BR9914812B1

BR9914812B1 - processo para a clivagem enzimática de rutinosìdeos.

Info

Publication number: BR9914812B1
Application number: BRPI9914812-9A
Authority: BR
Inventors: Herwig Buchholz; Thomas Koppe; Michael Schleehahn
Priority date: 1998-10-30
Filing date: 1999-10-13
Publication date: 2011-01-11
Also published as: DE59911291D1; ATE284971T1; AU6338799A; EP1124981A1; US6420142B1; EP1124981B1; JP2002528133A; WO2000026400A1; DE19850029A1; CN1325454A; BR9914812A; KR20010080330A; CA2348933A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA A CLIVAGEM ENZIMÁTICA DE RUTINOSÍDEOS".

A invenção refere-se a um processo para a clivagem enzimáticade rutinosídeos para obter ramnose e/ou os correspondentes glicopiranosí-deos, a reação sendo realizada na presença de uma mistura de solvente deágua e um ou mais solventes orgânicos.

No contexto da presente invenção, rutinosídeos são designadoscomo os compostos que contém um constituinte isento de açúcar, ao qualum radical de fórmula (I)

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É ligado via uma ligação glicosídica. Por exemplo, os rutinosí-deos são flavonóides tendo a unidade bisglicosídica mostrada na fórmula I.Ramnose e/ou os glicopiranosídeos correspondentes são produzidos a partirde rutinosídeos pelo processo de acordo com a invenção.

Os glicopiranosídeos são derivados de rutinosídeos em que, emvez do radical de fórmula (I), eles contém um radical de fórmula (I*)

<formula>formula see original document page 2</formula>

Ligado ao constituinte isento de açúcar. Por exemplo, tantoramnose e isoquercetina podem ser obtidos a partir de rutina pelo processode acordo com a invenção.

Ramnose é um monossacarídeo que é de ocorrência difundidana natureza, mas geralmente somente em quantidades pequenas. Umafonte importante de ramnose é, por exemplo, os radicais glicosídicos de fla-vonóides naturais como rutina, das quais a ramnose pode ser obtida por cli-vagem de glicosídeo. Ramnose, por exemplo, desempenha um papel im-portante como uma substância de partida para a preparação de substânciasaromáticas sintéticas, como furaneol.

A isoquercetina é um flavonóide monoglicosidado de seguintefórmula estrutural (II)

<formula>formula see original document page 3</formula>

Flavonóides (lat. Flavus = amarelo), que são colorantes bem es-palhados nas plantas, são designados como sendo, por exemplo, glicosí-deos de flavonas, aos quais a estrutura parental de flavona (2-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona) é comum.

O constituinte isento de açúcar dos flavonóides é a assim cha-mada aglicona. Isoquercetina é, por exemplo, um glicosídeo de agliconaquercetina (2-(3,4-dihidroxifenil)-3,5,7-trihidróxi-4H-1-benzopiran-4-ona), quedifere de flavona pela presença de cinco grupos hidroxila. Em isoquercetina,o radical carboidrato glicose é ligado ao grupo hidroxila em posição 3 daquercetina. Isoquercetina é designada, por exemplo, como quercetina 3-0-β-D-glicopiranosídeo ou 2-(3,4-dihidroxifenil)-3-(P-D-glucopiranosilóxi)-5,7-dihi-dróxi-4H-1-benzopiran-4-ona. No entanto, ela é também conhecida, porexemplo, sob o nome hirsutrina.Flavonóides e misturas de flavonóides são usadas, por exemplo,nas indústrias de produtos alimentícios e cosméticos e dada vez estão ob-tendo maior importância. Particularmente, os flavonóides monoglicosidados,como isoquercetina, são distintos por uma boa capacidade de absorção nocorpo humano.

Um exemplo de flavonóide de ocorrência natural tendo uma uni-dade bisglicosídica é rutina, que tem a seguinte fórmula estrutural (III):

<formula>formula see original document page 4</formula>

Rutina, como isoquercetina, é do mesmo modo um glicosídeo dequercetina de aglicona onde o radical carboidrato rutinose é ligado ao grupohidroxila na posição 3 da quercetina. O radical carboidrato em rutina consisteem uma unidade glicose ligada nas posições 1 e 6 e uma ramnose termi-nalmente ligada ou unidade 6-deoximanose. Rutina é designada, por exem-plo, como quercetina 3-0-p-D-rutinosídeo ou 2-(3,4-dihidroxifenil)3-{[6-0-(6-deoxi-a-mannopiranosil)-p-D-glucopiranosil]óxi} -5,7-dihidróxi-4H-1-benzopi-ran-4-ona. No entanto, também é conhecida, por exemplo, sob os nomessoforin, birutan, rutabion, tarutin, fitomelin, melin ou rutosídeo.

Rutina, com três moléculas de água de cristalização, formaagulhas de cor amarelo pálido a esverdeado. Rutina anidra tem as proprie-dades de um ácido fraco, torna-se marrom a 125°C, e decompõe a 214-215°C. Rutina, que ocorre em muitas espécies de planta - com freqüênciacomo um associado de vitamina C - por exemplo em espécies cítricas, emespécies amor-perfeito amarelo, forsitia e acácia, várias espécies Solanum eNicotiana, alcaparra, florescência de limeira, erva de St. John, chá, etc, foiisolada de arruda comum (Ruta graveolens) em 1842. Rutina pode ser tam-bém obtida de folhas de trigosarraceno e da árvore de pagode do orienteasiático Wei-Fa (Sophora japonica, Farbaceae), que contém 13-27% de rutina.

Pelas razões acima mencionadas, é desejável preparar tantoramnose e flavonóides monoglicosidados a partir de matérias-primas natu-rais, por exemplo de flavonóides tendo uma unidade bisglicosídica. Nestaconexão, por exemplo, a clivagem de rutinosídeos para ramnose e os cor-respondentes glicopiranosídeos é de interesse.

As preparações enzimaticamente catalisadas de ramnose sãodescritas na literatura. Por exemplo, EP 0 317 033 descreve um processopara a preparação de L-ramnose, com a ligação ramnosídica de glicosídeosque contém ramnose ligado na posição terminal sendo obtido por hidróliseenzimática. No entanto, clivagens deste tipo realizadas em meio aquoso deglicosídeos tendo uma estrutura bisglicosídica do radical carboidrato geral-mente prosseguiram com baixa seletividade. Por exemplo, considerando aestrutura bisglicosídica de radical carboidrato em rutina, resulta geralmenteuma mistura dos dois monossacarídeos glicose e ramnose. Além disso, ge-ralmente ocorrem altas proporções da quercetina de aglicona e outros sub-produtos indesejáveis.

Além disso, as clivagens enzimaticamente catalisadas de rutinasão também descritas, por exemplo, em JP 01213293. No entanto, reaçõesdeste tipo realizadas em meio aquoso geralmente da mesma forma prosse-guem com baixa seletividade.

O objetivo foi, assim, desenvolver um processo para a clivagemenzimática de rutinosídeos para obter ramnose e/ou os correspondentes gli-copiranosídeos o que evita ou pelo menos diminui as desvantagens dos pro-cessos conhecidos e, particularmente, torna possível uma preparação deramnose e dos glicopiranosídeos que é tão seletiva como possível, de modoque estes produtos podem ser preparados com alto rendimento.

De modo surpreendente, verificou-se agora que este objetivo éobtido se o processo para a clivagem enzimática de rutinosídeos para obterramnose e/ou os correspondentes glicopiranosídeos for realizado de modoque a reação ocorra na presença de uma mistura de solvente de água e umou mais solventes orgânicos.

O processo de acordo com a invenção é distinto particularmenteem que a clivagem de rutinosídeos para ramnose e os correspondentes gli-copiranosídeos ocorre com alta seletividade. Ramnose e os glicopiranosí-deos são preferivelmente obtidos por trabalho apropriado seguindo o pro-cesso de acordo com a invenção. Além disso, no entanto, ou somenteramnose ou somente os glicopiranosídeos podem ser também obtidos portrabalho apropriado seguindo o processo de acordo com a invenção.

A presente invenção torna disponível um processo vantajosopara a clivagem enzimática de rutinosídeos para obter ramnose e/ou os cor-respondentes glicopiranosídeos. De acordo com este processo, o rutinosí-deo é contatado com uma quantidade cataiítica de uma enzima em umamistura de solvente de água e um ou mais solventes orgânicos. Preferivel-mente, a reação é realizada com misturação completa, por exemplo poragitação.

A reação é preferivelmente realizada sob uma atmosfera de ni-trogênio.

Os rutinosídeos apropriados para o processo de acordo com ainvenção são, por exemplo, rutinosídeos que, como um constituinte isento deaçúcar ou aglicona, contém uma estrutura parental 2-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona que transporta um radical de fórmula (I) em posição 3 e grupos fenila,além da posição 3, também podem ser mono ou polissubstituídos por -OHou -O-(CH2)n-H, onde η é 1 a 8.

η é preferivelmente 1.

A substituição de estrutura parental 2-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona por -OH e/ou -O-(CH2)n-H preferivelmente ocorre em posições 5, 7, 3'e/ou 4'.Os rutinosídeos particularmente preferidos correspondem à fór-mula (IV)

<formula>formula see original document page 7</formula>

em que

R é H (rutinosídeo de quenferol), OH (rutina) ou OCH3 (rutinosídeode isoramnetina) Ramnose e glicosídeo de quenferol podem serobtidos a partir de rutinosídeo de quenferol pelo processo deacordo com a invenção, ramnose e isoquercetina de rutina, eramnose e glicosídeo de isoramnetina de rutinosídeo de iso-ramnetina. O rutinosídeo rutina é particularmente preferivel-mente usado.

A invenção também refere-se ao uso de glicosídeo de quenferol,isoquercetina e/ou glicosídeo de isoramnetina nas indústrias de alimentos ecosméticos.

O processo de acordo com a invenção não precisa de materiaisde partida altamente puros. Por exemplo, misturas de rutinosídeos tambémpodem ser usadas para o processo de acordo com a invenção. A reaçãotambém ocorre, por exemplo, se o material de partida for contaminado comoutros flavonóides. Também pode ser realizado, por exemplo, com resíduosde licor-mãe da produção de rutina.As enzimas apropriadas para o processo de acordo com a in-venção são hidrolases. Hidrolases que foram obtidas da cepa Penicilliumdecumbens são preferível mente usadas, particularmente as enzimas narin-ginase e hesperidinase. A enzima naringinase é muito excepcionalmentepreferida.

Os materiais de partida e enzimas para o processo de acordocom a invenção são comercialmente obteníveis ou podem ser obtidas oupreparadas por processos que são bem conhecidos dos versados na técnica.

As temperaturas de reação apropriadas para o processo deacordo com a invenção são temperaturas entre 15 e 80°C. O processo deacordo com a invenção é preferivelmente realizado em temperaturas de rea-ção de;30 a 50°C, particularmente em temperaturas de reação de 35 a 45°C.

Se a temperatura de reação for muito baixa, a reação prosseguecom uma taxa de reação inapropriadamente lenta. Em contraste, se a tem-peratura de reação for muito alta, a enzima, que é uma proteína, é desnatu-rada e assim desativada.

Os pHs apropriados para o processo de acordo com a invençãosão pHs dentre 3 e 8. O processo de acordo com a invenção é preferivel-mente realizado em pHs de 4,5 a 7, particularmente em pHs de 4,8 a 6,8.

Além disso, os pHs preferidos podem, no entanto, variar, dentro dos limitesdados dependendo da enzima usada. Por exemplo, pHs de 6,4 a 6,8 sãomuito excepcionalmente preferidos quando usando a enzima naringinase.

0 processo é preferivelmente realizado em tal modo que o pH éajustado com a ajuda de um sistema tampão. Em princípio, todos os siste-mas tampão comuns que são apropriados para o ajuste dos pHs acimamencionados podem ser usados. Preferivelmente, no entanto, tampão decitrato aquoso é usado.

Preferivelmente, as faixas preferidas de temperatura e pH sãocombinadas, isto é, a reação é preferivelmente realizada em uma temperatu-ra de reação de 15 a 80°C e a um pH de 3 a 8, particularmente preferido auma temperatura de reação de 30 a 50°C, e a um pH de 4,5 a 7 e particu-larmente preferido a uma temperatura de reação de 35 a 45°C, e a um pH de4,8 a 6,8.

O(s) solvente(s) orgânico(s) além de água inclui(em) ambos ossolventes orgânicos que são miscíveis com água e solventes orgânicos quenão são miscíveis com água.

Os solventes orgânicos apropriados para o processo de acordocom a invenção são nitrilas como acetonitrila, amidas como dimetilformami-da, ésteres como ésteres de ácido acético, particularmente acetato de metilaou acetato de etila, álcoois como metanol ou etanol, éteres como tetrahidro-furano, ou metil terc-butiléter e hidrocarbonetos como tolueno. Preferivel-mente, o processo de acordo com a invenção é realizado na presença de umou mais dos solventes orgânicos ésteres de ácido acético, metanol, etanol,metil terc-butiléter, tolueno. Particularmente preferido, o processo de acordocom a invenção é realizado na presença de um ou mais ésteres de ácidoacético, particularmente na presença de acetato de metila.

As razões de volume de água: solvente orgânico apropriadaspara o processo de acordo com a invenção são relações de 1: 99 a 99:1.Preferivelmente, o processo de acordo com a invenção é realizado com ra-zões em volume de água : solvente orgânico de 20 : 80 a 80 : 20, particular-mente com razões de volume de 50 : 50 a 70 : 30.

As relações em peso apropriadas de rutinosídeo : (água + sol-vente orgânico) para o processo de acordo com a invenção são razões de0,001 : 99,999 a 40 : 60. Preferivelmente, o processo de acordo com a in-venção é realizado com razões em peso de rutinosídeo : (água + solventeorgânico) de 0,005 : 99,995 a 20 : 80, particularmente com razões em pesode 0,5 : 99,5 a 10 : 90.

As razões em peso apropriadas de enzima : rutinosídeo para oprocesso de acordo com a invenção são relações de 0,005 : 99,995 a 50 :50. Preferivelmente, o processo de acordo com a invenção é realizado comrelações em peso de enzima : rutinosídeo de 0,5 : 99,5 a 30 : 70, particular-mente com relações em peso de 2 : 98 a 20 : 80.

O progresso ou final da reação podem ser verificados, porexemplo, por meio de uma cromatografia de camada fina (TLC).

Após a reação estar completa, a mistura de reação consisteprincipalmente em água, solvente orgânico, tampão (por exemplo citrato desódio), enzima, quantidades pequenas de rutinosídeo não-reagido, ramnose,glicopiranosídeo, quantidades pequenas de aglicona de rutinosídeo e, seapropriado, quantidades pequenas de glicose. Os produtos de reação dese-jados ramnose e glicopiranosídeo são isolados de acordo com processoscomuns. "Trabalho comum" no contexto da presente invenção é entendidocomo significando o seguinte:

Preferivelmente, o solvente orgânico é destilado sob pressãoreduzida. O glicopiranosídeo assim cristalizando, que pode conter, porexemplo, quantidades pequenas de rutinosídeo e sua aglicona, é separadoda mistura de reação restante, por exemplo, por filtragem sob sucção ou fil-tragem sob pressão reduzida ou por centrifugação dos cristais precipitados.O sólido é subseqüentemente lavado, preferivelmente com água, e entãoseco. A pureza do glicopiranosídeo obtido quando usando rutinosídeo puro écomumente maior que 94%. Para outra purificação, ele pode ser recristaliza-do, por exemplo, de solventes apropriados, por exemplo de água ou demisturas de solvente consistindo em tolueno e metanol ou consistindo emágua e acetato de metila.

Água, tampão, enzima, quantidades pequenas de rutinosídeo,quantidades pequenas de sua aglicona e, se apropriado, glicose, assimcomo o produto de reação desejado ramnose permanecem no filtrado.

O isolamento da ramnose permanecendo no filtrado pode serobtido por meio de processos conhecidos, por exemplo por ultrafiltragem,por passagem do filtrado sobre trocadores de cátion e/ou ânion, por cristali-zação e por meio de separação mecânica, como filtragem. Glicose que podeestar presente no filtrado também pode ser removida, por exemplo, por fer-mentação de levedura.

As substâncias obtidas nas etapas de trabalho, como os sol-ventes orgânicos, a enzima ou o tampão, por exemplo citratos de sódio, po-dem ser recirculadas e assim usadas para outras reações.A análise dos produtos de reação pode ser realizada por HPLC,por exemplo usando equipamento HPLC padrão e colunas contendo materi-ais em fase reversa com um revestimento de alquila Cie.

Os seguintes exemplos destinam-se a ilustrar a presente inven-ção. No entanto, não devem em nenhum caso ser considerados como Iimi-tativos.

EXEMPLOS

As fontes de suprimento para as substâncias usadas são como aseguir:

Rutina: Merck KGaA1 item n° 500017

Naringinase: Sigma, item n° N-1385

Hesperidinase: Amano, item n0 HPV 12519

Ácido cítrico monoidratado Merck KGaA, item n° 100243

Solução de hidróxido de sódio Merck KGaA, item n° 105587

Acetato de metila Merck KGaA, item n° 809711

A reação é verificada por meio de cromatografia de camada fina(TLC) e os produtos de reação são analisados por meio de HPLC.Condições TLC

Placas TLC pré-revestidas: Sílica gel 60 (Merck KgaA,Item n° 105719)

Eluente: mistura de acetato de etila: etil metilcetona : ácido fórmico: água : 1-butanol na relação em volume de50:30:10:10:5

Reagente de pulverização: iodo/ácido sulfúrico

Detecção: luz UV (254 nm)

Valores Rf: rutina: 0,38

Isoquercetina: 0,61

Quercetina: 0,96

Condições HPLC usando uma unidade HPLC padrão:

Cartucho: LiChroCart® 2504/4 com

Coluna: LichroSorb® RP18 (material em fase<table>table see original document page 12</column></row><table>

EXEMPLO 1

3,15 g de ácido cítrico monoidratado são dissolvidos em 150 mlde água desionizada completamente a ajustados a um pH de 6,6 usando 10g de solução de hidróxido de sódio aquoso a 32% . 150 ml de acetato demetila são subseqüentemente adicionados e 5,0 g de rutina e 0,5 g de narin-ginase são introduzidos sob uma atmosfera de nitrogênio com agitação (200revoluções/minuto). A mistura de reação é então agitada em uma temperatu-ra de reação de 40°C durante 24 h. Após trabalho comum, ramnose e 3,82 gde cristais amarelos são obtidos. A análise dos cristais amarelos por meio deHPLC resulta na seguinte composição:

rutina 1,2 por cento em área

isoquercetina 94,4 por cento em área

quercetina 2,6 por cento em área

EXEMPLO 2

0,32 g de ácido cítrico monoidratado são dissolvidos em 150 mlde água completamente desionizada, e 150 ml de acetato de metila são adi-cionados. A emulsão é subseqüentemente ajustada a um pH de 5,0 usando2,5 g de solução de hidróxido de sódio 1 normal aquosa, e 5,0 g de rutina e0,125 g de hesperidinase são introduzidos sob uma atmosfera de nitrogênio.A mistura de reação é então agitada (250 revoluções/minuto) a uma tempe-ratura de reação de 40°C durante 21 h. Após trabalho comum, ramnose e3,41 g de cristais amarelos são obtidos. A análise dos cristais amarelos pormeio de HPLC resulta na seguinte composição:

rutina 0,1 por cento em área

isoquercetina 98,0 por cento em área

quercetina 0,2 por cento em área

EXEMPLO 3

6,37 g de ácido cítrico monoidratado são dissolvidos em 300 mlde água completamente desionizada, e ajustados a um pH de 6,6 com11,33 g de solução de hidróxido de sódio aquosa a 32%. 300 ml de acetatode metila são subseqüentemente adicionados e 20,11 g de mistura de mate-rial de partida que consiste em 53,5 por cento em área de rutina, 39,8 porcento em área de isoquercetina e 0,4 por cento em área de quercetina (resí-duo de licor-mãe de produção de rutina) e 1,11 g de naringinase são introdu-zidos sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação é então agitada(200 revoluções/minuto) a uma temperatura de reação de 40°C durante 46 h.Após trabalho comum, ramnose e 14,18 g de cristais amarelos são obtidos.

A análise dos cristais amarelos por meio de HPLC resulta na seguinte com-posição:

rutina 0,5 por cento em área

isoquercetina 92,0 por cento em área

quercetina 4,7 por cento em área

EXEMPLO DE COMPARAÇÃO

12,6 g de ácido cítrico monoidratado são dissolvidos em 600 mlde água completamente desionizada e ajustado a pH 6,6 com 40 g de solu-ção de hidróxido de sódio aquosa a 32%. 10,0 g de rutina e 1,0 g de naringi-nase são subseqüentemente introduzidos sob uma atmosfera de nitrogêniocom agitação (200 revoluções/minuto). Após agitar a 36°C durante cerca de24 h, isoquercetina e rutina estão presentes na mistura de reação em umarelação de cerca de 2 :1. A mistura de reação é agitada a 36°C durante mais7 h e a 40°C durante 22 h e então resfriada a 15°C. Após trabalho comum,ramnose e 7,25 g de cristais amarelos são obtidos. A análise dos cristaisamarelos por meio de HPLC resulta na seguinte composição:

<table>table see original document page 14</column></row><table>

O exemplo de comparação mostra que em uso de água sozinhacomo solvente, cristais amarelos menos sólidos são obtidos, que além dissocontém mais material de partida e mais subprodutos do que em uso de umamistura de solvente que consiste em água e um solvente orgânico.

Claims

1. Processo para a clivagem enzimática de rutinosídeos paraobter ramnose e/ou os glicopiranosídeos correspondentes, caracterizadopelo fato de que a reação é realizada na presença de uma mistura de sol-vente de água e um ou mais solventes orgânicos.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a reação é realizada a uma temperatura de reação de 15 a 80°C.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a reação é realizada a um pH de 3 a 8.

4. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, ca-racterizado pelo fato de que o pH é ajustado com a ajuda de um sistematampão.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que o pH é ajustado com a ajuda de tampão de citrato aquoso.

6. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, ca-racterizado pelo fato de que a reação é realizada na presença de um oumais dos solventes orgânicos, ésteres de ácido acético, metanol, etanol,metil terc-butiléter, tolueno.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que a reação é realizada na presença de um ou mais ésteres de áci-do acético.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que a reação é realizada na presença de acetato de metila.