK 4- monof-enoloxidáza

4- Ož-----------> barvivo· + + 2 HžO.

Podmínky při měření: 25 ^CU, délka vlny

492 nm, 1 cm kyvety; složení činidla je uvedeno v následující tabulce:

Činidlo

Koncentrace při zkoušce fosfátový pufr, pH 7,4 0,05 molu/1 chlorid sodný 0,05 molu/1 fe.nyl-a-D-maltoheptozid 10 mmolů/1

HSK 1 mmol/1 monofenoloxidáza 1 j/ml a-gluikozidáza 10 j/ml

Objem· směsi při zkoušce: 2,0· ml.

Místo fosfátového pufru je možno použít i glycinový, glycylglycinový, hepesový, tris-, tra- a jiné pufry.

příklad 7

Stanovení α-amylázy pomocí ptnitiofenylt maltoheptozidu

Princip testu:

p-nitrofenyl-a-maltoheptoa-amyláza zid —------- (glukóza)n + p-nitrofenyla-glukozidáza a-(glukóza)m--------► n glukóza +

4- p-nitrofenol.

Po rozštěpení maltoheptozidu se štěpné produkty odbourají na glukózu a p-nitrofenol. Vzniklý· p-nitrof-enolál^c^vý anion je v alkalickém roztoku žlutě zbarven a lze jej tudíž měřením stanovit přímo optlciky.

Testovací soustava:

Reakční směs:

mmolů/1 fosfátového· pufru, pH 7,4

50¹ mmolů/1 chloridu sodného až 50 j./ml a-glukozidázy popřípadě 10 mmolů/1 p-nitrofenylta-maltoheptozidu.

Násada při testu:

ml reagenční směsi -h- 50 μ1 vzorku (sérum).

Teplota 30 °C, vlnová délka: 405 nm.

Zahájením testu přidáním séra po dosažení měřicí teploty (předběžná inkubace 10 niinrit).

Příklad 8

Stanovení α-amylázy pomocí maltoheptitu

Princip testu:

a-amyláza maltoheptit 4-H2O----->m.artotг iit 44- maltotetróza

10

α-glukozidáza		diaforáza
maltotriit + H2O-------> sorbitol 4	NADH	+ INT + H+-----> formazan
+ maltóza	+ NAD	H
SDH	SDH =	sorbitoldehydrogenáza;
sorbtitol + NAD+-----> fruktóza +	NAD ==	; oxidovaný mkofinamidadeniιn-
+ NADH + H+		dinukleotid;
	NADH	— redukovaný nikotinamidadenin-
		dinukleotid.
Testovací soustava:
Re-agenční násada	ml	Koncentrace při testu
Na-/K-PO/,-pufr 0,02 molu/1 + triton x 100	1,92	12,8 mmolu/1 POi
O ml/100 ml
+ NaCl 10 mmolů/1, pH 6,9		6,4 mmolu/1
MgCl2 0,3 molu/1	0,01	1,0 mmol/1
maltoheptit 100 mmolů/1	0,10·	3,3 mmolu/1
NAD c = 40· mg/ml	0,05	1,0 mmol/1
INT c = 0,6 mg/ml	0,20	0,09 mmolu/1
diaforáza (ClostT. Kluyveri) 5 mg/ml*)	0,05	167 j/1
ATP c = 50· mg/ml	0,10	3,29 mmo.lu/1
hexokináza 280 j/ml*)	0,05'	4 666 j/1
SDH 180 j/ml*)	0,30	18 000 j/1
a-glukozidáza 1120 j/ml*	0,20·	74 670 j/1
vzorek (sérum)	0,02

) v testovém pufru

Zahájení testu přidáním vzorku: měření se provádí při délce vlny 492 nm; teplota 25 °C.

Příklad 9

Stanovení wamylázy pomocí kyseliny maltoheptaglukonové

Princip testu:

kyselina maltoheptaglukonové + a-amyláza + H2O-----> kyselina maltotrioglukonová + maltotetróza kyselina maltotrioglukonová + a-glukozidáza + H2O-------> kyselina glukonová + maltóza kyselina glukonová + a-glukonátkináza

ATP----------> 6--fo^^át kyseliny glukonové + adenosindifosfát

6-fosfát kyseliny glukonové + dehydrogenáza kyseliny + NAD------------->

6-fosfoulukonové

- ribulózo-5-fosfát + · NADPH + CO2 + + H+.

ATP = adenosintrifosfát

NADP = oxidovaný nikotinamidadenindinukleotid-fosfát

NADPH = redukovaný nikotinamidadenindlnukleotid-fosfát.

Testovací soustava:

Reagenční násada	ml	Konce	rntrace při testu
Na-/K—POi-pufr 0,02 molu/1	2,19	14,6	mmolu/1 fosfátu
+ NaCl 10 mmolů/1, pH 6,9		7,3	mmolu/1 NaCl
MgClž 1 mol/1	0,01	3,3	mmolu/1
kyselina maltoheptaglukonová 150 mmolů/1	0,10	5	mmolů/1
NADP c = 10· mg/ml	0,10	0,38	mmolů/1
ATP c = 50 mg/ml	0,10:	2,7	mmolu/1
glukonáťkináza 40 j/ml	0,03	1066	j/1
dehydrogenáza kyseliny 6-fosfoglukonové			j/1
24 j/ml	0,10	800
a-glukozidáza 1120 j/ml	0,30	11,2 x 104 j/1
Vzorek (síran)	0,02

Zahájení testu přidáním vzorku; měření se provádí při délce vlny 340· nm· nebo 365 nm; teplota: 25 °C; objem· směsi při zkoušce

3,00 ml.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNALEZU

   Způsob výroby substrátu pro stanovení a-amylázy, tvořeného sloučeninou obecného vzorce I, kde

   R znamená fenylglukozidovou, monomitrofenylglukozidovou nebo dinitrofenylglukozidovou skupinu, vyznačující se tím, že se příslušný fenylglukozid, popřípadě nitrovaný fenylglukozid, nechá reagovat s a-cyklodextrinem, amylózou nebo rozpustným škrobem v přítomnosti amylázy z Bacillus macerans.