JPH0222289A - オリゴグルコシド誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、後記の一般式Ｉの化合物の製造法に関する。

従来の技術 血清中のコーアミラーゼの測定は、すいぞうの機能の重
要な臨床上のパラメータである。α−アミラーゼを測定
するためＩこ市場で得られる試薬は、以前ｌこは主とし
て基質としての澱粉又は澱粉誘導体の使用であった。し
かしながらこの基質は、殊に均一性に関して不十分であ
ることが判明しｔ；。それ故この欠点を除去するために
、澱粉及び澱粉誘導体をオリゴサツカリド及びその光学
的に測定される誘導体に代え、その際殊にマルトテトラ
オース、−ペンタオース、−ヘキサオース及び−へブタ
オース及びこれらの誘導体によって重要な改良が得られ
た（ドイツ公開特許第２７４１１９２号明細書、ドイツ
公開特許第２７５５８０３号明細書、米国特許第３８７
９２．６３号明細書、米国特許第４００００４２号明細
書）。

前記オリゴグルコシドを使用してのα−アミラーゼ測定
の特に重要な実施形式は、α−グルコシダーゼの存在で
得られた。それというのもオリゴグルコシドのグルコー
スへの完全な分解が得られ、更にグルコースはこのため
の公知方法によって容易に測定することができたからで
ある（ドイツ公開特許第２７４１１９２号明細書参照）
。

しかしながら、助酵素のα−グルコシダーゼは、でき上
がった試薬混合物の保管貯蔵時間を下げることが判明し
た。それというのもこれはａ−アミラーゼの影響を有し
ないで、オリゴグルコシドの一定分解を惹起するからで
ある。

発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の課題はこれらの欠点を除去し、α−グ
ルコシダーゼの存在でも十分に保存することができ、α
−アミラーゼの検出の正確性を改良するα−アミラーゼ
の基質を得ることである。

問題点を解決するための手段 この課題は、本発明によれば、一般式Ｉ：［式中Ｒ及び
Ｒ１は、相互に独立にそれぞれ炭素原子１〜６個を有す
る直鎖状又は分校状のアルキル基又はアルコイル基又は
フェニル基を表わし、その際Ｒ及びＲ１は一緒になって
メチレン橋を形成してもよく、その水素原子は相互に独
立にそれぞれ炭素原子１〜５個を有するアルキル基又は
フェニル基によって置換されていてもよく、Ｒ２はグル
コース単位２〜７個を有するオリゴグルコシド基を表わ
し、Ｘは水素原子又は光学的に測定される基を表わす］
の化合物の製法によって解決される。

本発明による化合物ですぐ使える試薬は、αグルコシダ
ーゼの存在でも変化をこうむらずそれ放炎時間後にも正
確なａ−アミラーゼの値が得られる。

アルキル基としては、メチル−、エチルーグロビルー　
イソプロピル−ブチル−イソブチル−ｔ−ブチル−ｎ−
ペンチル基、これらの異性体、ｎ−ヘキシル基、この異
性体ｆｆｉびにシクロヘキシル基が挙げられる。同じよ
うにして、前記アルキル基に相応するアルコイル基は、
末端グルコシド基の４位及び／又は６位の酸素原子の置
換分として該当する。本発明の範囲内ではＲとＲ１とが
一緒になって場合により置換されているメチレン橋を形
成する化合物が好ましく、特にアルキル基又はフェニル
基、殊にエチリデン基又はベンジリデン基によって置換
されている化合物好ましい。

オリゴグルコシド基Ｒ２では、グルコース単位３．４及
び６個を有するものが好ましい。

Ｘが光学的に測定される基の場合には、可視光線又は紫
外線の帯域でも色を有する基であるか又は他の化合物と
の反応により、例えば色素に変換するか又は色素と結合
して光学的に測定される基である。かかる光学的に測定
される基は当業者には明らかであり、詳説は不必要であ
る。好ましくはニトロ基を有するフェニル基、例えばニ
トロフェニル基又は３．４−ジニトロフェニル基である
。

本発明による化合物の製造は、末端に場合により光学的
に測定される基Ｘを有するグルコース単位３〜８個を有
するオリゴグルコシドから出発して、これをエステル化
又はエーテル化の条件下にオルトオキシ化合物、好まし
くはジアルコキシエタン又は相応するベンジル誘導体と
反応させ、Ｒ及びＲ１が一緒になって場合により置換さ
れているメチレン基を形成する一般式■の化合物を形成
し、続いて場合により例えばベルアセチル化によって遊
離ＯＨ基を封鎖し、４位又は６位の酸素原子のメチレン
橋を分解し必要の場合にはこのようにして形成した４位
又は６位の遊離ＯＨ基をなおエーテル化又はエステル化
又はエーテル置換又はエステル置換し、Ｒ後に他のＯＨ
−封鎖基、例えばアセチル基を脱離することによって行
うことができる。

この合成で中間生成物として生じるが、その外に最終産
物としても好ましく場合により置換されているメチレン
橋を有する化合物は、本発明によれば、一般式■： Ｒ３−Ｘ　　　　　　　　　　　　　ｎ［式中Ｘは前記
のものを表わし、Ｒ３はグルコース単位３〜８個を有す
るオリゴグルコシド基を表わす］の化合物を、ｐ−ドル
オールスルホン酸の存在で一般弐■： ［式中Ｒ４及びＲ５は相互に独立にそれぞれ水素原子又
は炭素原子１〜５個を有するアルキル基又はフェニル基
を表わす］の化合物と極性有機溶剤中で反応させること
によって製造される極性有機溶剤としては、ジメチルホ
ルムアミド又はホルムアミドが好ましいが、比較される
塩基度を有する他の極性有機溶剤も適当である意外なこ
とにも、前記反応によって均一な生成物が得られ、存在
する多（のＯＨ基を保護することは不必要である。場合
により形成した副産物は容易に分離することができる。

反応は好ましくは温度的１０〜７０℃、好ましくは室温
で行う。反応では殆ど副産物は形成しないので、十分な
収率を得るためには、好ましくは化学量論的過剰量の一
般弐ＩＩＩの化合物で作業する。

一般弐ＩＩＩの化合物の例は、ジメトキシメタンジメト
キシエタン、ジェトキシエタン、ジアルコキシエタン、
ジブトキシエタン、ジメトキシプロパン、ジメトキシイ
ソプロパン及びフエニルジメトキシメタンである。

一般式■の化合物の例は、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオースマルトヘプタオース
及び末端で光学的に測定される基によって置換されてい
るこれらの誘導体、例りばモノニトロフェニル−マルト
へフタオース、３．４−ジニトロフェニル−マルトへブ
タオースその他である。

本発明による化合物のすぐれた保管貯蔵性は基質として
のｐ−二トロフェニルマルトへブタオシド（Ｇｅ１）Ｎ
Ｐ）での十分に普及した常用のα−アミラーゼの呈色試
験の条件下、即ち緩衝液のｐＨ７，ｌ　；ＮａＣＱ５０
ｍＭ；　ａ−グルコシダーゼ約３０Ｕ／ｍ１２Ｂ基質５
ｍＭで、４．５−ｚチリデンーｐ−ニトロフェニルマル
トへブタオシド（Ｅｔｈ　−Ｇ７＋）ＮＰ）で２５℃で
４日間内のラグ相及び線型に関する実際に同じ反応経過
でグルコースは形成しないが、Ｇ７ｐＮＰでは著しいグ
ルコースへの分解が生じることを示す。４℃での同じ条
件下では、本発明による基質で８日間後にグルコースの
形成は生じなかったが、これに反して公知比較基質では
著しい分解が生じた。

それ数本発明によって、ａ−アミラーゼの基質としてα
−グルコシダーゼの存在ですぐれた性質を有する新規化
合物が得られる。

実施例 例　　１ ４．６−エチリデン−４−ニトロフェニル−σ−Ｄ−マ
ルトヘプタオシドの製造法。

バッチ： ４−ニトロフェニル−α−〇−マルトヘフタオシド　　
　　２５０ｇ　（１９６ｍモル）アセトアルデヒド−ジ
メチルアセタール３１．５ｍＱ（２９７ｍモル） パラ−ドルオールスルホン酸−Ｈ２０ ０ｇ ＤＭＦ　（ジメチルホルムアミド）　　　１．５Ｑ合　
　成　： ４−ニトロフェニル−σ−Ｄ−マルトヘクタオシド２５
０ｇ及びパラ−ドルオールスルホン酸・Ｈ２Ｏ２０１Ｆ
をＤＭＦ約１．５１２にとかし、無水にするために回転
蒸発器で回転させて乾燥する。その除水の含量が０．４
％から０．０２％に下がる。

残渣をＤＭＦｌ、５１２にとかし、アセトアルデヒド−
ジメチルアセタール３１．５ｍ１２を添加し、先づ５０
℃で９時間撹拌し、次いで室温で約１０時間維持する。

反応混合物を濃縮乾燥し、残渣を水にとかし、水酸化リ
チウム溶液でｐＨ７，３に調節し、濾過し、７５０ｔ１
２に濃縮する。

ＨＰ　Ｌ　Ｃ分析によって、原料的２０％を有するエチ
リデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘグタオ
シド約７５〜８０％の含量が得られる。

クロマトグラフィーによる精製二 試料溶液（７５０ｍＱ）を、Ｄｏｗｅｘ５０　　Ｗ　Ｘ
　２（２００〜４００メツシユ）リチウム＋７０Ｑを有
する１５０Ｘ２５ｃｍのカラムにあけ、水で流量１．５
Ｑ／時間で溶出する。その際７ラクシヨン４．５Ｑを採
取し、クロマトグラフィーを紫外線検出器を用いて２８
０ｎｍで行う。

約１００ａによって未反応の４−二トａフェニルーα−
Ｄ−マルトヘプタオシドが溶出し、約２００Ｑによって
求める生成物が溶出する。

生成物を含有するフラクションを合し、濃縮乾燥する。

残渣をメタノール１．５１２にとかし、濾過し、０℃で
インプロパツール４Ｉ２及び石油エーテルｌ（［で沈殿
させる。４℃で１夜撹拌後に、生成物を吸引濾過し、イ
ソプロパツール及び石油エーテルで洗浄し、乾燥基中で
３０℃で乾燥する。

収量：ｌ５０ｇ　（理論量の５８％）、無色の粉末、分
子量１３００゜ 分析： Ｈ２Ｏ［フイシャ−（に、　Ｆｉｓｃｈｅｒ）による１
４．５％ インプロパツール（ガスクロマトグラフィーによる）　
　　　　　　　　　　　　　　５％酸性加水分解（酵素
）によるアセトアルデヒド９１％ ［αＩＤ２５℃（乾燥物質に対する）−７７°（Ｃ−１
％Ｈ２０） ＨＰＬＣ二面の％９９（−ＮＨ２−柱５μニアセトニト
リル／水１：ｌ、ｃ−燐酸１ｍモル／Ｌ３０５ｎｍＴ検
波）。

例　　２ ４．６−ニチリデンーマルトヘプタオースの製造法。

バッチ： マルトヘプタオース　ｌＯｇ（８，７ｍモル）アセトア
ルデヒド−ジメチルアセタール１−ａｍ（ｌｃ１７ｍモ
ル） パラ−ドルオールスルホン酸壷Ｈ２０１ｇＤＭＦ　　　
　　　　　　　　　　　　７５＋ｍ（２合　　成　： マルトヘプタオース１０ｇ　及びパラ−ドルオールスル
ホン酸・Ｈ２Ｏ１ｇをＤＭＦｌｏｏｍＱにとかし、濃縮
乾燥する。この方法で残渣を無水にする。残渣をＤＭＦ
７５ｍ１２にとかし、アセトアルデヒド−ジメチルアセ
タール１．７ｍｆｆヲ加え、密閉して５０℃で１５時間
撹拌する。次いで反応溶液を濃縮乾燥し、残渣を水にと
かし、水酸化リチウムでｐＨ７に中和し、濾過し、５０
ｍＱに濃縮する。

クロマトグラフィーによる精製： 試料溶液５０ｒＲＱを、Ｄｏｗｅｘ５０　　ＷＸ　２　
（２００〜４００メツシユ）Ｌ＋　３．５ｆ２を有する
クロマトグラフィーのカラム（１８０Ｘ５ｃｍ）にあけ
水で流量１５０　ｒａＱ／時間で溶出する。紫外線検波
器（２８０ｎｍ）を通るフラクション３０ｍＱを採取す
る。

１．８Ｑによりマルトヘプタオースが溶出し、２．２５
ｆｆによりエチリデン−マルトへブタオースが溶出する
。

主要フラクションを合し、回転させて乾燥し水を若干添
加してメタノール２００１１（２にとかしインプロパツ
ール２００＋Ｑを加え、４°Ｃで撹拌する。その際生成
物が沈殿し、これを吸引濾過レインプロパツール及び石
油エーテルで洗浄し、真空中で２５℃でＰ２Ｏ５によっ
て乾燥する。

収量：６．２ｇ　（理論量の６０％） 分析： 水［フィシャ−（Ｋ、　Ｆｉｓｃｈｅｒ）による］７．
６％ 酸性加水分解（酵素）によるアセトアルデヒド９１．２
％ ［σ］Ｄ２５°Ｃ（乾燥物質に対する）−６９°　（ｃ
−１％Ｈ２０） ＨＰＬＣ（例１の条件参照）二面の％　９６テトラゾリ
ウムプルーとの反応は、還元性末端が存在しないことを
示す。

例　３（参考例） 試薬： エチリデン−Ｇ７ｐＮＰ　６８２．５ｍｇ（５，２５ｍ
モル／４）を、塩化ナトリウム（５２，５ｍモル／Ｑ）
並びにアルファーグルコシダーゼ（４２Ｕ／ｍＱ）を含
有する燐酸ナトリウム緩衝液１００ＩＩｌ＋２（１０５
ｍモル／ｆ２）にとかし、ｐＨ７，１０に調節した。

試験の最終濃度： 燐酸塩緩衝液１００ｍモル／　Ｑ、　Ｎａ（４５０ｍモ
ル／　Ｑｓ　基質５　ｍモル／Ｑ１アルファーグルコシ
ダーゼ４０Ｕ／ｒｔｒＱ。

試験バッチ： ２５℃に加熱した試薬２．０諺Ｑに試料０　、　ｌ　ｒ
ｓＱを添加し、混合物を２５℃に加熱した。予培養時間
４分間（ラグ相）後に、吸光の増大をＨｇ４０５ｎｍで
エツベンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）光度計で記録し
た。毎分の吸光の変化（ΔＥ／分）から、試料中のアミ
ラーゼの活性を次式によって計算した。

ΔＥ／分・■・１０００・３ ＝ΔＥ／分・７０００　［Ｕ／１２］ −Ｖ−ｄ アルファーアミラーゼの再発見： 活性の測定を、４°Ｃ及び２５℃で保存した試薬で一定
の時間間隔でくり返し、次の値が得られた。

４８時間　〃 ８時間（４℃） ２４時間　／／ ４８時間　〃 ７２時間　／／ ８０時間　〃 平均値／ＶＫ ＋２６　　　　　　３８２ １１９３．２％　　３８３ ３．０％　　２１４ 個々の値は、手工による酵素の活性の測定に対する通常
の変動中である。

２．０％ 最初の値 ４時間（２５°Ｃ） ８時間　／１ ２４時間　〃 ３２時間　〃

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ I ［式中Ｒ及びＲ＿１は、相互に独立にそれぞれ炭素原子
   １〜６個を有する直鎖状又は分枝状のアルキル基又はア
   ルコイル基又はフェニル基を表わし、その際Ｒ及びＲ＿
   １は一緒になってメチレン橋を形成してもよく、その水
   素原子は相互に独立にそれぞれ炭素原子１〜５個を有す
   るアルキル基又はフェニル基によって置換されていても
   よく、Ｒ＿２はグルコース単位２〜７個を有するオリゴ
   グルコシド基を表わし、Ｘは水素原子又は光学的に測定
   される基を表わす］の化合物を製造する方法において、
   一般式II： Ｒ＿３−ＸII ［式中Ｘは前記のものを表わし、Ｒ＿３はグルコース単
   位３〜８個を有するオリゴグルコシド基を表わす］の化
   合物を、ｐ−トルオールスルホン酸の存在で一般式III
   ： ▲数式、化学式、表等があります▼III ［式中Ｒ＿４及びＲ＿５は、相互に独立にそれぞれ水素
   原子又は炭素原子１〜５個を有するアルキル基又はフェ
   ニル基を表わす］の化合物と極性有機溶剤中で反応させ
   ることを特徴とする、一般式 I の化合物の製造法。 ２、有機溶剤としてジメチルホルムアミドを使用する、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、反応を１０〜７０℃で行う、特許請求の範囲第１項
   又は第２項記載の方法。 ４、一般式IIIの化合物を過剰量で使用する、特許請求
   の範囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の方法
   。