JPH0488996A

JPH0488996A - ３―ケトブチリデン２―クロロ―４―ニトロフェニル―β―マルトペンタオシドの製造法

Info

Publication number: JPH0488996A
Application number: JP20273390A
Authority: JP
Inventors: Katsutoshi Ishimaru; 勝敏石丸
Original assignee: Welfide Corp
Current assignee: Welfide Corp
Priority date: 1990-07-31
Filing date: 1990-07-31
Publication date: 1992-03-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はα−アミラーゼ活性測定用基質として有用な３
−ケトブチリデン　２−クロロ−４−ニトロフェニル−
β−マルトペンタオシドの新規す製造法に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕膵液
や尿などの体液に含まれるα−アミラーゼの活性を測定
することにより、各種疾患の診断が行なわれている。

α−アミラーゼの活性測定法には、たとえばマルトオリ
ゴ１！（マルトペンタオースやマルトテトラオース）を
基質とする方法がある。この方法によればα−アミラー
ゼ含有試料に該マルトオリゴ糖とα−グルコシダーゼを
作用させ、基質から遊離してきたグルコースの量を測定
することによりα−アミラーゼの活性を知ることができ
る。

また、マルトオリゴ糖の還元性末端にニトロフェノール
、ジクロロフェノール、クロロ−ニトロフェノール等の
色原体をアグリコンとして結合させた基質を用いる方法
も提案されている。これらの基質を用いるとα−アミラ
ーゼと共存酵素の作用により最終的にはアグリコンが遊
離し、遊離したアグリコン、たとえばｐ−二トロフェノ
ールの量を光学的に測定することによりα−アミラーゼ
の活性を容易に知ることができる。

さらに優れたα−アミラーゼ活性測定用の基質として、
マルトオリゴ糖の還元性末端にフェノール類をアグリコ
ンとして結合させ、かつ非還元性末端グルコースの水酸
基を種々の置換基でブロックした構造を持つ化合物が提
案されている。たとえば、特開平１−１５７９９６号公
報には３−ケトブチリデン　２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−β−マルトペンタオシドを基質として用いる方
法が開示されている。

同公報には上記基質の合成法としてβ−（２クロロ−４
−二トロフェニル）−マルトペンタオシドと１．１−ジ
メトキシ−３−ブタノンとのアセタール交換反応による
方法が記載されているが、工業的製造法として充分満足
できるものとはいい難い。即ち原料であるβ−（２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドは通
常マルトペンタオースから出発しアセチル化、グリコシ
ド化、脱アセチル化等の多段階の化学反応を経て合成さ
れるが、収率は必ずしも定量的ではなく、また各段階の
反応物は飴状の物が多く、再結晶等の簡単な操作に依っ
ては精製し難いものが多い。

また、１．１−ジメトキシ−３−ブタノンとのアセター
ル交換反応も副反応が多く、しかも最終目的物をカラム
クロマトにより単離する際に保持時間が目的物と近似し
ている副成物が混在しているため、クロマト分離の効率
が低いという欠点がある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、これらの問題を克服する方法の一つとし
て酵素反応に着目し研究を重ねた結果、３−ケトブチリ
デンマルトヘキサースと２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル−β−グルコシドとに水と水可溶性有機溶媒との混合
溶媒中でサイクロデキストリングルカノトランスフェラ
ーゼを作用させることにより効率よく３−ケトブチリデ
ン　２−クロロ−４−二トロフェニルマルトペンタオシ
ドが製造できることを見出した。

本発明の目的はα−アミラーゼ活性測定用の基質として
有用な３−ケトブチリデン　２−クロロ４−ニトロフェ
ニル−β−マルトペンタオシドの効率的製造法を提供す
ることにある。

すなわち、本発明は式により表わされる供与体基質としての３−ケトブチリデ
ン−マルトヘキサオースと式により表わされる受容体基質としての２−クロロ４−ニ
トロフェニル−β−グルコシドとに、水可溶性ｌｒ機溶
媒と水との混合溶媒中でサイクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼを作用させることを特徴とする式により表わされる３−ケトブチリデン　２−クロロ−４
−ニトロフェニル−β−マルトペンタオシドの製造法を
提供する。

本発明で用いられる供与体基質としての３−ケトブチリ
デン−マルトヘキサオースは酸触媒の存在下、マルトヘ
キサオースに１．１−ジメトキシ−３−ブタノンまたは
４−メトキシ−３−ブテン２−オンを作用させることに
より得られ、必要であれば逆相クロマトグラフィー等に
より精製し、高純度のものを作ることができる。また、
マルトヘキサオースはアミロースにヘキサオース生成ア
ミラーゼを作用させ、精製すれば得られる〔エフ・イー
・ビー・ニス　レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）
第２６Ｓ、２８１頁（１９７２年）　、’Ｊ、　Ｊａｐ
、　Ｓｏｃ。

５ｔａｒｃｈ　Ｓｃｉ、第２８巻、９２頁（１９８１年
）〕。

本発明で用いられる受容体基質としての２−クロロ−４
−ニトロフェニル−β−グルコシトハ生化学実験講座第
４巻〔Ｉ！質の化学（上）〕３９頁記載０実験例５と類
僚の方法によりグルコースのアセチル化、２−クロロ−
４−二トロフェノールとのグリコシド化、脱アセチル化
の工程を経て合成される。オリゴ糖の場合と異なり、各
工程の反応はほぼ定量的に進行し、かつ反応生成物は結
晶性に冨むため、再結晶により容易に精製できる。

本発明で使用されるサイクロデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼは起源、由来に特に限定はなく、たとえ
ばバチルス・マセランス由来のもの、バチルス・メガテ
リウム由来のもの、バチルス・ステアロサーモフィラス
由来のものが用いられる。

本発明に用いられる水と水可溶性有機溶媒との混合溶媒
において、水とは水またはｐＨ５〜８の緩衝液を意味す
る。緩衝液の種類については特に指定はなく酢酸緩衝液
、グツドの緩衝液等が挙げられる。また水ないし緩衝液
には２〜１２ｍ、Ｍの塩化カルシウムを含有させること
が望ましい。水可溶性有機溶媒としてはメタノール、エ
タノール、ｎ−プロパツール、イソプロピルアルコール
、第３級ブチルアルコール、アセトン、ジメチルスルホ
キシド、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、１．３ジメチ
ル−２−イミダゾリジノン、エチレングリコール、プロ
ピレングリコール等が挙げられるが、これらの水可溶性
有機溶媒は二種以上混合して使用してもよい。混合溶媒
中での水可溶性有機溶媒の濃度は３０〜７０容量％が望
ましい。この濃度範囲ではサイクロデキストリングルカ
ノトランスフェラーゼは、失活しないで効率よく糖転移
反応を行なう、水可溶性有機溶媒が存在しない場合には
、反応の進行が遅く効率が非常に低い。

本反応において、３−ケトブチリデン−マルトヘキサオ
ースと２−クロロ−４−ニトロフェニルβ−グルコシド
のモル比は前者１に対し後者１．１〜５が望ましく、反
応温度は３０〜５０℃が望ましい。サイクロデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼの使用量は、３−ケトブ
チリデンマルトヘキサオース１モルに対し１５００００
〜１００００ユニツトが望ましい。

反応終了後、反応液を酢酸でｐ　Ｈ４，０以下に調整し
て酵素を失活させた後、逆相クロマト等により精製を行
ない目的物を得ることができる。

〔実施例〕

以下、参考例、実施例により本発明をさらに詳しく説明
するが、本発明の範囲を限定するものではない。

参考例１マルトヘキサオース３０ｇ、４−メトキシ−３ブテン−
２−オン６．２ｗ＋Ｌメタンスルホン酸１．７ｇをＮ、
Ｎ−ジメチルホルムアミド２５０ｍ１に溶解し攪拌下、
室温で３０時間反応した。反応終了後、反応液に弱塩基
性イオン交換樹脂を加え酸を中和し、濾過後、濾液を濃
縮し粗品を得た。

粗品を○ＤＳ（オクタデシルシリル化シリカゲル）逆相
カラムクロマトグラフィーにより精製し・高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）面積純度９９％の３−
ケトブチリデン−マルトヘキサオース２５．８　ｇを得
た。融点１４５〜１５１℃参考例２ｆｉｌ　　β−ペンタアセチルグルコース６０．６ｇ、
２クロロ−４−二トロフェノール６０ｇ１無水塩化亜鉛
１．３ｇをナスフラスコに入れ、ロータリーエバポレー
ターにセットし１０〜２０ｍｍＨｇの減圧下に浴温１２
０℃の油浴で加熱しながら４時間反応した。反応終了後
、反応物に酢酸エチルを加え溶解し、有機層を水、２．
５％水酸化ナトリウム水、水の順で洗浄後、有機層を濃
縮し粗品を得た。粗品をトルエンで再結晶すると、白色
結晶のβ−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−ｆト
ラアセチルグルコシドが得られた。融点１５１〜１５３
℃。

（２）　　β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−
テトラアセチルグルコシド５０ｇに２５０１の無水メタ
ノールを加え、０℃まで冷却した後、２８％ナトリウム
メトキサイド４１を加え、同温度で３時間攪拌した。反
応終了後、酢酸１．３ｍｌで中和し、一部のメタノール
を減圧下に留去後、残りの溶液を冷却すると微黄色の結
晶が析出した。結晶を濾取後、冷メタノールで洗浄し、
乾燥すると白色結晶ノ２−　クロロ−４−ニトロフェニ
ル−βグルコシド３５ｇが得られた。融点１８０〜１８
２℃。本島がβ体であることはβ−グルコシダーゼを作
用させることにより確認した。

実施例１ｆｉｌ　　反応ｎ−プロパツール１３０１．５ｍＭ塩化カルシウム含有
１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）１３０ｓ＋１から
なる溶液に３−ケトブチリデン−マルトヘキサオース３
７ｇ、２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−グルコシ
ド１３．５ｇ、サイクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼ２２９０ユニツトを加え、３７℃で８時間攪
拌反応した。反応液に酢酸を加え、ｐ　Ｈ４，０とし１
時静置後、活性炭４ｇを添加し２時間攪拌した後、濾過
した。

得られた濾液を外温４５℃で約１５０１まで減圧濃縮し
、反応物の濃縮液を得た。

（２）精製内径５ｃｍ、長さ３０ｃＩ１１のガラスカラムにオクタ
デシルシリル化シリカゲル充填剤（ウォーターズ社製）
約３００ｇをスラリー法で充填し、常法によりコンディ
ショニングを行なった。このカラムに前記の濃縮液をチ
ャージ後、１５％アセトニトリル水で展開し、目的成分
を含む留分を集め減圧下に濃縮乾固すると、白色結晶の
３−ケトブチリデン　２−クロロ−４−ニトロフェニル
−β−マルトペンタオシド２２．３　ｇが得られた。Ｈ
ＰＬＣ面積純度９９％以上、融点１８８〜１９２℃。

ＨＰＬＣのリテンションタイムおよび薄層クロマトグラ
フィ（Ｔ　Ｌ　Ｃ）のＲｆ値は特開平１−１５７９９６
号公報に記載の方法で合成した標品の値と一致した。

ＮＭＲ、δ値（分裂型、相対プロトン数）２．２（１重
線、３）２．９（２重線、２）３．２〜４．２（多重線、３１）４．７（１重線、１４）５〜５．６（多重線、５）７．３（２重線、Ｊ＝９Ｈｚ、　１）８．１５（ダブル２重線、Ｊ＝３Ｈｚ、　Ｊ＝９Ｈｚ、
　１）８．２１（２重線、Ｊ＝３Ｈｚ、　１）６２．２
（３Ｈ）はＣＨ３ＣＯ−基、６２．９（２Ｈ）は−ＣＯ
ＣＨｚ−基に由来するピークである。

〔発明の効果〕

本発明の方法によればα−アミラーゼ活性測定用基質と
して有用な３−ケトブチリデン　２−クロロ−４−二ト
ロフェニルーβ−マルトペンタオシドをサイクロデキス
トリングルカノトランスフェラーゼの糖転移反応を水可
溶性有機溶媒と水との混合溶媒中で行なうことにより効
率よく合成することかできる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ により表わされる供与体基質としての３−ケトプチリデ
ン−マルトヘキサオースと式 ▲数式、化学式、表等があります▼ により表わされる受容体基質としての２−クロロ−４−
ニトロフェニル−β−グルコシドとに、水可溶性有機溶
媒と水との混合溶媒中でサイクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼを作用させることを特徴とする式 ▲数式、化学式、表等があります▼ により表わされる３−ケトプチリデン２−クロロ−４−
ニトロフェニル−β−マルトペンタオシドの製造法。