Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Method of determining of alpha-amylase
CS236758B2
Czechoslovakia
- Other languages
English - Inventor
Elli Rauscher Ulrich Neumann August Wahlefeld Alexander Hagen Wolfgang Gruber Joachim Ziegenhorn Eugen Schaich Ulfert Deneke Gerhard Michal Guenter Weimann
Worldwide applications
Application CS592078A events
1985-05-15
Description
translated from
Předmětem vynálezu je způsob a činidlo ke stanovení a-amylázy.
Stanovení a-amylázy v séru je důležitým klinickým parametrem pro funkci slinivky břišní. Komerční činidla ke stanovení a-amylázy se zakládají převážně na postupu, při němž se škrob odbourá · α-amylázou a vzniklé štěpné produkty se určují ve viditelném nebo ultrafialovém rozsahu, podle toho, zda se při určování použije obarveného· nebo přírodního škrobu jako amylázového substrátu. Podstatnou nevýhodou těchto způsobů, popřípadě činidel je, že škrob jakožto makromolekulu lze jen nedostatečně charakterizovat a· standardizovat, takže stupeň konverze jednotlivých vsázek vychází velmi rozdílný a při určování měřením je vždy nutno použít současně standardu. Pro dosažení lepších výsledků by bylo zapotřebí jednotnějšího substrátu, který při štěpení skýtá spolehlivé výsledky.
Krok vpřed k jednotnějšímu substrátu přineslo použití maltopentózy. Tato je a-amylázou štěpena v maltotriózu a maltózu, maltotrióza a maltóza se převedou a-glukosidázou v· glukózu, kterou je pak možno stanovit libovolnými postupy, například známou hexokinázovou metodou.
Kromě maltopentózy byla již jako substrát navržena maltotetróza a maltoheóza [patenty USA č. 3 879 263, 4 000 042). Přitom· však bylo s tetrózou dosažen zřetelně horších výsledků než s pentózou, a s hexózou ještě horších výsledků než s tetrózou. Tak se pro maltotetrózu a maltopentózu uvádí ještě stechiometrická reakce, zatímco pro hexózu byly již zjištěny právě ještě tolerovatelné odchylky od stechiometrické reakce.
Nevýhodou maltopentózy, která byla shledána i u tetrózy, však je, že vzniká značně slepá hodnota činidla, tj. že měřicí reakce již probíhá, dříve než se přidá vzorek, jenž se má stanovit. K tomu přistupuje, že tato slepá hodnota činidla není při vyšších· koncentracích substrátu konstantní, nýbrž se mění po dobu delší než 2'5 minut, dříve než se dosáhne neměnnosti této vedlejší reakce. Rovněž se ukázalo, že k předpokládanému rozdílnému štěpení maltopentózy a-amylázou ze slinivky břišní a α-amylázou ze slin, kteréžto štěpení by bylo umožnilo rozlišení, ve skutečnosti nedochází (J. BC., 1970, 245, str. 3917 · až 3927; J. Biochem., 51, str. XVIII 1952)·.
Podnětem k vynálezu byl tedy úkol, poskytnout způsob a činidlo ke stanovení aamylázy, při němž se používá substrátu, který se vyznačuje vyšší čistotou a jednotností než· známé substráty, je snadno dostupný a
2367S8 odpovídá potřebným požadavkům, poikud jde o slepou hodnotu bez séra, dobu trvání fáze lag a dosažitelnou maximální aktivitu. Dále má být umožněn jednoduchý postup stanovení, bez drahé a složité aparatury, jakož i vhodnost pro okamžité stanovení, jako jsou zkušební proužky.
Tento úkol vynález řeší zipůsoibeim ke stanovení α-amylázy enzymatickým štěpením α-amylázového substrátu a měřením štěpného produktu, kterýžto způsob se vyznačuje tím, že jako substrátu se použije sloučeniny obecného vzorce I
kde
R znamená glulkosidovou, fenylglukosidovou, mononitrofenylglukosidovou, dinitrofenylglukosidovou nebo sorbitolovou skupinu nebo skupinu glukonové kyseliny.
Překvapivě se ukázalo, že maltoheptóza má vhodnější vlastnosti jakožto a-amylázový substrát, i když u oligomaltóz, již navržených pro tento účel, byl při přechodu od maltopentózy к maltohexóze zjištěn podstatný úbytek vhodnosti, poněvadž jejím použitím se dosáhne horších výsledků než s pentózou. Bylo možno tedy očeíkávat, že další prodloužení maltozo-oligosacharidového řetězce bude mít za následek vznik již netolerovaných nedostatků. Překvapivě se však dosahuje lepších výsledků než s pentózou. Tak činí slepá hodnota činidla při 0,02 ml vzorku s maltopentózou jakožto substrátem 73 °/o, s maltoheptózou naproti tomu 13 %, vztaženo na finální hodnotu stanovení v normálním rozsahu.
Kromě toho bylo zjištěno, že místo samotné maltoheptózy je možno použít i určitých derivátů maltoheptózy, které při působení α-amylázy tvoří odvozený štěpný produkt, který je možno stanovit obzvlášť výhodně.
Způsob podle vynálezu je vhodný zejména při stanovení štěpných produktů pomocí a-glukosidázy nebo maltózofosforylázy.
Při stanovení pomocí α-glukosidázy a sloučeniny obecného vzorce I, kde R znamená glukosidovou skupinu, se štěpné produkty maltoheptózy, maltotetrózy a maltotriózy štěpí dále na glukózu, a ta se pak stanoví o sobě známým postupem. Pro stanovení vzniklé glukózy je pak v přítomnosti -a-glukosidázy obzvlášť vhodný způsob s hexokinázou. Princip tohoto provedení způsobu podle vynálezu je možno znázornit těmito rovnicemi:
a-amyláza maltoheptóza + H2O------> maltotrióza + maltotetróza a-glukosidáza maltotrióza + 2 H2O--------> 3 glukózy a-glukosidáza maltotetróza + 3 H2O--------> 4 glukózy glukóz + 7 aidenosintrifosfát (ATP) ->
hexokináza (HK) ----------► 7 glukózo-6-fosfát.
glukózo-6-fosfát + 7 oxidovaný nikotinamidadenindinukleotid 4glukózo-16-fosfátdehydrogenáza +---------------->
-> 7 glukonát-6-fosfát + 7 redukovaný nikotinamidadenindinukleotid (NADH) -h + 7 H+ .
Pro toto provedení způsobu podle vynálezu jsou zejména vhodné i deriváty maltoheptózy, použité podle vynálezu, tedy sloučeniny obecného vzorce I, v nichž symbol R neznamená glukosidovou skupinu. Působě236758 ním obou enzymů α-amylázy a a-glukosidázy se tento substituent, tedy fenylová, moinonitrofenyloivá nebo dinitrofenylová skupina, popřípadě na konci vázaný sorbitolový zbytek nebo zbytek glukonové kyseliny, odštěpí a lze jej snadno stanovit. Uvedené fenylové skupiny mohou být vázány z a- nebo ^-poloze; jde-li o a-polohu, dochází к jejich odštěpení působením samotné α-amylázy a α-glukosidázy a odštěpené, substituované nebo nesubstituované fenoly je pak možno snadno stanovit známými barevnými reakcemi. Vynálezu je však možno též použít při substituente-ch, vázaných v poloze β. V tomto případě se kromě «-glukosidázy používá navíc ještě β-glukosidázy.
U dimitrofenylových zbytků mohou též být obě nitroskupiny vázány v libovolných polohách, například jako 2,4-, 2,6- nebo 3,5-substituenty.
Nitrofenoly, popřípadě dinitrofenoly, uvolňující se při odštěpování substltuentu obsahujících nitroskupiny, jsou již samy o sobě zbarvené sloučeniny, které je možno bez dalšího opticky stanovit. Odštěpuje-li se pouhý fenol, lze jej stanovit známými postupy, například reakcí s nukleofilním činidlem, jako je 3-methyl-6-sulfonyl-benzthiazolohydrazon-(2) — (HSK) v přítomnosti monofenoloxidázy. Při této reakci vzniká červené barvivo, které je možno měřit.
Při odštěpení sorbi-olu je tento možno oxidovat například sorbitoldehydrogenázou na fruíktózu; současně se přítomný oxidovaný nikotinamidadenindinukleotid (NAD) redukuje v redukovaný nikotinamidadenindinukleotid (NADH). Tvorbu NADH je možno známým, způsobem snadno určit UV-spsktrofotometrem. Není-li tento přístroj к dispozici, může se reakcí s tetrazoliovou solí, jako je například 2-(p-jodfenyl)-3-(p-nitrofenyI)-5-fenyltetrazoliumchlorid [INT) v přítomnosti diaforázy nebo jiného přenášeče elektronů vytvořit i barevný formazan, který je možno stanovit měřením ve viditelném rozsahu.
Analogicky je možno stanovit uvolněnou kyselinu glukonovou příslušnými známými metodami, například pomocí glukonátkinázy, dehydrogenázy kyseliny 6-fosfoglukonové a oxidovaného nikotinamidadenindinukleotid fosfátu -(NADP), popřípadě pomocí tetrazoliové soli a přenášeče elektronů.
Pro provádění způsobu podle vynálezu jsou obecně vhodné hodnoty pH v rozmezí 5 až 9. Výhodně se pracuje při hodnotách pH v· rozmezí 7 až 7,5, poněvadž se přitom dosáhne nejlepších výsledků při nejkratší reakční době. Použije-li se při způsobu podle vynálezu nitrofenylových sloučenin, je rozsah vhodných hodnot pH poněkud užší a je obvykle v rozmezí 6 až 8,5.
Jako pufry se hodí takové látky, které jsou účinné v rozsahu hlavní aktivity použitých enzymů. Výhodně se používá fosfátu, kyseliny N- (2-hydroxyethyl )piperazin-N-2-ethansulfonové (HEPES) a glycylglycinu.
Výhodné koncentrace jsou v rozmezí 10 až 200 mmolů/1.
α-glukosidázy se obvykle používá v množství 0,1 až 5000' J/ml. Je obzvláštní výhodou způsobu podle vynálezu, že je možno použít poměrně velkého· množství tohoto enzymu, takže činitelem určujícím rychlost ještě vyššího množství tohoto enzymu, čímž se však již nedosáhne žádných dalších výhod.
Sloučenin obecného vzorce I, s nimiž se pracuje při způsobu podle vynálezu, se při stanovení obvykle používá v množství 0,1 až 250 mmolů/1. Výhodná jsou množství v rozmezí 0,5 až 100 mmolů/1.
Nasycení substrátu «-amylázy maltoheptózou je v rozsahu koncentrací 8 až 10 mmolů. Účelně se proto používá minimální koncentrace 8 mmolů maltoheptózy, má-li se pracovat za podmínek nasycení substrátu, jak tomu zpravidla bývá.
Kromě toho se účelně přidává aktivační prostředek pro α-amylázu. Takovéto aktivační prostředky jsou známé. S výhodou se používá chloridu sodného nebo chloridu draselného.
Při dalším výhodném, provedení způsobu podle vynálezu se stanovení štěpných produktů provádí tak, že se nechají reagovat s maltózo-fosforylázou za vzniku glukózo-l-fosfátu, který se pak určí známým způsobem. Při obzvlášť výhodném provedení se stanovení glukózo-l-fosfátu provádí přeměnou v glukózo-6-fosfát pomocí ^-fosfo-glukózomutázy (β-PGluM), oxidací vzniklého glukózo-6-fosfátu pomocí NAD v přítomnosti glukózo-6-fosfátdehydrogenázy (G-6-PDH) za vzniku glukonát-6-fosfátu a NADH, přičemž vznik posledně jmenované sloučeniny lze snadno sledovat fotometricky. Měřený signál je možno ještě zesílit další oxidací pomocí NAD v přítomnosti 6-fosfoglukonátdehydrogenázy (6-PGDH) za vzniku ribulózo-5-fosfátu a další molekuly NADH.
Princip tohoto provedení je vyjádřen těmito rovnicemi:
a-amyláza maltoheptóza ψ Η?Ο-------> maltotrióza -h maltotetróza -> maltóza maltózofosforyláza maltóza + PO43'-----------> glukóza + β-glukózo-l-fosfát β-PGluM ’β-glukózoT-fosfát----> glukózo-6-fosfát
G-6-PDH glukózo-6-fosfát + NAD +----·» glukonát-6-fosfát -I- NADH + H +
6-PGDH glukonát-6-fosfát + NAD+-----> ribulózo-5-fosfát + NADH + II+ .
Výhodou tohoto provedení -způsobu podle vynálezu je, žo maltózofosforyláza je specifičtější než α-glukosidáza, a tudíž endogenní glukóza není na překážku.
Pokud jde -o pufry, platí obdobně poznámky uvedené při popisu provedení způsobu podle vynálezu za použití a-glukosidázy.
Kromě obou výše popsaných provedení způsobu podle vynálezu je možno vzniklé ' štěpné produkty maltoheptózy, tedy maltotetrózu, •maltotriózu - a z nich vzniklou maltózu stanovit i jinými známými metodami.
Jak již bylo· uvedeno, skýtá vynález nejen rychlý a specifický způsob ke stanovení a-amylázy, nýbrž zejména zcela nebo do značné míry se jím odstraní fáze lag, což má obzvláštní význam. při použití způsobu podle vynálezu na automatických analyzátorech. Kromě toho je možno· způsob podle vynálezu provádět v mnoha obměnách bez komplikované aparatury pro vyhodnocování; způsob je proto vhodný zejména pro rychlé diagnózy a k optickému stanovení ve viditelném, rozsahu. Zároveň je však možno- určovat různé formy provedení způsobu podle vynálezu i s měřicími přístroji v UV rozsahu. Dalšími výhodami jsou přísná úměrnost -a žádné rušení chemicky příbuznými látkami obsaženými v- krvi.
Substráty, používané podle vynálezu, jsou snadno a ve vysoké čistotě dostupné. Jednoduchý způsob výroby maltoheptózy je popsán ve zveřejněné německé patentové přihlášce DOS 27 41 191. Tento způsob je vhodný ke stanovení a-amylázy v biologických kapalinách, jako jsou sérum heparinové plasma, moč apod., nebo v jiných kapalných nebo tuhých látkách.
Vynález je blíže objasněn dále uvedenými příklady.
Příklad 1
Maltogenní metoda (a-glukosidová soustava]
Směs činidel, obsahující a-glukosidázu, glukózo-6-fesfátdehydrogenázu, hexokinázu, oxidovaný nikotinamidadenindinukleotid, adenosintťifosfát, maltoheptózu, - hořečnatý ion Mg+ + , chlorid sodný a fosfátový pufr, se rozpustí ve 2,0 ml destilované vody. Trvanlivost - činidla při teplotě místnosti je asi 1 hodinu, při teplotách pod 8 °C 6 hodin.
Vzniklý roztok se vyznačuje - těmito koncentracemi jednotlivých činidel:
fosfátový pufr
NaCl
Mg2+ maltoheptóza deenssiotrifosfát oxidovaný oikstinamidaeeoiodinukiestid hexokináza glukózo-6-fosfátenhydro..geoáza a-glukosidáza mmolů/1; pH 7 mmolů/1 mmoly/1 mmolů/1
1,2 mmolu/1 mmoly/1 š 2j/i x 2j/i š 10j/i
K roztoku se při teplotě 25 °C přidá 0,02 ml vzorku séra, směs se přenese do kyve-ty -o· tloušťce vrstvy 1 cm a pak se ve fotometru určuje extrnkce při Hg 365 nm, 340 nm nebo Hg 334 nm. Po 10 minutách se extinkce odečte a pak se odečet pětkrát opakuje v intervalech 1 minuty.
Z takto určených extrnkčinch rozdílů za minutu (ΔΕ/min) se vytvoří průměrná hodnota, odečte se slepá hodnota činidel a takto opravená hodnota se použije pro výpočet.
Výpočet se provádí takto:
j/1 25 cc = 4244 χ Δ E 365 nm/min = 2290- χ Δ E 340 nm/min = 2335 χ Δ E 334 nm/min.
Na obr. 1 připojeného výkresu jsou zachyceny výsledky při použití zřeďovací řady lidského séra fyziologickým roztokem soli, které byly získány touto metodou.
Rozdělí-li se činidlo ve dvě vsázky, z nichž jedna obsahuje mal·tohnptózu a druhá - obsahuje směs všech zbývajících reagencií, je možno trvanlivost s nimi vyrobených roztoků zvýšit. Činí pro směs magen-cií při teplotách do 8 cg 30 hodin, při teplotě místnosti přibližně 8 hodin. Trvanlivost roztoku maltoheptózy činí analogicky 6 týdnů, popřípadě přibližně 1 týden.
Příklad 2
Stanovení maltózofosforylázovou soustavou
Vyrobí se dvě činidla, sestávající z amylázového substrátu a maltózofosforylázové soustavy. Jedno činidlo - obsahuje maltoheptózový substrát, druhé činidlo obsahuje rozpustný škrob podle dosavadního stavu techniky. Koncentrace činidel po rozpuštění ve vodě je tato:
Podle vynálezu
Srovnávaná fosfátový .pufr oxidovaný nikotinamidadenindinukleotid maltoheptóza rozpustný škrob glukózo-l,6-difosfát maltózofosforyláza (mikroorg.) 0-fosfoglukomutáza (mikroorg.) glukózo-6-fosfátdehydrogenáza (Leuconcstoc mesent)
6-fosfoglukonátdehydrogcnáza (Leuconostoc mesent]
| 20 | mmolů; pH 6,5 | 20 | mmolů; pH 6,5 |
| 2 | mmoly | 2 | mmoly |
| 10 | mmolů | — | |
| — | 5 | mg/ml | |
| stopy | stopy | ||
| 3 | j/ml | 3 | j/ml |
| 1 | j/ml | 1 | j/ml |
| 9 | j/ml | 9 | j/ml |
| 1 | j/ml | 1 | j/ml |
Vzniklý roztok se inkubuje při teplotě 30 CC, načež se к němu přidá roztok vzorku a fotometrem se stanoví extinkční rozdíl při HCi 334 nm. Po lOmiontové předběžné inkubaci se extinkční rozdíl měří po dobu. 10 minut. Pro 2,0 ml reagencie a 0,10 ml vzorku plyne pak tento vztah:
Δ E/min x
2,1 x 1000
6,18 x 0,1 x 0,2
- Δ E/min x 1699 j/1
b) fenyl-α D-tri-(tetra)-glukopyranosid -|- a-glukosidáza
4- 3(4) НЮ---------> fenol +
4- 3(4] glukózy monolenoloxidáza
c) fenol -i- HSK -i- O?---------------->
-> barvivo 4- 2 H2O .
Při použití pěti různých lidských sér byly pomocí výše uvedených činidel nalezeny tyto hodnoty:
| Sérum | Podle vynálezu | škrob |
| 1 | 37,4 j/1 | 15.3 j/1 |
| 2 | 61,2 j/1 | 27,3 j/1 |
| 3 | 95,1 j/1 | 39.1 j/1 |
| 4 | 114 j/1 | 44,2 j/1 |
| 5 | 374 j/1 | 161 j/1 |
Příklad 3
Důkaz α-amylázy s fenyl-a-maltoheptosidem jakožto substrátem
Fenyl-a-maltoheptosid se rozštěpí a-amylázou na fenyl-a-maltotriid nebo fenyl-o·-maltotetraid, které se pomocí a-glukosidázy přemění ve fenol a glukózu. Uvolněný fenol se monofenoloxidázou oxidačně kopuluje s nukleefilním činidlem 3-metyl-6 sul· f onyl-benzthiazolonhydrazonem- (2) — ( HSK) za vzniku červeného barviva, jehož rychlost tvorby je úměrná amylázové aktivitě ve vzorku a může být fotometricky sledována.
Princip testu:
1.
a-amyláza
a] fenyl-cí-maltoheptosid IDO---------->
-> fenyl-a-D-tri-ftetraJ-glukopyranosid -h maltotetra-(tri)-óza
Podmínky při měření:
CC. délka měřené vlny 492 nm, 1 cm kyvety; složení činidla je uvedeno v následující tabulce.
TABULKA
Činidlo· Koncentrace při zkoušce
| fosfátový .pufr, pH 7,4 | 0,05 | molu/1 |
| chlorid sodný | 0,05 molo/1 | |
| fenyl-tf-D-maltoheptosid | 10 | mmolů/l |
| HSK | 1 | mrnol/l |
| monofenoloxidáza | 1 | j/ml |
| a-glukosidáza | 10 | j/ml |
| Objem při. testu: 2.0 ml. |
Místo fosfátového pufru jsou použitelné i jiné pufry, například glycinový, glycylglycinový, Hepes, tris, tra a jiné.
Příklad 4
Stanovení α-amylázy p-nitrofenylmaltoheptosidem
Princip testu:
a-amyláza p-nitrofenyl-a-maltoheptosid —------>
-> (glukóza )n 4- p-nitrofenyi-
3G α-glukosidáza
-α-( glukóza )m-------► n glukóza +
4- p-nitrofeno]
Po rozštěpení maltoheptosidu se štěpné produkty odbourají na glukózu a p-nitrofenol. p-nitrofenolátový anion je v alkalickém roztoku žlutě zbarven a lze jej tudíž měřením stanovit přímo opticky.
Testovací soustava
Reakční směs:
mmolů/1 fosfátového pufru, pH 7,4
5Ό mmolů/1 chloridu sodného až 50 j/ml crglukosidázy popř. 10 mmolů/1 p-nitrofenyl-a-maltoheptosidu.
Násada při testu:
ml reakční směsi 50 μΐ vzorku (sérum), teplota: 30 °C, vlnová délka: 405 nm, start přídavkem séra po dosažení měřicí teploty (předběžná inkubace 10 minut).
Testovací soustava:
Reakční násada
Na-(K-PO4-pufr 0,02 molu/1 + triton x 100 2 ml/100 ml 4- NaCl 10 mmolů/1, pH 6,9
MgC12 0,3 molu/1 maltoheptitol 100 mmolů/1
NAD c = 40 mg/ml
INT c = 0,6 mg/ml diaforáza (Clostr. Kluyveri) 5 mg/ml*) ATP c = 50 mg/ml hexokináza 280 j/ml*)
SDH 180 j/ml*) a-glukosidáza 1120 j/ml*) vzorek (sérum)
8
Příklad 5
Stanovení a-amylázy maltoheptitolem
Princip testu:
a-amyláza maltoheptitol + H2O------> maltotritol 4- maltotetróza a-glukosidáza maltotriitol 4- H2O------—->
-> sorbitol 4- maltóza
SDH sorbitol + NAD+---> fruktóza 4+ NADH + H + diaforáza
NADH 4- INT 4- H+---—> formazan 4+ NAD+.
SDH =-· sorbitoldehydrogenáza
| ml | Koncentrace při testu | |
| 1,92 | 12,8 | mmolu/1 POi |
| 6,4 | mmolu/1 | |
| 0,01 | 1,0 | mmol/l |
| 0,10 | 3,3 | mmolu/1 |
| 0,05 | 1,0 | mmol/l |
| iO,2Q | 0,09 | mmolu/1 |
| 0,05 | 167 | 171 |
| 0,10 | 3,29 | mmolu/1 |
| 0,05 | 4 666 | 171 |
| 0,30 | 18 000 | 171 |
| 0,20 | 74 670 | J/i |
| 0,02 |
*) v testovém pufru
Start přidáním vzorrku: měření se provádí při 492 nm; teplota: 2'5 CC.
Příklad 6
Stanovení α-amylázy kyselinou maltoheptaglukonovou
Princip testu:
kyselina maltoheptaglukonová 4a-amyláza
4- H2O ---—> kyselina maltotrioglukonová 4- maltotetróza kyselina maltotrioglukonová 4a-glukosidáza
4- H2O-------► kyselina glukonová 4- “l· maltóza kyselina glukonová 4glukonátkináza
4- ATP-------->
6-fosfát kyseliny
230758 glukonové + adenosindifosfát ribulózo-5-fosfát + NADPH +
6-fosfát kyseliny glukonové + + CO2 + H + dehydrogenáza kyseliny
6-fosfoglukonové + NADP'-------------Testovací soustava:
| Reakční násada | m1 | Koncentrace při testu |
| Na-/K-PO4-pufr 0,02 molu/1 | 2,19 | 14,6 mmolu/1 fosfátu, |
| + NaCl 10 mtadlů/l, pH 6,9 | 7,3 mmolu/1 NaCl | |
| MgCl2 1 mol/l | 0,01 | 3,3 mmolu/1 |
| kyselina maltoheptaglukonová 150 mmolů/ | 0,10 | 5 mmolů/1 |
| NADP c = 10 mg/riil | 0,10 | 0,38 mmolu/1 |
| ATP c = 50 mg/ml | 0,10 | 2,7 mmolu/1 |
| glukonátkináza 40 j/ml | 0,03 | 1066 j/1 |
| dehydrogenáza kyseliny 6-fosfoglukonové | ||
| 24 j/ml | 0,10 | 800 j/1 |
| a-glukosidáza 1120 j/ml | 0,30 | 11,2 x 104 j/1 |
| vzorek (sérum] | 0,02 | ' - |
Start přidáním vzorku; měření se provádí při 340 nm nebo 365 nm, teplota: 25 °C, objem při testu: 3,00 ml.
Claims (1)
Hide Dependent
translated from
Claims (1)
Hide Dependent
translated from
- PŘEDMĚT VYNALEZUZpůsob stanovení α-amylázy enzymatickým štěpením α-amylázového substrátu a měřením štěpného produktu, vyznačující se tím, že jakožto’ substrátu se použije slouče niny obecného vzorce I íl ) kde fenylglukozidovou nebo sorbitolovou skupíR znamená glukozidovou, fenylglukozido- nu nebo zbytek kyseliny glukonové.vou, mononitrofenylglukozidovou, dinitro1 list výkresůSeverografla, n. p., závod 7, MostCena 2,40 Kčs