KR20220074338A - 루틴글리코사이드의 제조방법 및 이를 포함하는 노화방지용 화장료 및 식품 조성물 - Google Patents

루틴글리코사이드의 제조방법 및 이를 포함하는 노화방지용 화장료 및 식품 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 루틴을 사이클로덱스트린계 화합물을 포접시키는 단계; 포접한 루틴/사이클로덱스트린 포접체(inclusion complex)를 기질로 하여 당전이효소인 글리코실라제를 반응시키는 단계;를 포함하는 루틴글리코사이드의 제조방법을 제공한다.

Description

루틴글리코사이드의 제조방법 및 이를 포함하는 노화방지용 화장료 및 식품 조성물{A PREPARATION METHOD OF RUTIN GLYCOSIDE, AND COSMETIC AND FOOD COMPOSITION FOR ANTIAGING COMPRISING THE SAME}
본 발명은 루틴글리코사이드 제조에 있어서 루틴/사이클로덱스트린 포접체를 기질로 하여 당전이효소인 글리코시다제(glycosidase)를 반응시킴으로써 전이율을 높이고, 루틴글리코사이드를 컬럼정제 할때에 분해효소인 아밀라제(amylase)류가 함유된 용액으로 세척함으로써 정제단계를 단순화하며, 제조된 루틴글리코사이드는 세포증식 및 콜라겐 증식 효능이 우수하여 노화방지용 화장료 및 식품 등으로 적용 가능한 루틴글리코사이드 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
천연물 유래의 기능성 화장품 및 기능성 식품 소재에 대한 관심도가 세계적으로 증가하면서 식물 성분, 추출물을 이용하여 성능이 개량된 소재를 발굴하려는 시도가 증가하고 있다.
루틴(rutin)은 운향과의 루타속 식물에서 발견된 플라보노이드의 하나로 일명 비타민 P로도 알려져 있으며, 콩과의 회화나무(Sophora japonica)의 꽃봉오리, 마디풀과의 메밀(Fagopyrum esculentum)의 식물에서 주로 추출되며 옥수수, 고구마, 망고, 당근, 토마토, 시금치, 케일 등에도 함유되어 있다.
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비타민 P, 즉 루틴은 혈관의 저항성을 강하게 하여 뇌출혈을 예방하는 중요한 성분으로 보고되어 있고, 혈관계 질환의 치료제로서 혈관의 지나친 투과성을 억제하는 약리효과도 가지고 있음이 공지되어 있다. 또한, 루틴은 체내 결합조직의 주성분인 콜라겐의 합성에 필요한 프롤린 및 리신의 히드록실화 반응, Fe2＋를 Fe3＋로 전환시키는 시토크롬 C의 산화-환원 반응, 혈액 중 백혈구의 증가에 따른 면역강화 기능 등에도 크게 관여하고 있다는 것도 공지되어 있고, 항암성, 항염증성, 항알러지성, 항바이러스성을 가지는 것으로 연구되어 있다.
그러나 이렇게 다양한 기능을 가진 루틴은 물에 대한 용해도가 매우 낮아 (약 0.01% 정도 용해) 실제 사용과 다양한 용도 확대가 제한되어 있다. 이를 극복하기 위하여, 루틴의 화학적 유도체를 만드는 방법(일본특허공보 제1,285/54호, 제 2,724/51호), 루틴에 효소를 이용한 당전이 글리코사이드를 만드는 방법(일본 특허공보 제 32,073/79호, 대한민국 등록특허 0158454) 등이 개발되었다. 그러나 루틴의 화학적 유도체는 안전성 문제 및 천연 소재가 아니라는 점, 루틴의 당전이 글리코사이드는 수용성 등 성능이 우수하나 물에서 반응함으로 인해 반응효율이 낮고 다단계의 반응 및 정제 프로세스를 거치는 단점을 가지고 있다.
본 발명의 목적은 식물로부터 추출된 루틴의 이용 가능성을 높이기 위한 루틴글리코사이드 제조에 있어서 반응 효율성을 높이는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 루틴글리코사이드 제조에 있어서 다단계의 제조공정을 단축하여 정제 효율성을 높이는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또다른 목적은 상기 루틴글리코사이드의 특정 분획으로 노화방지용 화장료 및 식품 조성물로서의 용도를 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 루틴글리코사이드 제조를 위한 당전이 반응에 있어서 사이클로덱스트린(cyclodextrin)계 화합물로 포접한 루틴을 글리코실라제(glycosylase)에 의한 당전이(glycosylation) 반응의 기질로 사용하여 당전이 효율을 향상시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 당전이 반응된 루틴글리코사이드 함유 반응액을 흡착수지(adsorption resin)이 충진된 컬럼에 흡착시키고 컬럼상에 직접 아밀라제(amylase) 계통의 효소용액을 처리함으로써 제조단계를 단축시킨 정제방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 루틴글리코사이드 정제방법으로 제조된 루틴모노글리코사이드(mono-glycoside) 및 루틴디글리코사이드(di-glycoside)를 함유하는 노화방지용 화장료 및 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 루틴글리코사이드 제조에 있어서 반응 효율성을 높일 수 있고, 루틴글리코사이드 제조에 있어서 다단계의 제조공정을 단축하여 정제 효율성을 높일 수 있으며, 루틴글리코사이드의 특정 분획으로 노화방지용 화장료 및 식품 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 루틴/사이클로덱스트린 기질의 반응공정을 도시한 블록도이다.
도 2는 루틴글리코사이드의 통상적인 제조공정 및 본 발명의 공정의 비교한 흐름도이다.
도 3은 루틴글리코사이드의 당분해 효소별 처리에 따른 반응 중의 HPLC 프로파일을 보인 그래프이다.
도 4는 본 발명에 의한 루틴/사이클로덱스트린 포접체를 이용한 루틴글리코사이드의 제조방법을 보여주는 순서도이다.
도 5는 본 발명에 의한 루틴글리코사이드의 흡칙수지에 흠착시키고 아밀라제 계통의 효소로 당을 분해하는 단축된 루틴글리코사이드의 제조방법을 보여주는 순서도이다.
도 6은 루틴글리코사이드 제조시 베타아밀라제를 처리하여 루틴모노글리코사이드와 루틴디글리코사이드를 동시에 함유하는 루틴글리코사이드의 HPLC 분석 프로파일이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1) 루틴글리코사이드 제조를 위한 당전이 반응에 있어서 사이클로덱스트린(cyclodextrin)계 화합물로 포접한 루틴을 글리코실라제(glycosylase)에 의한 당전이(glycosylation) 반응의 기질로 사용하여 당전이 효율을 향상시키는 방법.
루틴은 글리코실라제, 좀더 상세하게는 사이클로덱스트린 트랜스글리코실라제(cyclodextrin transglycosylase, cyclodextrin glucanotransferase, CGTase)와 같은 당전이 효소에 의해 전분, 텍스트린, 사이클로덱스트린과 같은 당공여체(glucose donor)로부터 포도당 잔기를 결합시킨 당전이체를 형성할 수 있다. 이와 같은 효소의 당전이 반응은 주로 수용액상에서 이루어져, 루틴의 용해성이 반응에 많은 영향을 미치며, 난용성인 루틴의 단점을 극복하기 위하여 반응액의 pH를 조정하는 방법, 반응액에 알코올류와 같이 루틴이 용해될 수 있는 유기용매를 첨가하는 방법 등이 사용될 수 있다. 그러나 pH를 조정하는 방법은 주로 중성에서 작용성이 좋은 글리코실라제의 활성에 영향을 미칠수 있으며, 알코올류를 첨가하는 방법은 알코올류를 과다하게 첨가하면 효소활성이 억제되고 적게 첨가하면 루틴의 용해성에 큰 영향을 미치지 못하여 사용에 한계가 있다.
루틴은 소수성이 큰 물질로서 사이클로덱스트린계 화합물과 결합하여 포접함으로써 용해성이 변화된 구조를 갖을 수 있다. 사이클로덱스트린계 화합물은 환상형의 도넛 구조로 이루어져 있고 내측에 소수성 공동을, 분자 외부에는 친수성을 갖는 독특한 특성을 가지고 있다. 이러한 특성으로 인해 내측 공동에 각종 소수성 유기화합물을 인식하여 우수한 물성의 포접체를 형성하여 불안정한 물질을 안정화하거나 용해도의 변화에 의한 용도 확대뿐 아니라, 특정 물질만을 인식하여 용이하게 분리할 수 있는 특징이 있다. 본 발명에 따르면 사이클로덱스트린에 포접된 루틴 포접체는 물에 대한 용해/분산성이 향상될 뿐 아니라 포접에 작용한 사이클로덱스트린은 그 자체가 글리코실라제의 당전이 기질로 작용될 수 있어 효과적으로 당전이 반응에 사용되는 장점을 갖는다.
상기 사이클로덱스트린계 화합물은 포접체 역할로는 하이드록시프로필 사이클로덱스트린, 카르복시메틸 사이클로덱스트린 등과 같은 다양한 유도체, 중합체 등이 사용가능하나, 본 발명에서와 같이 당전이 기질로 작용하기 위해서는 바람직하기로 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 감마-사이클로덱스트린을, 더욱 바람직하게는 베타-사이클로덱스트린, 감마-사이클로덱스트린을 사용하는 것이 적당하다.
이러한 루틴/사이클로덱스트린 포접체를 이용한 루틴의 당전이 반응에 의한 루틴글리코사이드 제조는 루틴과 사이클로덱스트린 화합물을 포접시키는 단계, 포접된 루틴/사이글리코사이드을 함유한 용액에 글리코실라제를 반응시키는 단계로 구성된다. 도 1은 본 발명에 의한 루틴/사이클로덱스트린을 이용한 루틴글리코사이드의 반응방법을 단계별로 나타낸 도면이다.
이하, 도 1을 참조하여, 본 발명에 의한 루틴글리코사이드의 추출방법을 단계별로 더욱 상세히 설명한다.
루틴과 사이클로덱스트린의 포접은 통상의 포접방법, 즉 알코올과 같은 유기용매에 루틴을 용해시키고 이를 사이클로덱스트린이 용해되어 있는 수용액에 첨가하고 농축하는 방법이나 포화농도 이상의 루틴, 사이클로덱스트린을 반죽하는 방법 등을 사용할 수 있다. 루틴과 사이클로덱스트린의 포접에서 루틴과 사이클로덱스트린의 비율은 1: 1 내지 1:10 중량비, 바람직하게는 1:2 내지 1: 4 중량비가 적당하다.
제조된 루틴/사이클로덱스트린 포접체는 별도로 건조, 회수하여 사용할 수도 있으나 포접체 용액을 그대로 효소반응에 사용하는 것이 효율적이다. 루틴/사이클로덱스트린 포접체를 기질로 한 당전이 효소반응은 20 내지 100℃의 온도, 바람직하게는 50 내지 100℃의 온도에서 통상적으로 6 내지 72시간, pH 4 내지 9의 조건에서 반응한다. 이때 글리코실라제는 중온성 내지 내열성 당전이효소를 통상적으로 0.1 내지 20% 농도로 사용할 수 있으며 시판되는 Novo사, Amano사 등의 글리코실라제 효소를 사용할 수 있다.
2) 당전이 반응된 루틴글리코사이드 함유 반응액을 흡착수지(adsorption resin)이 충진된 컬럼에 흡착시키고 컬럼상에 직접 아밀라제(amylase) 계통의 효소용액을 처리함으로써 제조단계를 단축시킨 정제방법.
루틴글리코사이드의 시장 제품은 루틴에 포도당이 한분자 첨가된 루틴모노글리코사이드로서 이의 일반적인 산업적 제조공정은 다음과 같다. 즉 루틴과 당공여체인 전분, 덱스트린 등의 수용액상에서 글리코실라제의 반응에 의해 루틴글리코사이드를 제조하고 반응후 가열에 의해 글리코실라제를 실활시킨 후 다시 약산성(pH4-4.5) 정도의 조건에서 글루코아밀라제(glucoamylase)를 처리함으로써 여러개의 당이 전이된 루틴글리코사이드 복합체를 루틴모노글리코사이드로 전환시킨다. 반응액은 다시 실활시킨후 통상 흡착수지가 충진된 컬럼에 투여하여 루틴모노글리코사이드를 흡착시킨 다음 물로 수세하고 알콜수용액으로 흡착된 루틴모노글리코사이드를 용리시키고 이를 농축하여 제품화하는 것이 일반적인 공정이다. 본 발명에서는 이러한 다단계의 제조공정을 단순화 하고자 하여, 상기에서 당전이 반응된 루틴글리코사이드 용액을 그대로 흡착수지가 충진된 컬럼에 투여하고 수세용액으로서 글루코아밀라제를 미량 함유한 용액을 사용함으로써 컬럼내에서 수세중에 루틴글리코사이드 복합체가 루틴모노글리코사이드로 전환될 수 있도록 하였다.
한편 이때 필요에 따라 글루코아밀라제 대신에 베타 아밀라제(beta- amylase)를 사용하여 루틴디글리세라이드가 함유된 산물을 제조할 수 있다. 이때 베타 아밀라제 통상적으로 0.001 내지 10% 농도로 사용할 수 있으며 시판되는 Novo사 등의 베타 아밀라제 효소를 사용할 수 있다. 도 2는 본 발명에 의한 루틴글리코사이드의 정제방법을 통상의 방법과 비교한 도면이다.
3) 상기 루틴글리코사이드 정제방법으로 제조된 루틴모노글리코사이드(mono-glycoside) 및 루틴디글리코사이드(di-glycoside)를 동시에 함유하는 노화방지용 화장료 및 식품 조성물.
글리코실라제에 의한 루틴글리코사이드 형성에 있어서 반응후 글루코아밀라제를 처리하면 루틴모노글리코사이드(mono-glycoside)가 형성되며 글루코아밀라제를 사용하는 대신에 베타 아밀라제를 사용할 경우는 루틴모노글리코사이드(mono-glycoside) 및 루틴디글리코사이드(di-glycoside)가 동시에 생성될 수 있다. 도 3은 글리코실라제에 의한 당전이 반응후 글루코아밀라제를 처리하면 루틴모노글리코사이드(mono-glycoside)가 형성되며 베타 아밀라제를 사용할 경우는 루틴모노글리코사이드(mono-glycoside) 및 루틴디글리코사이드(di-glycoside)가 동시에 생성하는 것을 HPLC로 분석한 자료이다.
이때, (a)는 루틴(R), (b)는 글리코실라제에 의한 루틴의 당전이(glycosylation) 산물, (c)는 당전이산물의 글루코아밀라제 처리산물인 루틴모노글리코사이드 (R1), (d)는 당전이산물의 베타-아밀라제 처리산물인 루틴모노글리코사이드 및 루틴디글리코사이드 (R2)이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 루틴모노글리코사이드(mono-glycoside) 단독 사용의 경우보다 루틴디글리코사이드(di-glycoside)가 같이 함유된 경우에 세포증식효능과 콜라겐합성능이 더 우수한 것을 확인할 수 있으며, 이를 이용하여 노화방지용 화장료 및 식품 조성물을 완성할 수 있다.
이때 루틴글리코사이드는 전체 조성물 중 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하나 함량의 제한은 없다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 루틴글리코사이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 루틴글리코사이드 이외에 식품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 점증제, 비타민 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 유형으로도 제조될 수 있으나 특히 액상 조성물이 적합하여 건강음료, 청량음료, 스포츠음료 등에 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명의 바람직한 시험예와 실시예를 기재한다. 그러나 하기한 예는 본 발명의 바람직한 일 예일 뿐 본 발명이 하기한 예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 루틴/싸이클로덱스트린 포접체를 이용한 루틴글리코사이드 당전이
루틴/싸이클로덱스트린 포접체를 제조하기 위하여 루틴 10g을 에탄올 300ml에 용해시키고 베타-사이클로덱스트린 30g을 90℃의 이온수 300ml에 용해시킨 용액에 혼합하고 교반 및 중류하여 포접체를 제조하였다. 포접체 용액을 100ml로 농축하고 글리코실라제(Novo사)를 2%(w/v) 가하여 60℃에서 24시간 동안 반응시켰다.
비교예로서 루틴과 싸이클로덱스트린 각각을 반응용액에 넣고 포접하지 않은 상태로 반응하였다. 즉 루틴 10g, 베타-사이클로덱스트린 30g을 이온수 100ml에 넣고글리코실라제(Novo)를 2%(w/v) 가하여 60℃에서 24시간 동안 반응시켰다.
또다른 비교예로서 루틴을 0.01N 수산화나트륨으로 알칼리상태에서 용해시킨 후 보다 전이가 우수한 기질인 말토덱스트린 용액과 반응하였다. 즉 루틴 10g을 pH 9의 이온수 100ml에 분산시킨 후 pH를 7로 다시 조정하고 말토덱스트린 30g을 넣고 글리코실라제(Novo사)를 2%(w/v) 가하여 50℃에서 24시간 동안 반응시켰다.
반응액은 HPLC를 이용하여 다음 조건에서 분석하여 생성된 루틴 글리코사이드를 확인하였다. (column: TSKgel 아민컬럼, mobile phase(gradient): DW 20-40%, ACN 80-60%, flow rate: 0.8ml/min, detection: UV 214nm).
시험 결과, 포접체를 기질로 사용한 경우는 루틴 사용량의 80% 이상이 루틴글리코사이드로 전환되었으나 루틴과 베타-사이클로덱스트린을 섞어서 반응한 경우는 매우 낮은 전환율을 확인하였다. 또 알칼리 상태에 용해한 루틴과 말토덱스트린을 반응한 경우도 포접체 기질을 사용한 것 보다 낮은 반응율을 나타내었다.
공정 반응율(%) 비고
루틴/베타-사이클로덱스트린 포접체 기질 82.2 -
루틴과 베타-사이클로덱스트린 혼합 기질 9.5 -
루틴과 말토덱스트린 혼합 기질 42.6 알칼리 용해
[실시예 2] 루틴글리코사이드의 정제단계 단축
도 2에 나타난 공정에 의해 루틴글리코사이드의 정제를 진행 하였다. 즉 다단계의 제조(정제) 공정을 단순화 하고자 하여, 상기에서 당전이 반응된 루틴글리코사이드 30ml을 100ml의 흡착수지가 충진된 컬럼에 투여하고 수세용액으로서 0.01% 글루코아밀라제(Novo사 AMG)를 함유한 이온수를 사용하여 SV 0.5의 속도로 500ml 수세를 진행하였다. 이후 50%(w/w) 에탄올 수용액 300ml을 가지고 용리하여 용리한 액을 감압농축 및 건조하여 정제된 루틴모노글리코사이드를 획득하였다.
비교예로서 상기와 동일한 당전이 반응된 루틴글리코사이드 30ml을 105℃에서 2시간 가열한 후 pH를 4.3으로 조정하고 글루코아밀라제를 0.1% 되도록 하여 5시간 반응하였다. 반응액은 다시 pH를 6.5로 조정하고 105℃에서 30분간 가열한 후 100ml의 흡착수지가 충진된 컬럼에 투여하고 이온수를 사용하여 SV 0.5의 속도로 500ml 수세를 진행하였다. 이후 50%(w/w) 에탄올 수용액 300ml을 가지고 용리하여 용리한 액을 감압농축 및 건조하여 정제된 루틴모노글리코사이드를 획득하였다.
시험 결과, 생성된 루틴글리코사이드의 94.7%가 회수되었으며, 정제공정 단계가 단축되었음에도 회수율은 동등이상임을 확인하였다.
공정 회수율(%) 비고
일반 공정 (비교예) 89.7 컬럼전 당분해
단축 공정 94.7 컬럼내 당분해
[실시예 3] 루틴디글리코사이드(rutin di-glycoside) 함유 루틴글리코사이드의 제조
실시예 2의 단축공정에 의한 방법과 동일하게 제조를 진행하였으며, 단 이때 글로코아밀라제 대신에 베타-아밀라제(Novo사 Secura)를 사용하여 수세를 진행하였다.
시험 결과, 생성된 루틴글리코사이드는 루틴모노글리코사이드와 루틴디글리코사이드를 같이 함유하는 것을 확인하였다.
공정 루틴모노글리코사이드(%) 루틴디글리코사이드(%)
베타-아밀라제 분해 56.4 38.2
글루코아밀라제 분해 92.6 0
제조된 루틴글리코사이드는 시험예를 통하여 세포증식 및 콜라겐 합성능을 비교하였다.
(시험예 1) 세포 증식능 평가
본 발명에 의해 제조된 루틴글리코사이드의 세포 증식능을 알아보기 위해 섬유아세포 증식능을 측정하였다.
2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)배지에서 배양한 사람의 섬유아세포를 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 5,000세포/well가 되도록 분주하였다. 이때 시료로 실시예 3에서 제조한 루틴글리코사이드(루틴모노글리코사이드와 루틴디글리코사이드 함유)를 사용하고, 비교군으로 루틴모노글리코사이드를 사용하였으며 대조군으로는 어스코르빅산과 토코페롤을 사용하였다.
상기 각 시료의 최종농도가 1 mg/ml이 되도록 조정하여 이를 섬유아세포에 처리하고 다시 4일 동안 배양하였다. 시료들의 배양을 완료한 후 0.2% MTT(3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltertazolium bromide) 용액을 각 웰(well)당 50㎕씩 첨가하고, 다시 37℃에서 4시간동안 배양한 후 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 사용하여 용해시켰다. 상기 용해된 포르마잔의 흡광도를 평판배양측정기(microplate reader)를 이용하여 570 nm에서 측정하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
시료농도(mM) 실시예3 루틴글리코사이드 루틴 모노글리코사이드 아스코르빅 산 토코페롤
1 × 10-6 102 100 100 100
1 × 10-5 100 100 101 102
1 × 10-4 102 100 103 103
1 × 10-3 112 103 110 105
1 × 10-2 119 104 109 105
1 × 10-1 124 115 97 101
표 4는 루틴글리코사이드 및 루틴모노글리코사이드, 아스코르빅 산, 토코페롤의 농도에 따른 세포 생존율을 보여주는 결과이다. 처리한 시료 모두 농도에 따라 세포 생존율이 약간 증가하는 경향을 보였으며, 특히 본 발명에 따른 루틴글리코사이드의 경우 저농도에서도 세포 증식이 현저하게 향상됨을 알 수 있으며 루틴 모노글리코사이드보다 다소 우수한 결과를 나타내었다.
(시험예 2) 콜라겐 증식능 평가
본 발명에 의해 제조된 루틴글리코사이드의 콜라겐 증식능을 알아보기 위해 하기와 같이 실시하였다.
콜라겐 합성정도의 측정은 인체 섬유아세포를 24공 평판 배양기에 배양한 후, 세포증 식에 사용한 시료와 동일한 시료를 사용하여 배양배지에 1/10씩 순차적으로 희석하여 첨가하였다. 이때 시료로 실시예 3에서 제조한 루틴글리코사이드(루틴모노글리코사이드와 루틴디글리코사이드 함유)를 사용하고, 비교군으로 루틴모노글리코사이드를 사용하였으며 대조군으로는 어스코르빅산과 토코페롤을 사용하였다.
배양 3일째 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM배지를 각 well당 0.5㎖씩 첨가한 후 L[2, 3, 4, 5-3H]-프롤린 10μCi를 첨가하였다. 24시간 후 각 well에 들어있는 배지와 세포들을 긁어모아 5% 트리클로로아세트산(TCA; Trichloroacetic acid) 용액에 넣어 수세한 후 2개의 시험관에 분주하고, 1개의 시험관에는 타입 I 콜라게나제(type I collagenase) 1 unit/㎕를 넣고 37℃ 온도에서 90분간 배양하였으며, 다른 시험관은 4 ℃에서 보관하였다.
그 후 모든 시험관에 50% TCA를 0.05㎖씩 첨가하고 4℃에서 20분간 방치한 후 각각 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 각각의 상등액과 침전물을 액체 신틸레이션 계수기(LSC; Liquid Scintillation Counter)로 디피엠(dpm; decay per minute) 값을 얻어 하기 수학식 1에 의거하여 콜라겐 생합성 값(RCB; Relative Collagen Biosynthesis)을 구하고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
Figure pat00002
시험 물질 농도(mM)
1x10-6 1x10-5 1x10-4
실시예3의 루틴글리코사이드 110 131 131
루틴모노글리코사이드 103 110 115
비타민 C 116 120 116
토코페롤 103 106 101
상기 표 5를 참조하면, 본 발명에 따른 루틴글리코사이드는 비교적 높은 콜라겐 증식율(%)을 보였으며, 실시예3의 루틴글리코사이드가 루틴모노글리코사이드 보다 우수한 결과를 나타내었다.
이하 본 발명의 실시예 3에서 제조된 루틴글리코사이드 포접체를 함유한 화장료 조성물의 구성을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명의 조성물이 이들 제형예에 한정되는 것은 아니다.
(제형예 1) 유연화장수(스킨로션)
배합성분 중량%
실시예 3의 루틴글리코사이드 5.0
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 2.0
카르복시비닐폴리머 0.1
피이지-12 노닐페닐에테르 0.2
폴리솔베이트 80 0.4
에탄올 10.0
트리에탄올아민 0.1
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
(제형예 2) 영양화장수(밀크로션)
배합성분 중량%
실시예 3의 루틴글리코사이드 5.0
스쿠알란 4.0
밀납 4.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄세스퀴올레이트 1.5
유동파라핀 0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
카르복시비닐폴리머 0.1
트리에탄올아민 0.2
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
(제형예 3) 마사지크림
배합성분 중량%
실시예 3의 루틴글리코사이드 5.0
밀납 10.0
폴리솔베이트 60 1.5
피이지 60 경화피마자유 2.0
솔비탄세스퀴올레이트 0.8
유동파라핀 40.0
스쿠알란 4.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0
글리세린 5.0
부틸렌글리콜 3.0
트리에탄올아민 0.2
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
(제형예 4) 팩
배합성분 중량%
실시예 3의 루틴글리코사이드 5.0
폴리비닐알콜 12.0
소듐카르복시메틸셀룰로오스 0.2
글리세린 5.0
알란토인 0.1
에탄올 6.0
핑지-12 노닐페닐에테르 0.3
폴리솔베이트 60 0.3
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
이하 본 발명의 실시예 3에서 제조된 루틴글리코사이드 포접체를 함유한 음료조성물의 구성을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명의 조성물이 이들 조성물예에 한정되는 것은 아니다.
(음료 조성 예) 음료 원료배합 조성
원료명 배합비율(%)
실시예 3의 루틴글리코사이드 5.0
솔비톨 13
유자엑기스 0.5
탄산수소나트륨 0.1
정제소금 0.15
비타민-C 0.1
구연산 2.5
정제수 to 100

Claims (7)

  1. 루틴을 사이클로덱스트린계 화합물을 포접시키는 단계;
    포접한 루틴/사이클로덱스트린 포접체(inclusion complex)를 기질로 하여 당전이효소인 글리코실라제를 반응시키는 단계;
    를 포함하는 루틴글리코사이드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 사이클로덱스트린계 화합물은 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 감마-사이클로덱스트린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 루틴글리코사이드의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    루틴과 사이클로덱스트린의 비율은 1:1 내지 1:10 중량비이며, 당전이 효소반응은 20 내지 100℃의 온도에서 6 내지 72시간, pH 4 내지 9인 조건에서 반응하고,
    글리코실라제는 중온성 내지 내열성 당전이효소를 0.1 내지 20% 농도로 사용하는 루틴글리코사이드의 제조방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 제조방법에 의해 제조된 루틴글리코사이드의 정제방법으로서,
    당전이 반응된 루틴글리코사이드 용액을 흡착수지가 충진된 컬럼에 투여하고, 수세용액으로서 아밀라제 계통의 효소를 함유한 용액을 사용함으로써 컬럼 내에서 수세 중에 루틴글리코사이드 복합체가 루틴모노글리코사이드 및 루틴디글리코사이드로 전환되도록 한 루틴글리코사이드의 정제방법.
  5. 제4항에 있어서,
    아밀라제 계통 효소는 글루코아밀라제(glucoamylase) 또는 베타 아밀라제(beta- amylase)를 0.001 내지 10% 농도로 사용하고,
    흡착수지는 Diaion HP20 또는 XAD-7의 비이온계 다공성수지로서, 흡착수지를 함유한 컬럼에서 10-90% 농도의 에탄올 또는 메탄올 수용액으로 루틴모노글리코사이드 및 루틴디글리코사이드를 용출시켜 회수하는 루틴글리코사이드의 정제방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 제조방법에 의해 제조된 루틴글리코사이드를 포함하며,
    루틴글리코사이드는 루틴모노글리코사이드 및 루틴디글리코사이드를 동시에 함유하는 노화방지용 화장료 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 제조방법에 의해 제조된 루틴글리코사이드를 포함하며,
    루틴글리코사이드는 루틴모노글리코사이드 및 루틴디글리코사이드를 동시에 함유하는 식품 조성물.
KR1020200162719A 2020-11-27 2020-11-27 루틴글리코사이드의 제조방법 및 이를 포함하는 노화방지용 화장료 및 식품 조성물 KR20220074338A (ko)

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