KR102528136B1

KR102528136B1 - 이소케르세틴 및 알파-글리코실이소케르세틴의 제조방법

Info

Publication number: KR102528136B1
Application number: KR1020180000228A
Authority: KR
Inventors: 최병국; 정운계; 김관우; 남은식
Original assignee: 최병국
Priority date: 2018-01-02
Filing date: 2018-01-02
Publication date: 2023-05-02
Also published as: KR20190082524A

Abstract

본 발명은 이소케르세틴 및 α-글리코실이소케르세틴의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 루틴으로부터 효소적인 방법에 의하여 이소케르세틴을 제조함에 있어서, 반응계로부터 유리 람노오스를 제거하면서 반응을 진행시킴으로써 고 순도의 이소케르세틴을 제조하고, 이를 이용하여 산화방지제, 색소 안정화제, 향기변화 방지제, 자외선 흡수제, 체지방 감소제 등으로서 식품, 화장품 분야에 널리 사용되는 α-글리코실이소케르세틴을 경제적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

이소케르세틴 및 알파-글리코실이소케르세틴의 제조방법{Method for preparation of isoquercetin and α-glycosylisoquercetin}

본 발명은 이소케르세틴 및 α-글리코실이소케르세틴의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 산화방지제, 색소 안정화제, 향기변화 방지제, 자외선 흡수제, 체지방 감소제 등으로서 식품, 화장품 분야에 널리 사용할 수 있는 α-글리코실이소케르세틴과 그 중간체인 이소케르세틴을 높은 수율과 순도로 제조하는 방법에 관한 것이다.

식물유래의 플라보노이드(Flavonoid)는 노란색 계통의 색소로 페닐기 2개가 C3 사슬에 매개하여 C6-C3-C6형 탄소 골격구조로 되어 있으며, 이것이 여러 당류와 배당체(glycoside)로 결합하여 존재한다.

케르세틴(Quercetin)은 플라보노이드계 화합물들처럼 열에 대한 불안정성, 산화 조건에 대한 불안정성 및 물에 대한 낮은 용해도 등의 한계점이 있으나, 케르세틴의 배당체는 이러한 문제점을 감소시키고 생물학적 이용율이 증가하는 것으로 알려져 있다. 케르세틴-3-글리코시드(Quercetin-3-glucoside, isoquercetin)는 케르세틴보다 일반적으로 생물학적 이용율이 3배이상 증가하는 것으로 알려져 있다(Hollman P.C. et al., in man Free Radic Res., 31(6):569, 1999; Margreet R. Olthof et al., J. Nutr., 130:12001203, 2000).

또한 루틴(rutin), 이소케르세틴(isoquercetin), 헤스페레딘(hesperidine), 나린진(naringin), 네오헤스페레딘(neohesperedine) 과 같은 플라보노이드에 당을 부가하여 흡수성을 높이는 방법이 제안 (한국등록특허 10-1086441, 일본 특허공개공보 제2000-78956호 참조)되고 있으며, 회화나무 꽃 및 메밀의 주요 성분인 루틴(rutin)에 당을 전이시킨 α-글리코실루틴(α-glycosyl rutin)이 루틴보다 그 흡수성이 향상하는 것이 보고 되었다(일본 특허공개공보 2004-59522, Shimoi K. et al., J Agric Food Chem., 51, 2785-2789, 2003).

α-글리코실이소케르세틴이 고지방식이에 의해 비만이 유도된 마우스의 체중 감소에 미치는 연구에서 마우스의 체중, 내장 지방량, 그리고 혈중지표인 중성 지방, 총 콜레스테롤 및 유리지방산의 농도를 유의적으로 감소시켰다는 보고도 있다(Yeojin Min, et al., J Korean Soc Food Sci Nutr., 45(4), 474∼483(2016).

한편, 이소케르세틴(isoquercetin)은 케르세틴이나 루틴보다 생체 흡수성이 우수하지만 물에 난용성이므로 식품 등의 액상제품에 사용하는데 어려움이 있다. 이러한 문제점을 해소하기 위하여 당전이 효소(cyclodextrin glucano transferase)(E.C.2.4.1.19)를 사용하여 기질의 당 공여체로부터 글루코스 잔기를 당 수용체인 이소케르세틴의 글루코스 잔기 부위에 전이시킨 것이 α-글리코실이소케르세틴(α-glycosyl isoquercetin)이다. 대한민국등록특허 제1086441호 “α-글리코실이소퀘르시트린, 그의 제조 중간체, 및 부 생성물의 조제 방법”에는 ‘루틴(rutin)에서 효소적 방법으로 순도 높은 이소케르세틴을 만든 다음, 당전이효소를 이용하여 α-글리코실이소케르세틴을 제조하는 방법’이 개시되어 있다. 이때, 루틴으로부터 이소케르세틴을 생성하는 공정에 있어서, 나린긴 분해 활성을 가지는 효소로 처리하는 공정을 젤라틴, 밀 글루텐 등의 가식성 성분의 존재 하에서 수행하는 것을 특징으로 한다. 그러나 루틴으로부터 이소케르세틴을 제조할 때 수율을 높이고 추가적인 공정 없이 고순도의 이소케르세틴을 경제적으로 제조하고자 하는 과제는 여전히 남아 있다.

본 발명자들은 α-글리코실이소케르세틴과 그 중간체인 이소케르세틴의 제조방법에 관하여 연구하였으며, 루틴으로부터 이소케르세틴을 효소적인 방법에 의하여 제조할 때, 생성되는 람노오스를 반응계로부터 제거하면서 반응을 진행시키는 경우 높은 수율로 고순도의 이소케르세틴을 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 루틴으로부터 높은 수율로 고순도의 이소케르세틴을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 고순도의 이소케르세틴을 이용하여 α-글리코실이소케르세틴을 제조하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, (A)루틴을 나린긴 분해 활성을 갖는 효소로 처리하여 반응시키는 단계; (B)생성된 람노오스를 반응계에서 제거하면서 효소 반응시키는 단계; 및 (C)효소를 실활시킨 후 이소케르세틴을 수득하는 단계를 포함하는 이소케르세틴의 제조방법이 제공된다.

상기 루틴은 95~98%의 순도를 가지는 것이며, 바람직하게는 95%의 순도를 가지는 것이다.

상기 나린긴 분해 활성을 갖는 효소는 나린기나제, α-1,6-람노시다제, 헤스페리디나제 또는 펙티나제이며, 바람직하게는 나린기나제이다.

상기 (A), (B)단계에서 효소반응 조건은 pH 3.5∼8, 바람직하게는 3.5∼6, 반응온도 30℃∼80℃, 바람직하게는 40℃∼80℃이다.

상기 (B)단계에서 람노오스를 반응계에서 제거하는 방법으로는 원심분리법; 흡착법, 이온교환처리법, 겔 여과법과 같은 수지처리법; 한외막처리법, 역삼투막처리법, 이온교환막처리법과 같은 막처리법; 전기투석법; 용매재결정법; 및 활성탄처리법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 원심분리법이 사용된다.

바람직하게는 (A) a1)순도 95~98%의 루틴을 물에 분산시키고 pH 조정제를 사용하여 Ph3.5~8로 조정하는 단계; a2)나린긴 분해활성을 갖는 효소를 첨가하여 30~80℃에서 교반하면서 반응시키는 단계;

(B) b1)20~24시간 유지 후, 20~25℃로 냉각하여 원심 분리 후 상등액을 버리고, 침전물에 다시 물을 가하여 원심 분리한 후 상등액을 버리는 단계; b2)침전물을 물에 분산시키고 pH 조정제를 사용하여 pH3.5~8로 조정하고, 나린긴 분해활성을 갖는 효소를 첨가하여 30~80℃에서 교반하면서 반응시키는 단계; b3)20~24시간 유지 후, 20~25℃로 냉각하여 원심 분리후 상등액을 버리고, 침전물에 다시 물을 가하여 원심 분리한 후 상등액을 버리는 단계; b4)침전물을 다시 물에 분산시키고 효소 추가 투여 없이 30~80℃에서 교반하면서 20~24시간 반응시키는 단계; 및

(C)반응계에 남아있는 효소를 실활시킨 후 침전물을 물로 세척, 건조하여 이소케르세틴을 회수하는 단계를 포함하는 이소케르세틴의 제조방법이 제공된다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 상기 제조방법에 의하여 제조된 이소케르세틴을 당공여체의 존재하에 당전이 효소 처리하는 단계를 포함하는 하기 화학식으로 표시되는 α-글리코실이소케르세틴의 제조방법이 제공된다.

(n은0~12의 정수)

상기 당공여체는 덱스트린, 사이클로덱스트린 또는 전분이다. 상기 당전이 효소는 사이클로덱스트린 글루카노 트랜스퍼라아제(cyclodextrin glucanotransferase)이다.

바람직하게는 (A)상기에서 얻어진 이소케르세틴에 물을 가하고 pH 조정제로 pH 5~8.5로 조정 후 30~80℃로 1~2 시간 유지시키는 단계;

(B)당공여체를 첨가하여 분산시키고, 당전이효소를 첨가하여 pH 5~8.5, 30~80℃조건에서 20~24시간 반응시키는 단계; 및

(C)효소를 실활시킨 후, 여과, 농축, 건조시켜 α-글리코실이소케르세틴을 회수하는 단계를 포함하는 α-글리코실이소케르세틴의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 제조방법에 따르면, 루틴으로부터 효소적 방법에 의하여 이소케르세틴을 제조함에 있어서, 반응계에서 유리 람노오스를 제거하면서 효소 반응시키는 간단한 공정에 의하여 높은 수율로 고순도의 이소케르세틴을 제조할 수 있으므로 매우 경제적으로 α-글리코실이소케르세틴을 제조할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 α-글리코실이소케르세틴의 배당체 조성물 비율을 나타내는 분석도이다.

본 발명은 산화방지제, 색소 안정화제, 향기변화 방지제, 자외선 흡수제, 체지방 감소제 등으로서 식품, 화장품 분야에 널리 사용할 수 있는 α-글리코실이소케르세틴과 그 중간체인 이소케르세틴의 제조공정을 단순화하여 경제적으로 우수한 제조방법을 제공하는 것을 기술적 특징으로 한다.

하기 화학식으로 표시되는 이소케르세틴(isoquercetin, Quercetin-3-glucoside)은 케르세틴의 3-O-글루코시드이다. 망고(Mangifera indica), 대황(Rheum nobile), 회화나무(sophora japonica) 등의 다양한 식물 종에서 분리할 수 있다.

이소케르세틴은 우수한 항산화제로서 미백활성을 나타내며, 혈압을 낮추고 항암활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 또한, 이소케르세틴은 산화방지제, 색소 안정화제, 향기변화 방지제, 자외선 흡수제, 체지방 감소제 등으로서 식품, 화장품 분야에 널리 사용되는 α-글리코실이소케르세틴의 제조에 있어서 중간체가 된다. 이소케르세틴을 대량으로 제조하는 방법에는 화학적인 합성법, 효소법 등이 알려져 있다.

본 발명은 루틴을 출발물질로 하여 효소법에 의하여 이소케르세틴을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 종래 루틴에 람노시다제 효소를 처리하여 이소케르세틴을 제조할 때, 낮은 수율과 순도에 한계가 있다는 것을 발견하였다. 특히 반응계에 유리된 람노오스가 누적될수록 이소케르세틴으로의 전환 반응을 억제한다는 사실을 발견하였다.

위와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에 따르면, (A)루틴을 나린긴 분해 활성을 갖는 효소로 처리하여 반응시키는 단계; (B)생성된 람노오스를 반응계에서 제거하면서 효소 반응시키는 단계; 및 (C)효소를 실활시킨 후 이소케르세틴을 수득하는 단계를 포함하는 이소케르세틴의 제조방법이 제공된다.

상기 루틴은 95~98%의 순도를 가지는 것이며, 바람직하게는 95%의 순도를 가지는 것이다. 순도가 낮은 95%의 루틴을 사용하는 경우에 이소케르세틴으로의 전환율이 오히려 높다는 것을 확인하였다.

상기 나린긴 분해 활성을 갖는 효소로는 나린기나제, α-1,6-람노시다제(E.C.3.2.1.40), 헤스페리디나제 또는 펙티나제이며가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 α-L-람노시다제(alpha-L-rhamnosidase)와 베타 글루코시다제(beta glucosidase) 활성을 동시에 갖는 복합 효소제 나린기나제를 사용한다.

루틴 1 중량부에 대한 나린긴 분해 효소의 사용량으로는 이를 테면, 효소 역가가 150단위/g(1단위: pH3.5에서 30분 동안 1 mg의 람노오스에 상당하는 환원당을 생성할 때의 효소량)의 분해 효소를 사용할 경우, 1~20단위(0.006∼0.13 중량부) 범위로 사용할 수가 있고, 바람직하게는 1~15 단위(0.006∼0.1 중량부) 정도, 더 바람직하게는 1~10단위(0.006∼0.06 중량부) 정도이다.

또한 루틴의 반응농도는 반응계 100% 중량% 중에 1∼20 중량%, 바람직하게는 1∼15 중량%, 더 바람직하게는 1∼10 중량% 이다.

상기 (A), (B)단계에서 효소반응 조건은 pH 3.5∼8, 더욱 바람직하게는 3.5∼6, 반응온도 30℃∼80℃, 더욱 바람직하게는 40℃∼80℃이다. 온도 및 pH 조건은 사용하는 효소의 종류에 따라 다르지만, 나린기나제 "아마노"(150U/g)(일본) 또는 이에 준하는 나린긴 분해 효소를 사용할 경우, pH는 3.5∼8이고, 바람직하게는 3.5∼6 범위이다. 반응온도 조건도 사용하는 효소에 따라 다르지만, 80℃ 이하, 바람직하게는 30℃∼80℃, 보다 바람직하게는 40℃∼80℃이다.

반응계에서 유리 람노오스를 제거시키는 방법은 특별히 제한적이고 않고 관용의 방법을 임으로 조합하여 실시할 수 있다. 구체적으로는 원심분리법, 각종 수지처리법(흡착법, 이온교환처리법, 겔 여과법 등), 막처리법(한외막처리법, 역삼투막처리법, 이온교환막처리법), 전기투석법, 용매재결정법, 활성탄처리법 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 원심분리법이 사용된다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, (A) a1)순도 95~98%의 루틴을 물에 분산시키고 pH 조정제를 사용하여 Ph3.5~8로 조정하는 단계; a2)나린긴 분해활성을 갖는 효소를 첨가하여 30~80℃에서 교반하면서 반응시키는 단계;

상기의 이소케르세틴(IQC)의 제조방법에서 24시간 마다 반응계에 유리된 람노오스를 제거하는 경우 48시간 경과 후에는 거의 100%의 순도로 IQC를 얻을 수 있었으며, 72시간 경과 후에는 100%의 순도로 이소케르세틴을 얻을 수 있었다. 본 발명은 종래의 방법에 비하여 시간은 조금 더 소요될 수 있지만, 반응계에서 유리 람노오스를 제거하면서 반응을 지속하는 간단한 공정에 의하여 그 수율과 순도를 획기적으로 높일 수 있었다.

이소케르세틴(isoquercetin)은 케르세틴이나 루틴보다 생체 흡수성이 우수하지만 물에 난용성이므로 식품 등의 액상제품에 사용하는데 어려움이 있다. 이에 상기 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 상기 제조방법에 의하여 제조된 이소케르세틴을 당공여체의 존재하에 당전이 효소 처리하는 단계를 포함하는 하기 화학식으로 표시되는 α-글리코실이소케르세틴의 제조방법이 제공된다.

(n은0~12의 정수)

여기서 IQC의 배당화에 사용되는 전이효소는 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase)(E.C.2.4.1.19) 이다. 상기 당전이 효소는 상업적으로 입수할 수 있는 효소이다. 시판되는 효소로는 상품명 Toruzyme 3.0L(3.0KNU/g, One Kilo Novo alpha-amylase Unit (1KNU):시간당 전분 5.25g을 분해할때의 효소량, Novozymes), α-Amylase G "Amano L"(400U/g, 1U:전분으로부터 β-사이클로덱스트린을 1분간 1mg 생성하는 효소량, Amano Enzyme Inc.)를 예시할 수 있다

사용되는 효소의 양은 효소에 따라 다르지만, 상품명 Toruzyme 3.0L(3.0KNU/g, One Kilo Novo alpha-amylase Unit (1KNU): 시간당 전분 5.25g을 분해할때의 효소량, Novozymes)인 경우 기질(당공여체) 1 중량부에 대하여 통상 20∼400단위(0.0066∼0.13 중량부), 바람직하게는 40∼350단위(0.013∼0.12중량부), 보다 바람직하게는 70∼250단위(0.02∼0.08 중량부) 정도이다.

배당화에 이용되는 당공여체로는 덱스트린, 사이클로덱스트린, 전분 등을 들 수 있다. 사용량은 반응계에 존재하는 IQC 1중량부에 대하여 통상 0.1∼20 중량부의 비율, 바람직하게는 0.4∼15 중량부, 보다 바람직하게는 0.4∼10 중량부 정도이다.

반응조건은 효소의 종류에 따라 다르지만, 예를 들어 85℃이하, 바람직하게는 30∼80℃, 바람직하게는 40∼75℃, pH3∼10, 바람직하게는 pH5∼8.5에서, 상기의 당공여체의 존재 하에 전이효소를 작용시킴으로써 조제할 수 있다. 상기 반응은 정치, 교반 또는 진탕하면서 행할 수 있다.

또한, α-글리코실이소케르세틴의 글루코오스 잔기의 결합수(상기 화학식의 n의 수)는 제한되지 않지만 보통은 1∼12, 바람직하게는 1∼7, 더 바람직하게는 1∼5이다. 이러한 글루코오스기의 결합수(n의 수)는 임의로 조정할 수가 있다. 특히 1∼3의 몰비율이 높아지게 할 수가 있다. 예를 들면, α-글리코실이소케르세틴의 생성 후에 각종 아밀라제(α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제 등)을 사용하여 1∼3의 몰비율이 높아지게 할 수가 있다. 상기 아밀라제를 처리한 반응계로부터 α-글리코실이소케르세틴을 단리, 정제할 수도 있다. α-글리코실이소케르세틴의 회수는 관용의 여러 가지 방법으로 할 수가 있으며, 예를 들어 각종 수지처리법(흡착법, 이온교환처리법, 겔 여과법 등), 막처리법(한외막처리법, 역삼투막처리법, 이온교환막처리법), 전기투석법, 용매재결정법, 활성탄처리법 등에 의해 수행할 수 있다.

일 구체예에 따르면 (A)상기에서 얻어진 이소케르세틴에 물을 가하고 pH 조정제로 pH 5~8.5로 조정 후 30~80℃로 1~2 시간 유지시키는 단계;

본 발명의 제조방법에 따르면, 중간체인 이소케르세틴을 간단한 공정에 의해 고수율, 고순도로 제조할 수 있으므로, 최종 산물인 α-글리코실이소케르세틴을 경제적으로 제조할 수 있다.

[실시예]

이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들은 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 통상의 기술자들에게는 당연할 것이다.

비교예 1: 이소케르세틴의 제조

순도 약 95% 루틴 30g을 물 400mL에 분산시키고 pH 조정제(1N NaOH, 0.01N HCl)를 사용하여 pH4.5로 조정하였다. 이에 나린기나제(Amano Enzyme Inc. 상품명 Naringinase Amano, 150U/g)를 0.6g(3단위*30g/150단위=0.6g)을 첨가하여 70℃에서 교반하면서 24시간 유지한 후, 95℃에서 반응계에 남아 있는 효소를 실활시킨다. 얻어진 침전물(고형분)을 물로 세척, 건조하여 이소케르세틴을 회수하였다.

비교예 2: 이소케르세틴의 제조

순도 약 95% 루틴 30g을 물 400mL에 분산시키고 pH 조정제(1N NaOH, 0.01N HCl)를 사용하여 pH4.5로 조정하였다. 이에 나린기나제(Amano Enzyme Inc. 상품명 Naringinase Amano, 150U/g)를 0.6g(3단위*30g/150단위=0.6g)을 첨가하여 70℃에서 교반하면서 48시간 유지 한 후, 95℃에서 반응계에 남아 있는 효소를 실활시킨다. 얻어진 침전물(고형분)을 물로 세척, 건조하여 이소케르세틴을 회수하였다.

비교예 3: 이소케르세틴의 제조

순도 약 95% 루틴 30g을 물 400mL에 분산시키고 pH 조정제(1N NaOH, 0.01N HCl)를 사용하여 pH4.5로 조정하였다. 이에 나린기나제(Amano Enzyme Inc. 상품명 Naringinase Amano, 150U/g)를 0.6g(3단위*30g/150단위=0.6g)을 첨가하여 70℃에서 교반하면서 72시간 유지 한 후, 95℃에서 반응계에 남아 있는 효소를 실활시킨다. 얻어진 침전물(고형분)을 물로 세척, 건조하여 이소케르세틴을 회수하였다.

비교예 4: 이소케르세틴의 제조

순도 약 98% 루틴 30g을 물 400mL에 분산시키고 pH 조정제(1N NaOH, 0.01N HCl)를 사용하여 pH4.5로 조정하였다. 이에 나린기나제(Amano Enzyme Inc. 상품명 Naringinase Amano, 150U/g)를 0.6g(3단위*30g/150단위=0.6g)을 첨가하여 70℃에서 교반하면서 24시간 유지 한 후, 95℃에서 반응계에 남아 있는 효소를 실활시킨다. 얻어진 침전물(고형분)을 물로 세척, 건조하여 이소케르세틴을 회수하였다.

비교예 5: 이소케르세틴의 제조

순도 약 98% 루틴 30g을 물 400mL에 분산시키고 pH 조정제(1N NaOH, 0.01N HCl)를 사용하여 pH4.5로 조정하였다. 이에 나린기나제(Amano Enzyme Inc. 상품명 Naringinase Amano, 150U/g)를 0.6g(3단위*30g/150단위=0.6g)을 첨가하여 70℃에서 교반하면서 48시간 유지 한 후, 95℃에서 반응계에 남아 있는 효소를 실활시킨다. 얻어진 침전물(고형분)을 물로 세척, 건조하여 이소케르세틴을 회수하였다.

비교예 6: 이소케르세틴의 제조

순도 약 98% 루틴 30g을 물 400mL에 분산시키고 pH 조정제(1N NaOH, 0.01N HCl)를 사용하여 pH4.5로 조정하였다. 이에 나린기나제(Amano Enzyme Inc. 상품명 Naringinase Amano, 150U/g)를 0.6g(3단위*30g/150단위=0.6g)을 첨가하여 70℃에서 교반하면서 72시간 유지한 후, 95℃에서 반응계에 남아 있는 효소를 실활시킨다. 얻어진 침전물(고형분)을 물로 세척, 건조하여 이소케르세틴을 회수하였다.

시험예 1: 이소케르세틴의 순도분석

하기의 방법으로 회수된 이소케르세틴의 함량을 분석하였다.

이소케르세틴(IQC) 분석방법

1)표준액 조제: IQC 표준품 약 20mg을 정밀히 달아 메탄올로 50mL volumetric flask로 채운 것을 표준액으로 한다.

2)검액 조제: 검체 20mg을 정밀히 달아 메탄올로 50mL volumetric flask로 채운 것을 검액으로 한다.

1)칼람: C18 column (4.6 m × 250 mm, 5 μm)

2)이동상: 아세토니트릴(Acetonirtile):물=18:82

3)검출기 및 파장: UV at 254 nm

4)유속: 0.8 mL/min

5)주입량: 10㎕

6)칼람온도: 상온

그 결과를 하기 표 1, 2에 나타내었다.

루틴 순도	비교예 1 (24시간)	비교예 2 (48시간)	비교예 3 (72시간)
루틴 순도	IQC 함량(%)
95%	42%	52%	53%

루틴 순도	비교예 4 (24시간)	비교예 5 (48시간)	비교예 6 (72시간)
루틴 순도	IQC 함량(%)
98%	30%	39%	42%

상기 표에서 확인되는 바와 같이, 순도가 상대적으로 낮은 95% 루틴을 출발물질로 하는 경우에 IQC 전환율이 보다 높게 나타남을 알 수 있다. 다만, 시간의 경과에 따른 전환율의 상승은 크지 않음을 확인할 수 있다.

실시예 1: 이소케르세틴의 제조

순도 약 95% 루틴 30g을 물 400mL에 분산시키고 pH 조정제(1N NaOH, 0.01N HCl)를 사용하여 pH4.5로 조정하였다. 이에 나린기나제(Amano Enzyme Inc. 상품명 Naringinase Amano, 150U/g)를 0.6g(3단위*30g/150단위=0.6g)을 첨가하여 70℃에서 교반하면서 24시간 유지하였다. 25℃로 냉각하여 원심 분리 후 상등액을 버리고, 침전물에 다시 물을 가하여 원심 분리한 후 상등액을 버린다.

다시 침전물을 물 400mL에 분산시키고 pH 조정제(1N NaOH, 0.01N HCl)를 사용하여 pH4.5로 조정하고, 나린기나제 0.3g(1.5단위*30/150=0.3g)을 다시 첨가하여 70℃에서 교반하면서 추가로 24시간 유지 한 후 95℃에서 반응계에 남아 있는 효소를 실활시킨다.

얻어진 침전물(고형분)을 물로 세척 후, 건조하고, 이소케르세틴을 회수하였다.

실시예 2: 이소케르세틴의 제조

순도 약 95% 루틴 30g을 물 400mL에 분산시키고 pH 조정제(1N NaOH, 0.01N HCl)를 사용하여 pH4.5로 조정하였다. 이에 나린기나제(Amano Enzyme Inc. 상품명 Naringinase Amano, 150U/g)를 0.6g(3단위*30g/150단위=0.6g)을 첨가하여 70℃에서 교반하면서 24시간 유지하였다. 25℃로 냉각하여 원심 분리후 상등액을 버린후, 침전물에 다시 물을 가하여 원심 분리한 후 상등액을 버린다.

다시 침전물을 물 400mL에 분산시키고 pH 조정제(1N NaOH, 0.01N HCl)를 사용하여 pH4.5로 조정하고, 나린기나제 0.3g(1.5단위*30/150=0.3g)을 다시 첨가하여 70℃에서 교반하면서 추가로 24시간 유지하고, 위와 동일하게 25℃로 냉각하여 원심 분리후 상등액을 버린후, 침전물에 다시 물을 가하여 원심 분리한 후 상등액을 버린다.

침전물에 다시 물 400mL에 분산시키고 나린기나제 추가 투여 없이 그냥 70℃에서 교반하면서 또 24시간 유지하고 한 후 95℃에서 반응계에 남아 있는 효소를 실활시킨다.

얻어진 침전물(고형분)을 물로 세척후, 건조하고, 이소케르세틴 22.5g을 회수하였다. 회수율은 99%이다.

시험예 2: 이소케르세틴의 순도분석

상기 시험예 1과 동일한 방법으로 회수된 이소케르세틴의 함량을 분석하였다.

그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

루틴 순도	실시예 1 (48시간)	실시예 2 (72시간)
루틴 순도	IQC 함량(%)
95%	96%	100%

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이, 효소 반응 24시간 마다 반응계에 유리된 람노오스를 제거하면서 반응을 시킨 경우에 48시간 경과 후(실시예 1)에는 96%의 IQC 함량을 나타내었으며, 72시간 후에는 100%의 IQC 함량을 나타내었다. 유리 람노오스의 제거 없이 효소 반응시킨 상기 표 1의 비교예 2(52%), 비교예 3(53%)의 결과와 비교해 볼 때, 현저한 차이를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 3: α-글리코실이소케르세틴의 제조

상기 실시예 2에서 얻어진 이소케르세틴 20g에 물 300mL의 물을 가하고 pH 조정제(1N NaOH, 0.01N HCl)를 사용하여 pH8.5로 조정 후 75℃로 약 한 시간 정도 유지시킨다. 그리고 전분 10g을 첨가하여 분산시키고, 전이효소 Toruzyme 3.0L(3.0KNU/g, Novozymes)를 기질(당공여체) 1 중량부에 대하여 200단위(15g*200단위/3000U=1g)인 1g을 반응계에 첨가 후 pH8.0, 온도 75℃에서 24시간동안 반응시켰다. 수득된 반응액을 95℃에서 30분간 유지시켜 효소를 실활시켰다. 여과, 농축하여 분무건조시켰다. α-글리코실이소케르세틴 배당체 29g을 수득하였다.

시험예 3: α-글리코실이소케르세틴의 함량분석

이를 아래의 방법 즉, 일본 식품첨가물공전 효소처리 이소케르세틴(α-글리코실이소케르세틴) 함량 시험법으로 함량을 분석하였다.

흡광도가 0.3～0.7의 범위가 되도록 수득한 α-글리코실이소케르세틴을 정밀히 달아 물 50mL를 가하여 녹인 100mL로 한 다음 다시 이 액 1mL를 정확히 취하여 0.085% 인산용액을 가하여 100mL로 한 것을 시험용액으로 하였다.

따로, 루틴 표준품을 135℃에서 2시간 건조한 다음 약 0.2g을 정밀히 달아 메탄올 80mL를 가해주고 가열하여 녹이고 식힌 다음 메탄올을 가하여 100mL로 한 다음 다시 이 액 1mL를 취하여 0.085% 인산을 가하여 100mL로 한 것을 표준용액으로 하였다.

시험용액 및 표준용액에 대해서 0.085% 인산을 대조액으로 하여 파장 351nm 부근에서 흡광도 A1 및 A2를 측정하여 다음 계산식에 따라 효소처리 이소케르세틴의 함량(루틴환산양)을 구하고, 루틴환산양을 효소처리 이소케르세틴 함량으로 하였다.

A : 효소처리루틴의 함량(루틴 환산양)(%)

A1 : 시험용액의 흡광도

A2 : 표준용액의 흡광도

S : 검체의 채취량(mg)

R : 루틴표준품의 채취량(mg)

상기 방법으로 분석한 결과 α-글리코실이소케르세틴의 함량이 약 70%인 것으로 확인되었다.

시험예 4: α-글리코실이소케르세틴의 배당체 조성물 비율 분석

α-글리코실이소케르세틴 0.1g을 20% 에탄올로 녹인 후 100 mL가 되도록 하고, 위 용액을 취해 0.45μm membrane filter로 여과하여 시험용액으로 사용하였다.