NO154636B - Fremgangsmaate til fremstilling av krystallinske aminocyklitolderivater. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av aminocyklitolderivater. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen lar seg anvende som legemidler, spesielt i tera-

pi av diabetes, adipositas og hyperlipemi.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen har den gene-

relle formel I

hvori R betyr en eventuelt substituert alkyl- eller alkenylrest.

Fra DOS 2.726.207 er det kjent forbindelser med

formel II

De kan fås ved omsetning av tilsvarende acetobromforbindelser med de eventuelle alkoholer. Riktignok er denne fremgangs-

måte til fremstilling av forbindelsene II med n+m=0 forsåvidt ikke optimal, da syntesen i dette spesielle tilfelle er om-stendelig og gir forholdsvis små utbytter.

I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes nå forbindelser med den generelle formel I.

Herved skal skrivemåten H, OR bringe til uttrykk at begge mulige stereoisomere formler er omfattet. Forbindelsene er også krystallinske som anomerblanding. Oppfinnelsen ved- rører ved siden av fremstilling av anomerblandingen også fremstilling av de enkelte anomerer, idet de med a-form er foretrukket.

R betyr alkyl, spesielt rettlinjet eller forgrenet alkyl med 1 - 30 og spesielt 1 - 18, og helt spesielt foretrukket med 1-6 karbonatomer. Eksempelvis skal det nevnes metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, t-butyl, n-heksyl, n-oktyl, oktyl-(2), docecyl, lauryl, cetyl og steraryl, spesielt foretrukket er metyl, etyl og i-propyl.

Alkylrestene kan ha én eller flere, fortrinnsvis 1-5 like eller forskjellige substituenter.

Som substituenter skal det eksempelvis anføres: hydroksy, alkoksy med fortrinnsvis 1-4 karbonatomer, spesielt metoksy og etoksy, amino, monoalkylamino og dialkylamino med fortrinnsvis 1-4 karbonatomer pr. alkylrest, spesielt mono-metylamino, monoetylamino, dimetylamino og dietylamino, merkapto, alkyltio med fortrinnsvis 1-4 karbonatomer, spesielt metyltio og etyltio, halogen, fortrinnsvis fluor, klor og brom, alkylkarbonyl med fortrinnsvis 1-4 karbonatomer i alkylresten, karboksy, nitro, cyano, aldehydfunksjonen og sulfonsyregruppen. Eksempelvis skal det her nevnes -Cr^-Cr^-Cl.

R i betydningen av alkenyl betyr fortrinnsvis rettlinjet eller forgrenet alkenylrester med 2-6 karbonatomer og 1 - 3 dobbeltbindinger (f.eks. alkyl) som kan ha 1 5, resp. 1-2 substituenter som hydroksy, alkoksy med 1-4 karbonatomer, merkapto, alkyltio med 1-4 karbonatomer, halogen, nitro o.l.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til fremstilling av krystallinske forbindelser med ovennevnte generelle formel I erkarakterisert vedat forbindelse med den generelle formel

III

hvori og R2betyr like eller forskjellige mono- eller oligosakkaridrester, idet R2er bundet glykosidisk til restmolekylet og R2bundet vilkårlig over oksygen til restmolekylet, og idet forbindelsene med formel III også eventuelt kan foreligge i form av deres O-beskyttede derivater, omsettes i 0,5-12 timer med en alkohol ROH, idet R har den ovenfor angitte betydning, i nærvær av 0,5-4N protonsyrer HX, hvori X betyr resten av en sterk uorganisk ikke-oksyderende syre, etter omsetningen nøytraliseres reaksjonsblandingen med ^200^, filtreres, konsentreres ved nedsatt trykk til en viskøs masse som opptas i vann og kromatograferes over en sur ioneutveksler og elueres med ca. 1%-ig vandig ammoniakkoppløsning, det basiske eluat inndampes og kromatograferes over aluminiumoksyd med metanol/vann i forholdet 3:1, og de stoffholdige eluater konsentreres og forbindelsene omkrystalliseres fra metanol eller en oppløsningsmiddelblanding, og eventuelt isoleres o-

anomeren fra den dannede blanding ved fraksjonert krystallisering.

I formel III skal skrivemåte H, 0R2bringe til uttrykk at begge mulige stereoisomere forbindelser er omfattet.

De nevnte beskyttelsesgrupper er de i sukker-

kjemien vanlige, eksempelvis acetylgruppen.

Fremgangsmåten å spalte oligosakkaridet med vandig protonsyre er kjent. Anvender man imidlertid forbindelser med formel III i denne reaksjon, så kommer man ikke til forbindelsen I med R=H, men får det tricykliske oksazolidin

IV.

Med dette resultat måtte det sogar regnes, for omfangsrike arbeider av Paulsen og medarbeidere har vist i Angewandte Chemie, 78, s. 501-550, 1966, at under sure betingelser innter ved karbonhydrater med amino-og alkylaminogrupper i 4-stilling spesielt lett en konden-sasjon av denne nukleofile gruppering med aldehydfunksjon-

en under dannelse av piperidin og pyrrolidinsukkere. Denne ringdannelse og etterfølgende følgereaksjoner (eliminering, polymerisasjon, aromatisering) gjøres ansvarlig for en in-

tens spalting av stoffene og således finnes det i littera-turen tallrike eksempler på at ved forsøk til frigjøring av 4-aminosukkere ved sur hydrolyse av deres derivater, f.eks. glukosider, iakttas bare en dyptgripende spalting og delvis utskillelse av sorte polymere stoffer.

Etter disse litteraturfunn er det desto mere over-raskende at ved omsetningen ifølge oppfinnelsen er forbindelsene med formel I oppnåelige i gode utbytter i første rekke som anomerblanding som krystallinske stoffer.

Fremgangsmåten er da spesielt fordelaktig når det

for fremstilling av stoffene med formel I anvendes alkohol-

er ROH med 1-6 karbonatomer og som utgangsforbindelser velges stoffer med formel III hvori R^og R2er glukose eller av glukose oppbyggede oligosakkaridrester.

Spesielt gjennomføres fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som følger:

Forbindelsene med formel I (anomerblanding) fås

ved omsetning av utgangsforbindelsene III med alkoholen ROH

i nærvær av den uorganiske syre ved tem<p>eraturer på 6 0 -

130°C, fortrinnsvis 60 - 100°C, i minst en halv time, vanligvis 5-12 timer. Som uorganiske syrer anvendes ikke-oksyderende sterke syrer, f.eks. svovelsyre, fosforsyre, fortrinnsvis saltsyre.

Ved gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skal det spesielt iakttas følgende: Syrekonsentrasjonen skal vanligvis være 0,5 - 4N. Riktignok er konsentrasjonen i dette området ikke å velge vilkårlig, men i avhengighet av den anvendte alkoholen.

Herved må enhver gang i enkelttilfelle den optimale konsen- trasjon eventuelt fastslås ved noen forforsøk. Så meget kan imidlertid sies at i tilfelle metanol kan syrekonsentrasjonen bevege seg i det øvre området uten at det kommer til vesentlige spaltinger. Går man imidlertid over på etanol, så bør syrekonsentrasjonen ikke overskride 1 - 2N.

Også med hensyn til reaksjonstemperaturen er frem-gangsmåteoptimum å fastslå i avhengighet av alkoholen og syrestyrken.

Generelt fører for milde betingelser bare til en partiell spalting av de anvendte forbindelser III og under for drastiske betingelser kommer det til overveiende dannelse av stoff IV resp. til de nevnte spaltingsreaksjoner.

Etter avslutning av omsetningen nøytraliseres den dannede reaksjonsblanding med Na2C0.j, filtreres for atskillelse av faste bestanddeler og konsentreres ved nedsatt trykk. Den gjenblivende viskøse masse opptas i vann og Jcro-matograferes for atskillelse av ikke-basiske reaksjonspro-dukter over en sur ioneutveksler. Eluering av stoffer med formel I (anomerblanding) med ca. 1%-ig vandig ammoniakkopp-løsning.

For atskillelse av ennå gjenblivende basiske bestanddeler inndampes det basiske eluat og kromatograferes over aluminiumoksyd med metanol/vann 3:1 (v/v). De stoffholdige eluater konsentreres og de for biproduktene befridde forbindelser omkrystalliseres av metanol eller en oppløs-ningsmiddelblanding av metanol og isopropanol. Det dannede krystallisat danner et konglomerat av krystaller av a- og glykosider av forbindelsene I. Ved fraksjonert krystallisering og eventuelt selektiv beskyttelsesgruppekjemi kan det deretter fås de rene anomerer. Vanligvis er 3-derivatene mindre oppløselige i metanol enn a-derivatene og kan således fås rene ved omkrystallisering. For renfremstilling av a-derivatene lønner seg en opparbeiding under innføring av beskyttelsesgrupper.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er inhibitorer av glykosidhydrolaser og egner seg derfor til behandling av sykdommer hvor en inhibering av disse enzymer synes ønskelig.

Aktiviteten av stoffene med formel I ble bestemt in vitro

i sakkarase-inhibisjonsprøven.

Sakkarase- inhibisjonsprøve in vitro

Sakkarase-inhibisjonsprøven in vitro muliggjør bestemmelse av den enzyminhibitoriske aktivitet av et stoff ved sammenligning av aktiviteten av det solubiliserte intestinale disakkaridasekompleks i nærvær eller i fravær av (såkalt 100%-verdi) inhibitoren. Som substrat som bestemmer inhibisjonsprøvens spesifitet tjener derved en praktisk talt glukosefri sakkarose (glukose <100 ppm), enzymaktivitetsbe-stemmelsen baserer på en spektrofotometrisk bestemmelse av frigjort glukose ved hjelp av glukose-dehydrogenase og niko-tinamid-adenin-dinukleotid som kofaktor.

En sakkaraseinhibitorenhet (SIE) er definert som den inhibitoriske aktivitet som i en definert prøveblanding reduserer en på forhånd gitt sakkarolytisk aktivitet med én enhet (sakkaraseenhet = SE). Sakkaraseenheten er derved definert som den enzymaktivitet som under på forhånd gitte betingelser spalter 1 umol sakkarose pr. minutt og dermed fører til frigjøring av hver gang 1 ymol glukose som be-stemmes i prøven og fruktose som ikke omfattes i prøven.

Det intestinale disakkaridasekomplex utvinnes av svinetynntarm-mukosa ved tryptisk fordøyelse, utfelling av 66% etanol ved -20°C, opptak av presipitatet i 100 mM fos-fatbuffer, pH 7,0 og avsluttende dialyse mot samme buffer. 10 yl av en prøveoppløsning som er ansatt således at ekstinksjonen av prøveblandingen ligger minst 10%, imidlertid ikke mer enn 25% under den for 100%-verdien, blandes med 100 yl av en fortynning av det intestinale disakkaridasekompleks i 0,1-molar maleinatbuffer, pH 6,25 og forin-kuberes i 10 minutter ved 37°C. Fortynningen av disakkarida-sekomplekset er å innstille på en aktivitet på 0,1 SE/ml.

Deretter startes den sakkarolytiske reaksjon ved tilsetning av 100 yl av en 0,4-molar oppløsning av sakkarose ("Serva 35579") i 0,1-molar maleinatbuffer, pH 6,25 og etter en inkubasjonsvarighet på 2 minutter ved 37°C stoppes ved tilsetning av 1 ml glukose-dehydrogenasereagens (1 liten flaske glukose-dehydrogenase-mutarotaseblanding lyofilisert ("Merck 14053") og 331,7 mg 3-nikotinamid-adenin-dinukle-otid (fri syre, "Beohringer" Renhetsgrad I) oppløst i 250

ml 0,5-molar tris-buffer, pH 7,6). For påvisning av glukose inkuberes 30 minutter ved 37°C og endelig fotometreres ved 340 nm mot en reagensblindprøve (med enzym imidlertid uten sakkarose).

Beregningen av hemmeaktivitet av inkubitoren er vanskelig gjort ved at allerede små endringer i prøvesystem-et, eksempelvis en liten fra bestemmelse til bestemmelse varierende 100%-verdi er av en innvirkning på prøveresultat-et som det ikke kan ses bort fra. Man omgår disse vanske-ligheter idet man ved hver bestemmelse lar det gå med en standard og som standard tjener en sakkaraseinhibitor med formel<C>25H43°i8<N>(akarbose) som har en spesifikk hemmeaktivitet på 77.700 SIE/g og med anvendte mengder på 10 - 20 ng i prøven fører til en hemming av ovenfor spesifisert stør-relsesorden. Ved kjennskap til differansen av ekstink-sjonene ved 340 nm fra 100%-verdi og ved standardhemmet blanding lar det seg av ekstinksjonsdifferansen fra 100%-verdien og ved prøveoppløsningen blanding under hensyn-tagen til anvendt mengde av inhibitor på kjent måte beregne den spesifikke hemmeaktivitet uttrykt i sakkaraseinhibitor-enheter pr. gram (SIE/g).

Sakkaraseinhibitoraktivitet in vitro av forbindelser med den generelle formel I:

Oppfinnelsen skal forklares nærmere med noen eksempler hvor alle prosentangivelser vedrører vektprosent. Eksempel la (Stoff Ia)

100 g akarbose (stoff med formel II med n=0 og m=2) oppløses i 1000 ml absolutt metanol som inneholder 10% klorhydrogen, omrøres 4 timer ved en temperatur på 6 0°C.

Deretter nøytraliseres med fast natriumkarbonat og den dannede utfelling frafiltreres. Det dannede filtrat inndampes ved nedsatt trykk til en brun viskøs sirup. Denne oppløses i 500 ml vann og has på en søyle med 1000 ml ioneutveksler-harpiks ("Amerlite" IR 120H ). Deretter spyles å lenge med vann inntil det ikke mer elueres ikke-basiske deler (glukose etc). Deretter elueres stoff Ia med 1%-ig vandig ammoniakkoppløsning fra søylen. Det basiske eluat inndampes til sirup, opptas i 300 ml av en blanding av metanol og vann (3:1, v/v) og kromatograferes over en søyle med 100 0 g aluminiumoksyd (Woelm Neutral) (elueringsmiddel: metanol/ vann 3:1, v/v). De stoffholdige fraksjoner konsentreres og produktet Ia krystalliseres fra metanol/isopropanol (ca. 4:1 v/v).

Utbytte: 21 g Ia.

NMR-spektroskopisk karakterisering av forbindelse Ia (anomerblanding).

Ia ble undersøkt etter acetylering NMR-spektroskopisk. Derved kunne det uttas følgende kjemiske forskyvninger (i ppm) for protonene av aglykon R og aminosukkerdelen:

Målingene foregikk i CDCl^ved en frekvens på

250 MHz.

Eksempel 1 b

Fremstilling av rene a- og 6-anomerer av metylglykosider Ia.

Ved fraksjonert krystallisering fra metanol ble

det fra en blanding av metylglykosider (se eksempel la) at-skilt 6-anomerer såvidt inntil moderluten inneholdt ca. 80% av a-metylglykosidet.

Den etter inndamping av moderluten gjenblevne sirup (17 g) ble oppløst i 200 ml absolutt dimetylformamid og under isavkjøling blandet med 6 ml 48%-ig HBr-oppløsning. Deretter ble det ved værelsetemperatur tildryppet så lenge isopropylenmetyleter (ca. 100 ml over et tidsrom på 2 timer) inntil stoffet med en Rf-verdi p 0,5 (DC: kiselgel-ferdig-folie, Merck, elueringsmiddel toluen/etanol 3:1) var hoved-produktet .

For opparbeidelse ble blandingen nøytralisert med fast natriumkarbonat, filtrert og inndampet. Residuet ble opptatt i 200 ml kloroform, den organiske fase vasket to ganger med 100 ml vann, tørket over natriumsulfat og inndampet. Råutbytte 21 g.

Ved preparativ søylekromatografi over kiselgel 60 (Merck) med toluen/eddikester 2:1 (v/v) som elueringsmiddel ble det dannet 13 g av diisopropylidenforbindelsen V. En analytisk prøve ble acetylert til VI da V ikke krystalliserte.

For fremstilling av det frie a-metylglykosid ble forbindelsen V oppløst i 60%-ig vandig eddiksyre og omrørt 4 timer ved 60°C. Stoff I-a krystalliserte fra metanol.

Fysikalske data:

I-a Smeltepunkt 157°C [a]D° = + 185'l<0>

(c=0,8 H20)

1-8 Smeltepunkt 208°C ^- a^ ° = + 19'8°

(c=0,5 H20)

VI Smeltepunkt 160°C [a]D° = + 146'5°

(c=0,8 CHC13)

Eksempel 2 (Stoff Ib)

10 g akarbose oppløses i 400 ml absolutt etanol som inneholder 2,5% klorhydrogen og omrøres 8 timer ved 80°C. Opparbeidelsen foregikk anlogt eksempel la, omkrystallisering fra metanol.

Utbytte 0,7 g Ib.

Eksempel 3 (Stoff Ic)

100 g akarbose oppløses i 1000 ml absolutt klor-etanol som inneholder 1,5% klorhydrogen og omrøres 12 timer ved 60°C. Opparbeidelsen foregikk som i eksempel la, omkrystallisering fra metanol.

Utbytte 19 g Ic.

Eksempel 4 (Stoff Id)

10 g akarbose oppløses i 400 ml absolutt allylalko-hol som inneholder 2% klorhydrogen og omrøres 7 timer ved 90°C. Opparbeidelsen foregikk analogt eksempel la, omkry-

stalliseres fra metanol.

Utbytte 1,1 g Id.

NMR-spektroskopisk karakterisering av forbindelsene I b-d.

Glykosidene med den generelle formel I ble etter acetylering undersøkt NMR-spektroskopisk. Derved kunne det utledes følgende kjemiske forskyvninger (i ppm) for protonene av aglykon R og av aminosukkerdelen:

Målingene foregikk i CDCl^ved en frekvens på 250 MHz.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av krystallinske forbindelser med den generelle formel

hvori R betyr en eventuelt substituert alkyl- eller alkenylrest,karakterisert vedat forbindelser med den generelle formel III

hvori R^og R2betyr like eller forskjellige mono- eller oligosakkaridrester, idet R2er bundet glykosidisk til restmolekylet og R., bundet vilkårlig over oksygen til restmolekylet, og idet forbindelsene med formel III også eventuelt kan foreligge i form av deres O-beskyttede derivater, omsettes i 0,5-12 timer med en alkohol ROH, idet R har den ovenfor angitte betydning, i nærvær av 0,5-4N protonsyrer HX, hvori X betyr resten av en sterk uorganisk ikke-oksyderende syre, etter omsetningen nøytraliseres reaksjonsblandingen med Na2C03, filtreres, konsentreres ved nedsatt trykk til en viskøs masse som opptas i vann og kromatograferes over sur ioneutveksler og elueres med ca. 1%-ig vandig ammoniakk-oppløsning, det basiske eluat inndampes og kromatograferes over aluminiumoksyd med metanol/vann i forholdet 3:1, og de stoffholdige eluater konsentreres og forbindelsene omkrystalliseres fra metanol eller en oppløsningsmiddelblanding, og eventuelt isoleres a-anomeren fra den dannede blanding ved fraksjonert krystallisering.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat omsetningen gjennomføres ved en temperatur på 60-130°C.