DE1492130C - Verfahren zur Herstellung von Saponin-Tetraglycosiden aus Blättern von Digitalis-Pflanzen - Google Patents

Description

der Tiere, z. B. Schneckenenzym oder Pankreatin, oder aus Mikroben erhalten werden. Die Glucosidase braucht nicht rein zu sein.

Die Behandlung kann so erfolgen, daß man das Ausgangsmaterial mit der Glucosidase, in Mengen von etwa 0,1: 10 in bezug auf das Ausgangsmaterial, in einem geeigneten Medium, wie Wasser oder einem wäßrigen enzymatisch geeigneten organischen Lösungs

ein spezifisches Ausfällungsmittel für 3-/?-Oxysteroide, io zen, z. B. Emulsin, Cellulase, Hemicellulase, Amylase, insbesondere für Cholesterin, verwendet. Bekanntlich Diastase oder Malzextrakt, aus den Verdauungsorganen ist das im Handel erhältliche Digitonin nicht rein und
enthält mehrere Arten von Saponinen. Beim Chromatographieren des im Handel erhältlichen Digitonins
über Tonerde werden zwei Komponenten abgetrennt, 15
von welchen die eine leicht eluiert wird und Tetraglycoside, wie Desglucodigitonin oder Gitonin, enthält,
während die andere nur schwer eluiert wird und aus
Pentaglycosiden, wie Digitonin oder Digalonin, und

aus höheren Oligoglycosiden besteht. Bei der Unter- 20 mittel, wie Äthanol oder Aceton, bei für das verwensuchung der obengenannten zwei Komponenten wurde dete Enzym optimaler Temperatur, im allgemeinen bei

etwa 20 bis 40° C, stehenläßt. Die gewünschte Hydrolyse wird gewöhnlich innerhalb von etwa 20 bis 200 Stunden erreicht.

Die erfindungsgemäß erhaltene Tetraglycosidfraktion enthält mehrere Arten von Tetraglycosiden, hauptsächlich Desgalactotigonin und F-Gitonin. Falls notwendig, kann jedes der Tetraglycoside mit Hilfe eines üblichen Trennverfahrens, wie Chromatographie oder

Blättern der Digitalis-Pflanzen erhaltenen, im weiteren 30 Umkristallisieren, isoliert werden. Die Tetraglycosidals Blattsaponine bezeichneten Saponine werden über fraktion und jedes der Tetraglycoside sind als spezi-Tonerde chromatographiert und ergeben die Tetra- fische Ausfällungsmittel für 3-/?-Oxysteroide, insbeglycosidfraktion, die hauptsächlich aus Desgalactotigo- sondere für Cholesterin, 3mal empfindlicher als das im nin [Fp. = 284 bis 286° C (Zersetzung)] und F-Gitonin Handel erhältliche Digitonin. Darüber hinaus ist [Fp. = 252 bis 255° C (Zersetzung)] besteht. Das 35 bemerkenswert, daß die Verwendung des im Handel genannte Desgalactotigonin und F-Gitonin werden erhältlichen Digitonins in der Spektrophotometrie von

Cholesterin, mit Hilfe einer üblichen Methode, wie z. B. der Zak-Henlyschen Bestimmungsmethode, zu unvermeidlichen Fehlern führt, die durch ihre eigene Färbung in der Absorptionsnachbarschaft von 570 πιμ verursacht wird. Dagegen ermöglicht die Verwendung der Tetraglycosidkomponente, bei der keine solche Färbung vorhanden ist, einen korrekten Meßvorgang. Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die

festgestellt, daß die Wirksamkeit der Tetraglycosidkomponente etwa das 3fache jener der Pentaglycosidkomponente, bei der Ausfällungsreaktion von Cholesterin, beträgt.

Die weiteren Untersuchungen ergaben, daß eine solche Tetraglycosidkomponente, im weiteren als Tetraglycosidfraktion benannt, gleichfalls in Blättern von Digitalis-Pflanzen anwesend ist. Die aus den

durch die folgende Formel veranschaulicht:

Glucose-(1 -> 2)-Glucose-(l -> 4)-Galactose-(l Aglycon Xylose-(1 ->■ 3)

worin, im Falle von Desgalactotigonin, Aglycon das Tigogenin und, im Falle von F-Gitonin, Aglycon das Gitogenin ist. Aus den Blattsaponinen wird aber nur eine kleine Menge der Tetraglycosidfraktion abgetrennt.

Demnach ist die Erzeugung der Tetraglycosidfraktion 45 nachstehenden Beispiele erläutert.

durch Reinigung der Blattsaponine technisch nicht günstig.

Es wurde nun gefunden, daß die Pentaglycosidkomponente, die eine kleine Menge an höheren Oligoglycosiden, im weiteren als Pentaglycosidfraktion 50
benannt, enthält, nach Abtrennung von den Blattsaponinen mit einer Glucosidase behandelt werden
kann, wobei eine Hydrolyse stattfindet, die die Tetraglycosidfraktion ergibt. Es soll hervorgehoben werden,
daß die so erhaltene Tetraglycosidfraktion von der 55 teilen 50%igem wäßrigem Methanol bei 30° C extra-Glucosidase nicht weiter hydrolysiert wird. Somit ist hiert. Zum Extrakt wird eine Lösung von einem die Hydrolysewirksamkeit der Glucosidase spezifisch basischen Bleiacetat in Wasser zugesetzt und der für die Pentaglycosidfraktion. Niederschlag abfiltriert. Danach wird Schwefelwasser-

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur stoff durch das Filtrat geleitet und der sich bildende Herstellung von Saponin-Tetraglycosiden aus Blättern 60 Niederschlag filtriert. Das Filtrat wird neutralisiert von Digitalis-Pflanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, und unter vermindertem Druck auf etwa ein Drittel daß man eine Saponinfraktion aus Digitalisblättern seines Volumens eingeengt. Die separierte Substanz oder die aus dieser durch Chromatographie abgetrennte wird dann durch Abnutschen entfernt. Das Filtrat Pentaglycosidfraktion mit einem hauptsächlich eine wird mit Äther und dann mit Chloroform geschüttelt. Glucosidase enthaltenden Enzympräparat behandelt 65 Die wäßrige Schicht wird mit Wasser gesättigtem

Beispiel 1 a) Herstellung des Ausgangsmaterials

Nach Ernten der Blätter von Digitalis purpurea werden dieselben so schnell wie möglich durch Blasen von Luft bei 6O⁰C getrocknet. Ein Gewichtsteil dieser getrockneten Blätter wird 2mal mit 1500 Gewichts-

und gegebenenfalls das erhaltene Gemisch der Tetraglycoside, zweckmäßig durch Umkristallisieren oder Chromatographie, trennt.

Butanol geschüttelt. Dann wird die Butanolschicht unter vermindertem Druck abgedampft, und man erhält eine amorphe Substanz.

3 4

50 g der amorphen Substanz wird in 700 ml Metha- aus einem Gemisch von Chloroform und Methanol gelöst und mit 10 g aktiver Holzkohle vermenge. nol [«]?? = —64,0° (c = 0,50 in Pyridin); Molekular-Das so erhaltene Gemisch wird während 30 Minuten formel: C₅₀H₈₂O₂₂ · 2 H₂O. Identifizierung: Nach Beunter Rückfluß erhitzt und dann filtriert. Das Filtrat handlung mit einem Gemisch von ln-Chlorwasserwird unter vermindertem Druck eingeengt und liefert 5 stoff säure und Dioxan 3 :1 während 3 Stunden ergeben 48 g eines hygroskopischen, braunen Pulvers. sich vier Substanzen, weiche als Tigogenin, D-Glucose,

45 g des braunen Pulvers werden mit 200 ml Chloro- D-Galactose und D-Xylose im Molekularverhältnis

form gewaschen und in 500 ml 90%'gem wäßrigem von 1:2:1:1 identifiziert wurden. '

Äthanol gelöst. Zur erhaltenen Lösung wird dann eine F-Gitonin: Farblose Nadeln mit F. = 252 bis 255°C

Lösung, bestehend aus 10 g Cholesterin in 150 ml io (Zersetzung) nach Kristallisieren aus mit Wasser

99%igem wäßrigem Äthanol, zugefügt. Das erhaltene gesättigtem Butanol; [*]" = — 58,5° (c — 0,53 in

Gemisch wird auf einem Wasserbad eine Weile erhitzt Pyridin); Molekularformel: C₅₀H₈₂O₂₃ · 2 H₂O. Iden-

und dann in einem Kühlschrank über Nacht stehen, tifizierung: Nach Erhitzen mit einem Gemisch von ■

gelassen. Das abgeschiedene Cholesterid wird abfil- ln-Chlorwasserstoffsäure und Dioxan 3: 1 während

triert, mit Äthanol und dann mit Äther gewaschen und 15 3 Stunden erhält man Substanzen, welche alsGitogenin,

getrocknet. 23 g des so getrockneten Cholesterids wird D-Glucose, D-Gelactose und D-Xylose im Molekular-

in wasserfreiem Pyridin gelöst und Äther zu der Lösung verhältnis von 1:2:1:1 identifiziert wurden, gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther

gewaschen und getrocknet. Man erhält 16g rohes Beispiel 2

Blattsaponin. 20 .

15 g des rohen Blattsaponins werden mit einem 10 g des wie vorstehend erhaltenen reinen Blatt-Gemisch von Chloroform und Methanol im Verhältnis saponine werden in 3000 ml 20%igem wäßrigem von 1:1 in der Hitze extrahiert. Der Extrakt wird Äthanol gelöst. Zur erhaltenen Lösung werden 20 g unter vermindertem Druck eingeengt, der Rückstand Hemicellulase, 3 ml Eisessig und 2 ml Toluol zugefügt anschließend in Methanol gelöst und mit aktiver 25 und das so erhaltene Gemisch bei 30° C 8 Tage stehen-Holzkohle behandelt. Nach Abfiltrieren der aktiven gelassen. Nach Zugabe von 1000 ml Wasser wird der Holzkohle wird das Filtrat unter vermindertem Druck Niederschlag durch Filtrieren gesammelt und aus einem zur Trockne eingeengt, wobei 12,5 g des reinen Blatt- Gemisch von Chloroform und Methanol kristallisiert, saponins, in Form eines Pulvers, erhalten werden. wobei man 5,3 g der Tetraglycosidkomponente in

1 Gewichtsteil des wie vorstehend erhaltenen reinen 30 Form eines mikrokristallinen Pulvers erhält. Aus dem Blattsaponins wird in einem Gemisch von Chloroform oben erhaltenen Filtrat werden 2 g der Tetraglycosid- und Methanol im Verhältnis 1:1 gelöst und durch fraktion, durch Extraktion mit Butanol noch dazu eine Säule mit 100 Volumteilen Tonerde durchsetzt. gewonnen. Diese Tetraglycosidfraktionen werden ver-Die Säule wird dann nacheinander mit Chloroform — einigt und aus 70%igem wäßrigem Äthanol und dann Methanol 1: 1, Methanol und mit Wasser gesättigtem 35 aus mit Wasser gesättigtem Butanol umkristallisiert, Butanol behandelt. Die hauptsächlich Tetraglycoside und man erhält 6,2 g farbloser Nadeln mit F. = 246 enthaltenden Fraktionen, welche leicht eluiert werden, bis 252° C (Zersetzung). Die Nadeln bestehen aus werden vereinigt, und nach Abdampfen des Lösungs- 6% Desgalactotigonin und 94% F-Gitonin. Nach mittels ergibt sich die Tetraglycosidfraktion. Die 8maligem Umkristallisieren der Nadeln aus mit Wasser Fraktionen, die hauptsächlich Pentaglycoside und 40 gesättigtem Butanol gelangt man zu reinen Kristallen höhere Oligoglycoside enthalten und welche schwer von F-Gitonin.

eluiert werden, werden vereinigt, und nach Abdampfen B e i s D i e 1 3

des Lösungsmittels erhält man die Pentaglycosidfrak-

tion. .2g des wie vorstehend nach Beispiel 1, a) erhaltenen

b) Herstellung der Tetraglycosidfraktion « »braunen Pulvers« werden in 100 bis 200 ml Wasser

. ⁶ gelöst. Zur erhaltenen Losung gibt man 0,5 bis 2,0 g

2 g der wie vorstehend erhaltenen Pentaglycosid- Amylase zu und läßt das Gemisch bei 37 ± 2° C fraktion werden in 500 ml 20%igem wäßrigem Äthanol 4 Tage stehen. Der gebildete Niederschlag wird filtriert, gelöst. Zu der so erhaltenen Lösung werden 4 g Amy- mit Wasser gewaschen, getrocknet und mit einem läse, 0,2 ml Eisessig und 0,3 ml Toluol gegeben, und 50 Gemisch von Chloroform und Methanol 1: 1 extradas erhaltene Gemisch wird bei 3O⁰C 7 Tage stehen- hiert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels aus dem gelassen. Die abgeschiedene Substanz wird durch Extrakt erhält man 500 bis 540 mg eines gelblichen Filtrieren gesammelt, getrocknet und mit einem Ge- braunen Pulvers, welches aus wäßrigem Methanol und misch von Chloroform und Methanol 1: 1 extrahiert. dann aus wasserfreiem Methanol kristallisiert wurde, Der Extrakt wird unter reduziertem Druck eingeengt, 55 und 200 mg der Tetraglycosidfraktion mit F. = 256 der so erhaltene Niederschlag filtriert und getrocknet bis 258°C (Zersetzung) in Form eines weißen mikro- und ergibt 930 mg der Tetraglycosidfraktion, bestehend kristallinen Pulvers. Diese Fraktion bestand aus 40% hauptsächlich aus Desgalactotigonin und F-Gitonin. Desgalactotigonin und 60% F-Gitonin.

Die erhaltene Tetraglycosidfraktion wird auf Zellulosepulver chromatographiert, welches Zellulosepulver 60 Beispiel 4 mit Aceton, das 15% Formamid enthielt, imprägniert

war. Das Zellulosepulver wird dann getrocknet. Durch 50 g Pentaglycosidfraktion gemäß Beispiel 1, a) wur-

Eluieren mit einem Lösungsmittelsystem aus Chloro- den der Einwirkung von vier Arten von Enzym-

form-Tetrahydrofuran-Pyridin-Formamid im Verhält- präparaten unterworfen; die Produkte wurden papier-

nis 10:10: 2: 3 bis 4, werden Desgalactotigonin und 65 chromatographiert.

F-Gitonin erhalten. Wie die folgende Tabelle zeigt, tritt eine Tetra-

Desgalactotigonin: Mikrokristallines Pulver mit glycosidbildung ein durch Verlust von 1 Mol GIu-

F. = 284 bis 286°C (Zersetzung), nach Kristallisieren kose — und zwar in allen Versuchen.

	. l	Experiment-Nr.	2	3	4
	30% Äthanol mn	30% Äthanol inn	20% Äthanol	20% Äthanol
Lösungsmittel (ml)	JlUU 0,2	JLWV/	2 Tropfen	2 Tropfen
Eisessig (ml)	Emulsin	Schneckenenzym	Hemicellulase	Amylase
Enzympräparat (mg)	500	200	100	100
	5	5	. 7	7
Reaktionszeit (Tage)	25	25	25	30
Temperatur (° C)	+	+	+	+
Tetraglycosid	±	—	—	' —
Pentaglycosid		+		-f-
Glucose	—	—	—..	■ —
Galactose

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Saponin-Tetraglycosiden aus Blättern von Digitalis-Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Saponinfraktion aus Digitalis-Blättern oder die aus diesen durch Chromatographie abgetrennte Pentaglycosidfraktion mit einem hauptsächlich eine Glucosidase enthaltenden Enzympräparat behandelt und gegebenenfalls das erhaltene Gemisch der Tetraglycoside, zweckmäßig durch Umkristallisieren oder Chromatographie, trennt.