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Aminocyclitderivate, ihre Herstellung und sie ent-
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haltende Arzneimittel Die vorliegende Erfindung betrifft Aminocyclitderivate
und ein Verfahren zu ihrer Hersteliung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen
sich als Arzneimittel verwenden, insbesondere in der Therapie von Diabetes, Adipositas
und Hyperlipämie.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben die allgemeine Formel I
-Formi worin R einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Alkenylrest bedeutet.
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Aus der DE-OS 2 726 207 sind Verbindungen der Formel II
bekannt. Sie können erhalten werden durch Umsetzung der entsprechenden Acetobromverbindungen
mit den jeweiligen Alkoholen. Allerdings ist dieses Verfahren zur Darstellung von
Verbindungen II mit n+m=0 insofern noch nicht optimal, als die Synthese in diesem
speziellen Fall aufwendig ist und vergleichsweise geringe Ausbeuten ergibt.
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In der deutschen Patentanmeldung P 31 17 7o5.0 sind ferner Anomerengemische
beschrieben, die neben den erfindungsgemäßen Verbindungen solche der entsprechenden
B-Form enthalten.
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Die vorliegende Erfindung stellt nun Verbindungen der allgemeinen
Formel I ind der &-Form bereit.
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Erfindungsgemäß steht R in der Bedeutung von Alkyl, bevorzugt für
geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 30, insbesondere 1 bis 18 und ganz
besonders bevorzugt mit 1-6 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft seien Methyl, Ethyl,
n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, t-Butyl, n-Hexyl, n-Octyl, Octyl-(2), Docedyl, Lauryl,
Cetyl und Stearyl genannt.
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Die Alkylreste können einen oder mehreren, vorzugsweise 1 bis 5, gleiche
oder verschiedene Substituenten tragen.
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Als Substituenten seien beispielhaft aufgeführt: Hydroxy, Alkoxy mit
vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methoxy und Ethoxy; Amino,
Monoalkylamino und Dialkylamino mit vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen je Alkylrest,
insbesondere Monomethylamino, Monoethylamino, Dimethylamino und Diethylamino; Mercapto,
Alkylthio mit vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methylthio und
Ethylthio; Halogen, vorzugsweise Fluor, Chlor und Brom; Alkylcarbonyl mit vorzugsweise
1 bis 4 Kohlenstoffatomen im Alkylrest; Carboxy, Nitro, Cyan, die Aldehydfunktion
und die Sulfonsäuregruppe.
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R in der Bedeutung von Alkenyl steht bevorzugt für geradkettige oder
verzweigte Alkenylreste mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 1-3 Doppelbindungen, die
1-5, bzw. 1-2 Substituenten wie Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlen.-stoffatomen,
Mercapto, Alkylthio mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Nitro u.a. tragen können.
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Es wurde gefunden, daß man die erfindungsgemäßen Verbindungen der
Formel I erhält, wenn Substanzen der Formel III
worin R1 und R2 für gleiche oder verschiedene Mono- oder Oligosaccharidreste
stehen, die als R1 glykosidisch und als R2 beliebig über Sauerstoff an das Restmolekül
gebunden sind und wobei die Verbindungen der Formel III gegebenenfalls auch in Form
ihrer 0-geschützten Derivate, vorliegen können, mit einem Alkohol ROH in Gegenwart
von Protonensäuren HX umgesetzt werden, worin R die oben genannte Bedeutung hat
und X den Rest einer starken anorganischen Säure darstellt und die Verbindungen
der α -Form aus dem an fallenden Gemisch isoliert.
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In der Formel III soll die Schreibweise H, OR2 zum Ausdruck bringen,
daß beide möglichen stereoisomeren Verbindungen umfaßt sind.
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Die erwähnten Schutzgruppen sind die in der Zuckerchemie üblichen,
beispielsweise die Acetylgruppe.
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Das Verfahren, Oligosaccharide durch wäßrige Protonensäuren zu spalten,
ist bekannt. Setzt man jedoch Verbindungen der Formel III in diese Reaktion ein,
so gelangt man nicht zu der Verbindung I im Gemisch mit ihren Anomeren mit R=H,
sondern erhält das tricyclische Oxazolidin IV.
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Mit diesem Ergebnis mußte sogar gerechnet werden, denn umfangreiche
Arbeiten von Paulsen und Mitarbeitern haben gezeigt, daß unter sauren Bedingungen
bei Kohlenhydraten mit Amino- und Alkylaminogruppen in 4-Stellung besonders leicht
eine Kondensation dieser nucleophilen Gruppierung mit der Aldehydfunktion unter
Bildung von Piperidin und Pyrrolidin-Zuckern eintritt. Diese Ringbildung und die
sich anschließenden Folgereaktionen (Eliminierung, Polymerisation, Aromatisierung)
werden für eine intensive Zersetzung der Substanzen verantwortlich gemacht und so
gibt es in der Literatur zahlreiche Beispiele dafür, daß beim Versuch der Freisetzung
von 4-Aminozuckern durch saure Hydrolyse ihrer Derivate, z.B. Glykosiden, nur eine
tiefgreifende Zersetzung und teilweise Abscheidung schwarzer polymerer Substanzen
beobachtet wird.
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Nach diesen Literaturbefunden ist es um so überraschender, daß bei
der erfindungsgemäßen Umsetzung die Verbindungen der Formel I zunächst als Gemisch
mit ihren Anomeren in guten Ausbeuten als kristalline Substanzen erhältlich sind.
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Das Verfahren ist dann besonders vorteilhaft, wenn zur Darstellung
von Substanzen der Formel I im Gemisch mit ihren Anomeren Alkohole ROH mit 1 bis
6 Kohlenstoffatomen einsetzt und als Ausgangsverbindungen Substanzen der Formel
III wählt, in der R1 und R2 Glucose oder aus Glucose aufgebaute Oligosaccharidreste
sind.
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Im speziellen wird das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt durchgeführt:
Die
Verbindungen der Formel I im Gemisch mit ihren Anomeren werden durch Umsetzung der
Ausgangsverbindungen III mit dem Alkohol ROH, in Anwesenheit der anorganischen Säure,
bei Temperaturen von 60 bis 1300C vorzugsweise 60-1000C während mindestens 0,5 Stunden,
im allgemeinen 0,5 bis 12 Stunden, erhalten. Als anorganische Säuren werden nicht
oxidierende starke Säuren, z.B. Schwefelsäure, Phosphorsäure, vorzugsweise Chlorwasserstoffsäure
eingesetzt.
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Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollte besonders folgendes
beachtet werden: Die Säurekonzentration soll im allgemeinen 0,5 bis 4 normal sein.
Allerdings ist die Konzentration in diesem Bereich nicht beliebig, sondern in Abhängigkeit
vom verwendeten Alkohol zu wählen. Hierbei muß die jeweils im Einzelfall zu wählende
optimale Konzentration gegebenenfalls durch einige Vorversuche ermittelt werden.
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Soviel aber kann gesagt werden, daß im Falle von Methanol die Säurekonzentration
im oberen Bereich bewegen kann, ohne, daß es zu wesentlichen Zersetzungen kommt.
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Geht man jedoch auf Ethanol über, so sollte die Säurekonzentration
1-2 N nicht überschreiten Auch hinsichtlich der Reaktionstemperatur ist das Verfahrensoptimum
in Abhängigkeit von dem Alkohol und der Säurestärke zu ermitteln.
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Allgemein führen zu milde Bedingungen nur zu einer partiellen Spaltung
der eingesetzten Verbindungen III
und unter zu drastischen Bedingungen
kommt es zur überwiegenden Bildung der Substanz IV bzw. zu den erwähnten Zersetzungsreaktionen.
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Nach Beendigung der Umsetzung wird die erhaltene Reaktionsmischung
mit Na2CO3 neutralisiert, zur Abtrennung fester Bestandteile filtriert und bei vermindertem
Druck konzentriert. Die verbleibende, viskose Masse wird in Wasser aufgenommen und
zur Abtrennung nichtbasischer Reaktionsprodukte über einen sauren Ionenaustauscher
chromatographiert. Die Eluation der Substanzen der Formel I im Gemisch mit ihren
Anomeren erfolgt mit etwa 1 %iger wäßriger Ammoniaklösung.
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Zur Abtrennung noch verbliebener basischer Bestandteile wird das basische
Eluat eingeengt und über Aluminiumoxid mit Methanol/Wasser 3:1 (V/V) chromatographiert.
Die substanzhaligen Eluate werden konzentriert und die von den Nebenprodukten befreiten
Verbindungen aus Methanol oder einer Lösungsmittelmischung aus Methanol und Isopropanol
umkristallisiert. Das erhaltene Kristallisat bildet ein Konglomerat aus Kristallen
der entsprechenden OC- und B-Glykoside. Durch fraktionierte Kristallisation und
gegebenenfalls selektive Schutzgruppenchemie können dann die reinen Anomere erhalten
werden. Im allgemeinen sind die Derivate in Methanol weniger löslich, als die dC-Derivate
und können so durch Umkristallisieren rein erhalten werden. Zur Reindarstellung
der oC-Derivate empfiehlt sich eine Aufarbeitung unter Einführung von Schutzgruppen.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Inhibitoren von Glykosidhydrolasen
und eignen sich daher zur Behandlung von Krankheiten, bei denen eine Inhibition
dieser Enzyme wünschenswert erscheint. Die Aktivität der Substanzen der Formel I
wurde im Saccharase-Inhibitonstest in vitro bestimmt.
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Saccharase-Inhibitionstest in vitro Der Saccharase-Inhibitionstest
in vitro ermöglicht die Bestimmung der enzyminhibitorischen Aktivität einer Substanz
durch den Vergleich der Aktivität des solubilisierten intestinalen Disaccharidasen-Komplexes
in Gegenwart bzw.
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in Abwesenheit (sog. 100 %-Wert) des Inhibitors. Als Substrat, welches
die Spezifität des Inhibitionstestes bestimmt, dient dabei eine praktisch Glucose-freie
Saccharose (Glucose 4100 ppm); die Enzymaktivitätsbestimmunq basiert auf der spektrophotometrischen
Bestimmung freigesetzter Glucose mittels Glucose-Dehydrogenase und Nicotinamid-adenin-dinucleotid
als Cofaktor.
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Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als dienenige
inhibitorische Aktivität, welche in einem definierten Testansatz eine vorgegebene
saccharolytische Aktivität um eine Einheit (Saccharase-Einheit = SEI reduziert;
die Saccharase-Einheit ist dabei als diejenige Enzymaktivität definiert, welche
untervorgegebenen Bedingungen ein Amol Saccarose pro min spaltet und damit zur Freisetzung
von je ein mol Glucose, welche im Test bestimmt wird, und Fructose, welche im Test
nicht erfaßt wird, fffhrt.
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Der intestinale Disaccharidasen-Komplex wird aus SchweinedUnndarm-Mucosa
durch tryptische Verdauung, Fällung aus 66 % Ethanol bei -200C, Aufnehmen des Präcipitates
in 100 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0 und abschließende Dialyse gegen denselben Puffer
gewonnen.
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10 Fl einer Probelösung, die so angesetzt ist, daß die Extinktion
des Testansates mindestens 10 %, jedoch nicht mehr als 25 % unter der des 100 %-Wertes
liegt, werden mit 100 ßl einer Verdünnung des intestinalen Disaccharidasen-Komplexes
in 0,1 M Maleinat-Puffer, pH 6,25, versetzt und für 10 min bei 370C vorinkubiert.
Die Verdünnung des Disaccharidasen-Komplexes ist auf eine Aktivität von 0,1 SE/ml
einzustellen.
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Anschließend wird die saccharolytische Reaktion durch Zugabe von 100
Al einer 0,4 M Lösung von Saccharose ("SERVA 35579") in 0,1 M Maleinat-Puffer, pH
6,25 gestartet und nach einer Inkubationsdauer von 20 min bei 370C durch die Zugabe
von 1 ml Glucose-Dehydrogenase-Reagenz (1 Fläschen Glucose-Dehydrogenase-Mutarotase-Gemisch
lyophiliert ("MERCK 14053") und 331,7 mg B-Nicotinamid-adenin-dinucleotid (freie
Säure, "BOEHRINGER" Reinheitsgrad I) in 250 ml 0,5 M Tris-Puffer, pH 7,6 gelöst)
abgestoppt. Zum Nachweis der Glucose wird 30 min bei 370C inkubiert und schließlich
bei 340 nm gegen einen Reagenzienblank (mit Enzym, jedoch ohne Saccharose) photometriert.
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Die Berechnung der Hemmaktivität von Inkubitoren ist dadurch erschwert,
daß schon geringfügige Anderungen im
Testsystem, beispielsweise
ein geringfügig-von Bestimmung zu Bestimmung variierender 100 %-Wert, von nicht
mehr zu vernachlässigendem Einfluß auf das Testergebnis sind. Man umgeht diese Schwierigkeiten,
indem man bei jeder Bestimmung einen Standard mitlaufen läßt; als Standard dient
ein Saccharase-Inhibitor der Formel C25H43018N (Acarbose>, welcher eine spezifische
Hemmaktivität von 77 700 SIE/g aufweist und bei eingesetzten Mengen von 10 bis 20
ng im Test zu einer Hemmung von oben spezifizierter Größenordnung führt. Bei Kenntnis
der Differenz der Extinktionen bei 340 nm von 100 %-Wert und durch Standard gehemmten
Ansatz läßt sich aus der Extinktionsdifferenz von 100 %-Wert und durch die Probelösung
gehemmten Ansatz unter Berücksichtigung der eingesetzten Menge an Inhibitor in bekannter
Weise dessen spezifische Hemmaktivität errechnen, ausgedrückt in Saccharase-Inhibitor-Einheiten
pro Gramm ((SIE/g).
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Saccharase-inhibitorische Aktivität in vitro von Ver bindungen der
allgemeinen Formel I.
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SIE/g Vergleich: Substanz der Formel II mit n=0 und m=2 (Acarbose)
77 700-
| I-α# |
| (R:CH3; gemäß Bsp 2) 365. 200 |
| I-ß# ~ 3 000 |
Die folgenden Beispiel erläutern die Erfindung. In den Beispielen handelt es sich
bei allen Prozentangaben um Gewichtsprozente.
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Beispiel 1 (Substanz als Anomerengemisch) 100 g Acarbose (Substanz
der Formel II mit n=O und m=2) werden in 1000 ml abs. Methanol, der 10 % Chlorwasserstoff
enthält, gelöst und 4 Stunden bei einer Temperatur von 600C gerührt. Danach wird
mit festem Natriumcarbonat neutralisiert und der gebildete Niederschlag abfiltriert.
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Das erhaltene Filtrat wird bei vermindertem Druck zu einem braunen,
viskosen Sirup eingeengt. Dieser wird in 500 ml Wasser gelöst und auf eine Säule
mit 1000 ml Ionenaustauscherharz (Amberlite IR 120H ) gegeben. Anschließend wird
solange mit Wasser gespült, bis keine nichtbasischen Anteile (Glucose etc.) mehr
eluier werden. Danach wird die Substanz I mit 1 %iger wäßriger Ammoniaklösung von
der Säule eluiert. Das basische Eluat wird zum Sirup eingeengt, in 300 ml eines
Gemisches aus Methanol und Wasser (3:kr V/V) aufgenommen und über eine Säule mit
1000 g Aluminiumoxid (Woelm Neutral) chromatographiert (Laufmittel: Methanol/Wasser
3:1; V/V). Die substanzhaltigen Fraktionen werden konzentriert und das Produkt I
aus Methanol/Isopropanol (Z 4:1 V/V) kristallisiert.
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Ausbeute: 21 g 1 NMR-spektroskopische Charakterisierung der Verbindung
I (Anomerengemisch).
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I wurde nach Acetylierung NMR-spektroskopisch untersucht.
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Dabei konnten folgende chemische Verschiebungen (in ppm) für die Protonen
des Aglykons R und des Aminozuckerteils entnommen werden:
Substanz Signal o5-OR ß-OR I ac 1-H 4.80 4.31 3-H 5.26 4-H 2.44 2.49 R:CH3 5-H 3.61
3.27 6-CH3 1.31 R (CH3) 3.48 3.37 Die Messungen erfolgten in CDCl3 bei einer Frequenz
von 250 MHz.
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Beispiel 2 (Substenzen I-α , I-ß, V, VI) Darstellung der reinen
oC- und B-Anomeren des Methylglykosides I.
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Durch fraktionielle Kristallisation aus Methanol wurde aus einem Gemisch
der Methylglykoside (siehe Beispiel 1) das ß-Anomere soweit abgetrennt, bis die
Mutterlauge etwa 80 % des α-Methylglykosides enthielt.
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Der nach Einengen der Mutterlauge verbleibende Sirup (17 g) wurde
in 200 ml abs. Dimethylformamid gelöst und unter Eiskühlung mit 6 ml 48 titer HBr-Lösung
versetzt. Danach wurde bei Raumtemperatur solange Isopropenylmethylether zugetropft
(ca. 100 ml über einen Zeitraum von 2 Stunden), bis die Substanz mit einem Rf-Wert
von 0.5 (DC: Kieselgel-Fertigfolier Merck, Lufmittel Toluol/Ethanol 3:1) Hauptprodukt
war.
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Zur Aufarbeitung wurde der Ansatz mit festem Natriumcarbonat neutralisiert,
filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde in 200 ml Chloroform aufgenommen, die
organische Phase zweimal mit 100 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet
und eingeengt. Rohausbeute 21 g.
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Durch präparative Säulenchromatographie uber Kieselgel 60.
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(Merck) mit Toluol/Essigester 2:1 (V/V) als Laufmittel wurden 13 g
der Di-Isopropyliden-Verbindung V erhalten.
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Eine analytische Probe wurde zu VI acetyliert, da V nicht kristallisierte.
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Zur Darstellung des freien aC-Methylglykosides wurde die Verbindung
V in 60 %iger wäßriger Essigsäure gelöst und 4 Stunden bei 600C gerührt. Die Substanz
I-4 kristallisierte aus Methanol.
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R= -COCH3 Physikalische Daten: I-α Fp 157°C [α]D20 = +
185.1° (c=0.8 H2O) 1-ß Fp 208°C [α]D20 = + 19.8° (c=0.5 H2O) VI Fp 160°C [α]D20
= + 146.5° (c=0.8 CHCl3)