KR100923665B1 - 유효 물질의 추출방법 및 정제방법 - Google Patents

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Abstract

소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 및 사카라이드를 포함한 수용액을 극성 유기용매에 접촉시켜 수성 상 및 유기 상을 수득함으로서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 유기 상으로 이동되는 단계로 구성된 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 추출방법. 수용액의 사카라이드 농도는 100 ml의 수용액 당 적어도 12 g 이상이다. 수용액은 상 분리 보조제를 더울 포함한다. 상 분리 보조제는 염화나트륨, 구연산나트륨, 황산마그네슘 및 황산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된다.
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사카라이드, 극성, 유기용매, 추출, 정제, 페놀 유도체, 글리코시드

Description

유효 물질의 추출방법 및 정제방법{Method of extracting and method of purifying an effective substance}
본 발명은 지닌 소수성 그룹-함유 수용성 유기 화합물(즉, 효소 반응용액뿐만 아니라 동물 및 식물로부터 유도된 추출물)을 함유한 수용액으로부터 높은 순도 및 높은 수율로 소수성 그룹-함유 수용성 유기 화합물을 추출하는 방법에 관한 것이다.
비가공 약물 추출물에 의해 나타난 바와 같이 많은 다양한 생리학적 활성을 지닌 천연 화합물이 알려져 있다. 또한 이들 천연 화합물은 생리학적 활성 물질로 불린다. 많은 생리학적 활성 물질은 일반적으로 생리학적 활성 물질 및 물, 따뜻한 물 또는 저-농도 수성 알코올 용액을 함유한 물질을 이용하여 추출을 수행하여 추출 용액을 수득하고, 추출 용액을 농축하고, 농축된 추출 용액을 컬럼 크로마토그래피를 수행함으로서 정제된다. 그러나 이러한 정제방법은 많은 양의 생리학적 활성 물질을 생성하기 위해 수반되는 큰 컬럼 및 장치를 필요로 한다. 작은 컬럼은 매우 낮은 효율을 지닌다. 따라서 정제된 생리학적 활성 물질은 매우 고 가이다.
용매 추출방법에 의해 생리학적 활성 물질을 정제하는 시도들이 있었다. 그러나 에틸아세테이트, 부탄올 및 클로로포름과 같이 본래부터 물과 혼합할 수 없는 유기용매를 수용액에 첨가하고, 교반시키고, 정치시켜 용액을 2개의 상 즉, 수성 상 및 유기 용매 상을 수득하고, 유기용매 상으로 이동된 생리학적 활성 물질을 회수하는 방법은 안전상의 문제로 식품에 사용될 수 없다. 생리학적 활성 물질이 식품 이외에 적용되더라도 생리학적 활성 물질이 유의적으로 유기용매 상으로 이동되지 않기 때문에 일부 생리학적 활성 물질은 유기용매를 이용하면 비효과적으로 추출된다. 에탄올과 아세톤과 같은 일부 식품에 사용될 수 있는 유기용매가 물과 혼합될 수 없기 때문에 이드 유기용매는 수용액으로부터 생리학적 활성 물질을 추출하고 정제하는데 사용될 수 없다.
헤스페리딘(hesperidin)은 오렌지주스에 함유된 대표적인 플라보노이드(flavonoid)이다. 헤스페리딘으로 대표되는 플라보노이드는 예를 들어 하기에 논의된 생리학적 작용을 지닌 것으로 알려져 있다. 헤스페리딘 및 루틴(rutin)은 이전에 비타민 P로 불렸고, 혈압을 저하시키는 작용을 지닌 것으로 오랫동안 알려졌다(Shintoaro Kamiya, Shin-Vitamin-Gaku, [New Vitamin Study] (일본 비타민 협회) 1969, p439). 또한 헤스페리딘은 하기 생리학적 작용을 지닌 것으로 보고되었다 : 항-염증 작용, 진통 작용(E, M. Galati et al., Il Farmaco, 49, 709- 712(1994)), 항알레르기 작용(Hideaki Matsuda et al.; Yakugaku Zasshi [Journal of Pharmacology], 111, 193-198(1991), J. A. Da Silva Emim et al.; J. Pharm. Pharmacol., 46, 118-712(1994), LDL-콜레스테롤을 감소시켜 혈액 콜레스테롤 수준을 개선하는 작용(M. T. Monforte et al.; Il Farmaco, 50, 595-599(1995)) 및 발암정전기(carcinostatic) 작용(T. Tanaka, et al.; Cancer Research, 54, 4653-4659(1994), T. Tanaka, et al.; Cancer Research, 57, 246-252(1997), T. Tanaka, et al.; Carcinogenesis, 18, 761-769(1997), T. Tanaka, et al.; Carcinogenesis, 18, 957-965(1997)). 또한 최근 연구에서 헤스페리딘은 지방 전구체 세포의 분화를 증진시켜 당뇨병과 같은 상태를 개선시키는 작용이 있는 것으로 기대된다. 디오스민(diosmin)은 왕성한 산화방지 활성을 지닌다.
디오스민 및 헤스페리딘을 포함한 의약제는 정맥 기능부전, 치질 등에 대한 치료 약제로 사용된다(C. Labrid; Angiology, 45, 524-530(1994)). 또한 헤스페리딘 단독, 디오스민 단독 및 헤스페리딘과 디오스민의 혼합물이 구강암, 식도암, 직장암 등을 억제하는 것으로 보고되었다(T. Tanaka, et al.; Cancer Research, 54, 4653-4659(1994), T. Tanaka, et al.; Cancer Research, 57, 246-252(1997), Tanaka, et al.; Carcinogenesis, 18, 761-769(1997), T. Tanaka, et al.; Carcinogenesis, 18, 957-965(1997)).
나린진(naringin) 및 네오헤스페리딘(neohesperidin)은 감귤의 쓴 물질로 알 려져 있고, 쓴맛을 제공하는 목적으로 식품 및 음료수에 사용된다.
또한 최근 이소플라본은 골밀도를 효과적으로 증가시키고, 유방암 발병률 등을 억제하는 것으로 나타났다(Toda et al.; Foods and Ingredients Journal of Japan, No. 172, 83-89(1997)).
헤스페리딘 및 루틴은 본래 아세톤에 불용성이다.
반대로 헤스페리딘, 나린진, 네오헤스페리딘 및 루틴과 같은 플라보노이드는 약한 수용성이다. 이러한 결점 즉, 불충분한 용해성을 극복하기 위해 이들 약한 수용성 화합물을 효과적으로 용해시키는 시도가 이루어졌다. 예를 들어 효소 글리코실레이션(glycosylation)에 의한 헤스페리딘, 나린진 및 루틴과 같은 플라보노이드의 용해성을 증가시키는 방법이 알려져 있다(일본 특허공개공보 제7-107972호).
상술된 플라보노이드 이외에 동일한 목적으로 효소 글리코실레이션에 의한 카테킨, 카페인산, 코직산, 하이드로퀴논, 카테콜, 레조르시놀, 프로토카테쿠익산, 갈산, 바닐린, 다이드제인, 제니스테인, α-레소르실산 및 플로로글루시놀의 용해성 증가방법이 알려져 있다(일본 공보 제7-36758 및 T. Nishimura, J. Ferment. Bioeng., 78(1994) p37).
그러나 글리코시드 자체의 물 용해성이 증가되기 때문에 글리코시드는 물과 혼합할 수 없는 용매 내에서는 효과적으로 추출될 수 없다. 또한 안전상의 문제로 인해 흡착크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피가 글리코실레이션이 수행된 효소 반응용액으로부터 글리코시드를 정제하는데 요구된다.
통상의 정제 방법에서 천연물질로부터 일부 정제된 플라보노이드, 카테킨, 페놀 및 그의 글리코시드를 수득하기 위해 천연물질 및 알칼리성 수용액, 유기용매, 뜨거운 등을 이용한 추출을 수행한 후 컬럼 크로마토그래피에 의해 추출 용액을 정제하는 방법이 이용되었다. 그러나 식품에 사용될 수 있는 안전한 유기용매를 이용한 추출 및 정제는 높은 수율 및 저비용으로 많은 양의 이들 물질을 수득하는데 요구된다. 그러나 식품에 사용가능한 아세톤은 물과 혼합될 수 없기 때문에 아세톤을 이용하여 이들 물질을 추출하는 것은 불가능하다. 식품 및 약물 분야에서 효과적인 대부분의 생리학적 활성 물질은 물, 에탄올 및 아세톤과 같은 높은 극성 용매에 용이하게 용해될 수 있는 반면 낮은 극성 용매 내에서는 약하게 용해되는 특성을 지니고 따라서 낮은 극성 용매로부터 효과적으로 추출될 수 없다.
연구 결과, 본 발명자는 유기용매가 물 또는 뜨거운 물과 혼합되는 수성 상 으로부터 본래 분리되기 어려운 유기 용매를 사용하더라도 사카라이드와 같은 물 보유 능력을 지닌 물질이 생리학적 활성 물질을 함유한 수용액 내에 존재하면 수용액과 유기용매를 혼합하고 교반한 후 유기 상으로부터 수성 상을 용이하게 분리하는 것이 가능함을 발견하였다. 또한 본 발명자는 생리학적 활성 물질이 유기 상으로 이동되었음을 발견하였다. 또한 본 발명자는 염(즉, 염화나트륨 및 구연산나트륨) 또는 유기산을 첨가함으로서 수용액의 이온 강도를 증가시킴으로서 그렇지 않은 경우 수성 상으로부터 분리되지 않거나 사카라이드가 존재하더라도 수성 상으로부터 분리되는 것이 어려운 유기용매가 수성 상으로부터 분리될 수 있고, 생리학적 활성 물질이 유기용매 상으로 효과적으로 이동될 수 있음을 발견하였다. 이러한 발견에 기초하여 본 발명자는 본 발명을 완수하였다.
본 발명의 방법은 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 및 사카라이드를 포함한 수용액을 극성 유기용매와 접촉시켜 수성 상을 수득함으로서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 유기 상으로 이동되는 단계로 구성된 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 추출하는 방법이다.
하나의 실시태양에서 수용액의 사카라이드 농도는 수용액 100 ml 당 적어도 12 g 이상이다.
하나의 실시태양에서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 수용성 방향성 화합물이다.
하나의 실시태양에서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 페놀 유도체 및 그의 글리코시드(glycoside)로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 하이드로퀴논(hydroquinone) 글리코시드, 카테킨(catechin), 살리신(salicin), 헤스페리딘(hesperidin), 헤스페리딘 글리코시드, 카페인산(caffeic acid), 살리실알코올(salicyl alcohol) 및 엘라디탄닌(elladitannin)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서 수용액은 상 분리 보조제를 더욱 포함한다.
하나의 실시태양에서 상 분리 보조제는 염 또는 유기산이다.
하나의 실시태양에서 상 분리 보조제는 염화나트륨, 구연산나트륨, 황산마그네슘 및 황산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서 극성 유기용매는 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran) 또는 아세토니트릴(acetonitrile)이다.
하나의 실시태양에서 극성 유기용매는 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 아세톤 또는 이소프로필알코올이다.
하나의 실시태양에서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 효소 반응용액으로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 효소 반응용액은 글리코실레이션 반응용액이다.
하나의 실시태양에서 글리코실레이션 반응용액은 헤스페리딘 또는 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응용액이다.
하나의 실시태양에서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 동물 또는 식물로부터 선택된 생물체로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 과일주스로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 수용액은 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 및 사 카라이드를 포함한 효소 반응용액을 농축함으로서 제조된다.
하나의 실시태양에서 효소 반응용액은 글리코실레이션 반응용액이다.
하나의 실시태양에서 글리코실레이션 반응용액은 헤스페리딘 또는 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응용액이다.
하나의 실시태양에서 수용액은 생물체로부터 추출물을 농축하거나 희석함으로서 제조되고, 상기 추출물은 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물과 사카라이드를 포함하고, 상기 생물체는 동물 또는 식물임을 특징으로 한다.
하나의 실시태양에서 수용액은 과일주스를 농축함으로서 제조된다.
하나의 실시태양에서 수용액은 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물과 사카라이드를 포함한 효소 반응용액 또는 그의 농축액에 상 분리 보조제를 첨가함으로서 제조된다.
하나의 실시태양에서 효소 반응용액은 글리코실레이션 반응용액이다.
하나의 실시태양에서 글리코실레이션 반응용액은 헤스페리딘 또는 하이드로 퀴논 글리코실레이션 반응용액이다.
하나의 실시태양에서 수용액은 상 분리 보조제를 생물체의 추출물에 첨가함으로서 제조되고, 상기 추출물은 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물과 사카라이드를 포함하고, 상기 생물체는 동물 또는 식물임을 특징으로 한다.
하나의 실시태양에서 수용액은 과일주스 또는 그의 농축액에 상 분리 보조제를 첨가함으로서 제조된다.
본 발명의 정제방법은 1차 페놀 유도체, 페놀 유도체 글리코시드 및 사카라이드를 포함한 수용액을 극성 유기용매에 접촉시켜 1차 수성 상 및 적은 양의 물을 함유한 유기 상을 수득함으로서 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드가 유기 상으로 이동되고, 적은 양의 물을 함유한 유기 상으로부터 극성 유기용매를 회수하여 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드를 포함한 2차 수용액을 수득하고, 2차 수용액을 에틸아세테이트에 접촉시켜 2차 수용액과 에틸아세테이트 상을 수득함으로서 페놀 유도체가 에틸아세테이트 상으로 이동되고, 2차 수성 상을 회수하고, 2차 수성 상을 농축하고 냉각시켜 페놀 유도체 글리코시드를 침전시키는 단계로 구성된 페놀 유도체 글리코시드를 정제하는 방법이다.
하나의 실시태양에서 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드는 페놀 유도체 글리코실레이션 반응용액으로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서 글리코실레이션 반응용액은 헤스페리딘 또는 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응용액이다.
하나의 실시태양에서 1차 수용액은 상 분리 보조제를 더욱 포함한다.
하나의 실시태양에서 글리코실레이션 반응용액은 헤스페리딘 또한 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응용액이다.
본 발명의 효과는 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 및 사카라이드를 포함한 수용액을 극성 유기용매에 접촉시켜 수성 상 및 유기 상을 수득함으로서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 유기 상으로 이동되는 단계로 구성된 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 추출방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 여기에 사용된 바와 같이 농도는 언급하지 않는 한 용액의 100 ㎤ 당 그램 수로 표현된다. 예를 들어 "10% 염화나트륨 용액"은 용액 100 ㎤ 당 염화나트륨 10 g이 용해된 염화나트륨 용액을 나타낸 다.
본 발명에 따른 방법은 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 추출하는 방법이다. 본 발명의 방법은 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 및 사카라이드를 포함한 수용액을 극성 유기용매와 접촉시켜 수성 상을 수득함으로서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 유기 상으로 이동되는 단계로 구성된다.
(1) 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물
여기서 사용된 "소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물"은 소수성 그룹을 포함하고 수용성인 유기 화합물을 나타낸다.
여기서 사용된 "수용성" 화합물은 20℃에서 1 리터 물 내에 적어도 0.01 g 이상이 용해되는 화합물을 나타낸다. 바람직하게는 적어도 0.1 g 이상, 더욱 바람직하게는 1 g 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 5 g 이상, 가장 바람직하게는 10 g 이상의 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 20℃에서 1 리터의 물 내에 용해될 수 있다. 용해성에 대한 특정한 상한선은 없더라도 용해성은 20℃에서 1 리터의 물 내에 바람직하게는 300 g 이하이다. 더욱 바람직하게는 용해성은 20℃에서 1 리터의 물 내 100 g 이하이다.
소수성 그룹은 바람직하게는 적어도 3 이상의 탄소원자, 더욱 바람직하게는 방향성 잔기를 포함한 소수성 그룹이다. 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 예는 플라보노이드, 이소플라본, 페놀 화합물, 플라보노이드 글리코시드, 이소플라본 글리코시드, 페놀 화합물 글리코시드, 하이드로퀴논 글리코시드, 안트라센 글리코시드, 수용성 방향성 화합물(즉, 칼콘 글리코시드), 테르펜 글리코시드, 스테로이드 글리코시드, 트리테르페노이드 글리코시드, 알칼로이드 글리코시드 및 C-글리코시드를 포함한다. 바람직하게는 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 수용성 방향성 화합물이다.
여기서 사용된 "수용성 방향성 화합물"은 수용성이고 방향족을 지닌 화합물을 나타낸다.
수용성 방향성 화합물은 바람직하게는 페놀 유도체 및 그의 글리코시드로 구성된 군으로부터 선택된다.
"페놀 유도체"는 페놀 백본(backbone)(즉, 벤젠 고리) 또는 플라보노이드 백본을 지니고 페놀 및 코직산을 포함한 페놀 백본 또는 플라보노이드 백본에 결합된 하이드록실 그룹을 지닌 화합물을 나타낸다. 페놀 유도체의 예는 단일 페놀 또는 플라보노이드 백본 상에 하나의 페놀 하이드록실 그룹을 지닌 화합물 및 단일 페놀 또는 플라보노이드 백본 상에 적어도 2 이상의 페놀 하이드록실 그룹을 지닌 화합 물을 포함한다. 이후, 편이성을 위해 단일 페놀 또는 플라보노이드 백본 상에 하나의 페놀 하이드록실 그룹을 지닌 화합물은 모노페놀 타입 화합물이라고 명명하고, 단일 페놀 또는 플라보노이드 백본 상에 적어도 2 이상의 페놀 하이드록시 그룹을 지닌 화합물은 폴리페놀 타입 화합물이라고 명명한다.
단일 페놀 또는 플라보노이드 백본 상에 2개의 페놀 하이드록시 그룹을 지닌 화합물은 디페놀 화합물이라고 명명한다.
페놀 하이드록실 그룹을 지닌 페놀 유도체 글리코시드도 페놀 유도체에 포함된다.
단일 페놀 또는 플라보노이드 백본 상에 하나의 페놀 하이드록시 그룹을 지닌 모노페놀 타입 화합물의 예는 페놀, 살리실알코올, 코직산, 디메톡시페놀, 아세트아미노펜, 바닐린 및 다이드제인을 포함한다.
또한 모노페놀 화합물의 예는 모노페놀 타입 플라노이드 타입 화합물을 포함한다. 모노페놀 타입 플라보노이드 타입 화합물은 모노페놀 타입 플라본 타입 화합물, 모노페놀 타입 이소플라본 타입 화합물, 모노페놀 타입 플라보놀 타입 화합물, 모노페놀 타입 플라보논 타입 화합물, 모노페놀 타입 플라보노놀 타입 화합물, 모노페놀 타입 카테킨 타입 화합물, 모노페놀 타입 아우론 타입 화합물, 모노페놀 타입 칼콘 타입 화합물 및 모노페놀 타입 디하이드로칼콘 타입 화합물을 포함한다.
디메톡시페놀의 예는 2,3-디메톡시페놀, 2,4-디메톡시페놀, 2,5-디메톡시페놀, 2,6-디메톡시페놀, 3,4-디메톡시페놀 및 3,5-디메톡시페놀을 포함한다. 3,4-디메톡시페놀 및 3,5-디메톡시포놀이 바람직하다.
단일 페놀 또는 플라보노이드 백본 상에 적어도 2 이상의 페놀 하이드록시 그룹을 지닌 화합물은 폴리페놀 타입 화합물의 예는 하이드로퀴논, 헤스페리딘, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 안토시아니딘 타입 화합물, 안토시아닌 타입 화합물, 카페인산, 카테콜, 레소르시놀, 프로토카테쿠산, 갈산, 제니스테인, β-레소프실산 및 플로로글루시놀을 포함한다.
또한 디페놀 화합물의 예는 디페놀 타입 플라보노이드 타입 화합물을 포함한다. 디페놀 타입 플라보노이드 타입 화합물의 예는 디페놀 타입 플라본 타입 화합물, 디페놀 타입 이소플라본 타입 화합물, 디페놀 타입 플라보놀 타입 화합물, 디페놀 타입 플라보논 타입 화합물, 디페놀 타입 플라보노놀 타입 화합물, 디페놀 타입 카테킨 타입 화합물, 디페놀 타입 아우론 타입 화합물, 디페놀 타입 칼콘 타입 화합물 및 디페놀 타입 디하이드로칼콘 타입 화합물을 포함한다.
레소르실산이 예는 α-레소르실산, β-레소르실산 및 γ-레소르실산을 포함 한다. 본 발명에서 β-레소르실산이 바람직하다.
여기에 사용된 "페놀 유도체 글리코시드"는 페놀 유도체 모이어티(moiety)가 글리코시드 결합으로 하나 이상의 사카라이드 모이어티에 결합된 물질이다. 페놀 유도체 글리코시드는 사카라이드 모이어티가 상술된 모노-글루코피라노시드(즉, 헤스페리딘 유도체)에 부가적으로 결합된 모노-글루코피라노시드(즉, 하이드로퀴논-O-α-D-글루코피라노시드, 살리신, 카페인산-O-α-D-글루코피라노시드, 3,4-디메톡시페놀-O-α-D-글루코피라노시드 및 카테킨-O-α-D-글루코피라노시드), 디글루코피라노시드 및 트리글루코피라노시드 등이다.
여기에 사용된 "글루코시드"는 아글리콘이 글루코시드 결합으로 하나 이상의 사카라이드에 결합된 물질이다. 사카라이드 모이어티의 중합 정도는 바람직하게는 1∼10, 더욱 바람직하게는 1∼5 및 더욱 더 바람직하게는 1∼3이다. 여기서 사용된 바와 같이 글루코시드는 글루코시드의 정의 내에 포함된다. 글루코시드는 하나 이상의 글루코스 모이어티가 아글리콘에 결합된 글리코시드이다.
소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 바람직하게는 살리신, 코니페린, 알부틴, 센노시드, 스테비오시드, 룹소시드, 루틴, 헤스페리딘, 나린진, 다이드제인, 제니스틴, 발바로인, 바닐린, 사포닌스, 벨베린, 카엠프페롤, 바이칼린, 카필라린, 진제롤, 글리시린진, 디오스민, 네오헤스페리딘, 카페인산, 실리실알코올, 엘라디 타닌 및 하이드로퀴논을 포함한다. 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 더욱 바람직하게는 하이드로퀴논 글리코시드, 카테킨, 살리신, 헤스페리딘, 헤스페리딘 글리코시드, 카페인산, 살리실알코올 및 엘라디탄닌으로 구성된 군으로부터 선택된다.
소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 어떤 농도로도 수용액에 존재한다. 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 농도는 바람직하게는 0.01∼50%, 더욱 바람직하게는 0.1∼40%, 더욱 더 바람직하게는 1∼20%, 가장 바람직하게는 5∼15%이다. 수용액 내 존재하는 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 농도가 과도하게 낮으면 정제 효율은 불충분하다. 수용액 내에 존재하는 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 농도가 과도하게 높으면 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 침전된다. 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 침전하지 않는 농도가 바람직하다.
소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 포함한 효소 반응용액으로부터 유도된다. 여기에 사용된 바와 같이 효소 반응용액은 시작 물질을 효소 반응시킴으로서 수득된 용액을 나타낸다. 이러한 효소 반응용액의 예는 글리코레이션 반응용액, 가수분해 반응용액, 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물에 대한 이동 반응 및 농축 반응 용액을 포함한다. 효소 반응용액은 바람직하게는 사카라이드를 포함한다. 효소 반응용액은 일반적으로 반 응이 처리되고 반응 생성물이 생성된 후 반응용액이다.
글리코실레이션 반응의 예는 대표적으로 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제에 의해 촉매되는 글리코실 이동 수용체에 대한 글리코실 이동 반응을 나타낸다. 이러한 글리코실 이동 수용체의 예는 그의 구조 내 사카라이드를 포함한 플라보노이드, 그의 구조 내 사카라이드를 포함하지 않는 플라보노이드, 페놀 화합물 및 페놀 화합물 글리코시드를 포함한다. 대표적 글리코실 이동 수용체의 예는 헤스페리딘, 나린진, 네오헤스페리딘 및 루틴을 포함한다.
또다른 글리코실레이션 반응의 예는 이동 타입 아밀라제에 의해 촉매되는 글리코실 이동 수용체에 대한 글리코실 이동 반응이다. 이러한 글리코실 이동 수용체의 예는 카테킨, 카페인산, 코직산, 하이드로퀴논, 카테콜, 레소르시놀, 프로토카테쿠산, 갈산, 바닐린, 다이드제인, 제니스테인, α-레소르실산 및 플로로글루시놀을 포함한다.
글리코실레이션 반응용액은 바람직하게는 헤스페리딘 또는 하이드로퀴논의 글리코실레이션 반응용액이다.
효소 반응을 촉매하는 효소의 예는 사이클로덱스트린 글루카토트랜스퍼라제 및 이동 타입 아밀라제 외에 α-아밀라제, 플룰라나제, 아밀로말타제, D-효소, 네 오플룰라나제, 사이클로덱스트리나제, α-글로코시다제, 셀룰라제, β-글로코시다제 및 β-갈락토시다제를 포함한다.
소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 포함한 효소 반응용액은 당업자에게 알려진 방법에 의해 고안되고 수득된다.
소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 또한 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 포함한 어떠한 천연 물질로부터도 유도된다. 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 예를 들어 생물체(즉, 동물 또는 식물)로부터 유도된다. 대안으로, 동물 추출물 또는 식물 추출물이 사용될 수 있다. 동물 추출물은 동물로부터 추출된 어떠한 물질도 나타낸다. 식물 추출물은 식물로부터 추출된 어떠한 물질도 나타낸다. 예를 들어 식물의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매 등으로부터 수득된 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 사용될 수 있다. 식물 물질의 예는 대두, 가공된 대두 생성물, 해삼, 중국 오배자, 황금 뿌리(Scutellariae Radix), 알로에, 레흐마니아 뿌리(Rehamanniae Radix), 아시아 인삼(Panax ginseug), 작약 뿌리(Paeoniae Radix), 치자나무, 감초(Glycyrrhizae Radix), 부플레우럼 뿌리(Bupleuri Radix), 대황(Rhei rhizome), 어성초, 카우베리(Vaccinium vistis-idaea), 차, 스위트 티(중국 블랙베리 차; Rubus suanissm S. Lee) 및 감귤(즉 오렌지 열매)을 포함한다. 동물의 신체 내 존재하는 어떠한 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물도 사용될 수 있다.
(2) 사카라이드
여기서 사용된 사카라이드는 일반식 Cn(H2O)m을 지닌 화합물을 나타낸다. 사카라이드는 성분의 수 즉, 사카라이드 단위에 따라 모노사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드로 나뉜다. 본 발명에서 모노사카라이드 및 올리고사카라이드가 바람직하다. 본 발명에서 수용성이거나 또는 아닐 경우 물 보유 능력을 지닌 사카라이드가 바람직하다.
모노사카라이드의 예는 D-글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 아라비노스, 자일로스 및 람노스를 포함한다. 바람직한 모노사카라이드는 D-글루코스이다.
여기서 사용된 올리고사카라이드는 2∼10 모노사카라이드의 탈수-농축에 의해 수득된 물질이다. 올리고사카라이드는 바람직하게는 2∼9 사카라이드 단위, 더욱 바람직하게는 2∼8 사카라이드 단위, 더욱 더 바람직하게는 2∼7 사카라이드 단위를 지닌다. 올리고사카라이드의 예는 슈크로스, 락토스, 말토-올리고사카라이드, 갈락토-올리고사카라이드, 락토-올리고사카라이드 및 프럭토-올리고사카라이드를 포함한다. 말토-올리고사카라이드의 예는 말토스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스 및 말토헥사오스, 말토헵타오스, 말토-옥타오스, 말토노나오 스 및 말토데카오스를 포함한다. 올리고사카라이드는 직쇄 올리고사카라이드 또는 분쇄 올리고사카라이드이다. 올리고사카라이드는 분자내 고리 구조를 지닌다.
여기서 사용된 폴리사카라이드는 적어도 11 이상의 모노사카라이드의 탈수-농축에 의해 생성된 물질을 나타낸다. 폴리사카라이드는 바람직하게는 적어도 하나 이상의 α-1,4 결합을 지닌다. 폴리사카라이드의 예는 덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 전분, 덱스트란 및 셀룰로스를 포함한다.
덱스트린은 화학적 또는 효소적 방법에 의한 전분의 분자량을 감소시킴으로서 수득된 물질을 나타낸다. 덱스트린의 예는 브리티쉬 검, 황색 덱스트린, 백색 덱스트린, PINE-DEX(Matustani Chemical Industry Co., Ltd.) SUNDEX(Sanwa Cornstrarch Co., Ltd.) al Tetrup(Hayashibara Shoji, Inc.)를 포함한다.
아밀로스는 α-1,4 결합에 의해 결합된 글루코스 단위로 구성된 직쇄 분자이다. 아밀로스는 천연 전분에 포함된다.
아밀로펙틴은 글루코스 단위가 α-1,6 결합에 의해 결합된 α-1,4 결합에 의해 결합된 글루코스 단위로 구성된 분쇄 분자이다. 예를 들어 아밀로펙틴으로서 100% 아밀로펙틴으로 구성된 왁스성 옥수수 전분이 사용된다.
전분은 아밀로스와 아밀로펙틴의 혼합물이다. 전분으로서 일반적으로 통용되는 어떠한 전분도 사용된다. 전분 내 포함된 아밀로펙틴에 대한 아밀로스의 은 전분을 생성하는 식물의 타입에 다라 달라진다. 왁스성 쌀, 왁스성 옥수수 등에 포함된 대부분의 전분은 아밀로펙틴이다. 전분은 천연 전분, 전분 분해 생성물 및 가공된 전분으로 나뉜다.
천연 전분은 유도되는 원료 물질에 따라 괴경 전분 및 곡물 전분으로 나뉜다. 괴경 전분의 예는 감자 전분, 타피오카 전분, 고구마 전분, 칡 전분, 고사리 전분 등을 포함한다. 곡물 전분의 예는 옥수수 전분, 소맥 전분, 쌀 전분 등을 포함한다.
가공된 전분은 사용 용이성을 부여하기 위해 천연 전분을 가수분해, 에스테르화, 젤라틴화 등과 같은 처리함으로서 수득된다. 다양한 가공된 전분은 젤라틴화 시작되는 온도, 전분 죽의 점성도, 전분 죽의 투명도, 노화 안정성 등과 같은 다양한 특성의 결합을 지닌 것이다. 다양한 타입의 가공된 전분이 있다. 이러한 전분의 예는 전분의 젤라틴화 온도 이하의 온도에서 산에 전분 입자를 담궈서 전분이 분열되나 전분 입자는 분열되지 않도록 함으로서 수득된 전분이다.
전분 분해 생성물은 효소처리, 가수분해 등과 같이 전분을 처리하여 수득되고, 처리 전 보다 더 낮은 분자량을 지닌 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드이 다. 전분 분해 생성물의 예는 디브랜칭(debranching) 효소에 의해 분해된 전분, 포스포릴라제에 의해 분해된 전분 및 가수분해에 의해 일부 분해된 전분을 포함한다.
디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분은 디브랜칭 효소를 전분 상에서 작용하도록 함으로서 수득된다. 디브랜칭 효소의 작용 시간을 다양한 정도로 변화시킴으로서 브랜칭 부분(즉, α-1,6-글루코시드 결합)이 어느 정도 분열되는 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분이 수득될 수 있다. 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분의 예는 20 α-1,6-글루시드 결합을 지닌 4∼10,000 사카라이드 단위의 분해 생성물, 어떠한 α-1,6-글루코시드도 없는 3∼500 사카라이드 단위의 분해 생성물, 말토-올리고사카라이드 및 아밀로스를 포함한다. 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분의 경우 수득된 분해 생성물의 분자량의 분포는 분해된 전분 타입에 따라 달라진다. 디브랜칭 효소에 의해 분해된 전분은 다양한 길이를 지닌 사카라이드 체인의 혼합물이다.
덱스트린 및 가수분해에 의해 일부 분해된 전분은 산, 알칼리, 효소 등의 작용에 의해 전분을 일부 분해함으로서 수득된 분해 생성물을 나타낸다. 본 발명에서 덱스트린 및 가수분해에 의해 일부 분해된 전분 내 포함된 사카라이드 단위의 수는 바람직하게는 10∼100,000, 더욱 바람직하게는 50∼50,000, 더욱 더 바람직하게는 100∼10,000이다. 덱스트린 및 가수분해에 의해 일부 분해된 전분의 경우 수득된 분해 생성물의 분자량 분포는 분해된 전분 타입에 따라 달라진다. 덱스트린 및 가수분해에 의해 일부 분해된 전분은 다양한 길이를 지닌 사카라이드 체인의 혼합물이다.
덱스트린은 α-1,6-글루칸을 나타낸다.
셀룰로스는 β-1,4-글루코시드 결합에 의해 결합된 글루코스 단위로 구성된 직쇄 분자이다.
사카라이드는 단일 화합물 또는 다수의 화합물의 혼합물이다.
사카라이드는 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 포함한 수용액 내에 본래 포함되거나 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 포함한 수용액에 첨가된다. 사카라이드는 바람직하게는 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 포함한 수용액 내에 본래 포함된다. 이러한 수용액의 예는 상술된 글리코실레이션 반응용액 및 과일주스이다.
사카라이드는 바람직하게는 작은 분자이다. 용액이 글리코실레이션 반응용액으로서 상대적으로 높은 분자량 폴리사카라이드를 포함하면 글루코아밀라제와 같은 사카라이드 체인을 분열시키는 효소는 반응하게 되는 용액에 첨가되어 폴리사카 라이드를 모노사카라이드 또는 올리고사카라이드로 분해한다. 수용액 내 폴리사카라이드가 유기용매에 접촉되기 전에 모노사카라이드 또는 올리고사카라이드로 분해되는 것이 바람직하다. 모든 사카라이드는 수용액에 용해되는 것이 바람직하다. 그러나 사카라이드가 유기용매로부터 수용액을 분리하는 것을 방해하는 한 사카라이드는 수용액 내에 부분적으로 현탁된다.
수용액의 사카라이드 농도는 어떠한 농도도 된다. 수용액의 사카라이드 농도는 바람직하게는 적어도 12% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 20% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 30% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 40% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 50% 이상이다. 사카라이드 농도의 상한선은 사카라이드 및 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 침전되지 않는 한 어떠한 농도도 된다. 예를 들어 상한선은 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하 또는 55% 이하이다.
수용액의 사카라이드 농도는 당 분야에 알려진 방법에 의해 측정된다. 예를 들어 간단한 방법으로서 브릭스 눈금을 이용한 측정방법이 있다. 사카라이드의 각각의 개별적으로 측정하기 위해 예를 들어 사카라이드를 포함한 수용액은 컬럼 LiChrosorb NH2(Merck 제조 ; 4.0 x 250 mm) 및 이동 상으로 25 : 75 (v/v)의 물과 아세토니트릴의 혼합물을 이용한 HPLC가 수행되고 용출액은 RI 검출기를 이용하여 측정된다.
수용액의 pH는 바람직하게는 2∼11, 더욱 바람직하게는 3∼9, 더욱 더 바람직하게는 4∼8이다.
(3) 극성 유기용매
여기서 사용된 "극성 유기용매"는 적어도 0.4 이상의 알루미나에 대한 용매강도(ε0)를 지니고 증류수와 혼합할 수 있는 유기용매를 나타낸다. 극성 유기용매의 용매 강도는 바람직하게는 0.42∼0.98, 더욱 바람직하게는 0.44∼0.95, 가장 바람직하게는 0.44∼0.90이다. 극성 유기용매는 20℃에서 적어도 7.0 이상의 유전율을 지닌 유기용매이다. 극성 유기용매는 20℃에서 바람직하게는 7.3∼40.0, 더욱 바람직하게는 7.4∼39.0, 가장 바람직하게는 7.5∼38.0의 유전율을 지닌다.
알루미나에 대한 용매 강도의 예는 표 1에 나타나 있다. 유전율의 예는 표 2에 나타나 있다. 본 발명에서 사용된 극성 유기용매의 에는 하기 표 1 및 2에 나타나 있고, 상술된 범위 내의 용매 강도 또는 유전율을 지닌다.
용매 알루미나에 대한 용매 강도 (ε0)
플루오로알칸 -0.25
n-펩탄 0.00
이소옥탄 0.01
헥산 0.01
n-데칸 0.04
사이클로헥산 0.04
사이클로펩탄 0.05
이황화탄소 0.15
사염화탄소 0.18
자일렌 0.26
이소프로필에테르 0.28
톨루엔 0.29
벤젠 0.32
에틸에테르 0.38
아세톤 0.56
디옥산 0.56
에틸아세테이트 0.58
메틸아세테이트 0.60
디메틸 서픽스드 0.62
아닐린 0.62
디에틸아민 0.63
니트로메탄 0.64
아세토니트릴 0.65
피리딘 0.71
이소프로판올 0.82
n-프로판올 0.85
에탄올 0.88
메탄올 0.95
에틸렌글리콜 1.11
아세트산 큼
물 큼
용매 e
이소옥탄 1.94
n-헥산 1.88
n-헵탄 1.92
디에틸에테르 4.33
사이크로헥산 2.02
에틸아세테이트 6.02
톨루엔 2.38
클로로포름 4.81
테트라하이드로푸란 7.58
벤젠 2.27
아세톤 20.7
디클로로메탄 8.93
디옥산 2.25
프로판올 20.33
에탄올 25.8
디메틸포름아마이드 36.7
아세토니트릴 37.5
아세트산 6.3
디메틸설폭사이드 4.7
메탄올 32.7
물 81.1
e : 유전율
극성 유기용매는 바람직하게는 테트라하이드로푸란, 이소프로판올, 아세토니트릴, 아세톤, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 피리딘 또는 디메톡시설폭사이드, 더욱 바람직하게는 테트라하이드로푸란, 이소프로판올, 아세토니트릴 또는 아세톤, 가장 바라직하게는 테트라하이드로푸란 또는 아세토니트릴이다. 수용액이 상 분리 보조제를 더욱 포함하면 극성 유기용매는 바람직하게는 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 아세톤 또는 이소프로필알코올, 더욱 바람직하게는 아세톤 또는 이소프로필알코올이다.
극성 유기용매는 바람직하게는 단일 화합물이다. 그러나 적어도 2 이상의 극성 유기용매의 혼합물은 유기 상이 2개의 상으로 분리되는 한 사용된다. 수용액으로부터 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 추출에 적당한 극성 유기용매는 당업자에 의해 필요에 따라 선택된다.
수용액에 접촉되는 극성 유기용매의 양은 대표적으로 수용액 부피의 0.1∼10배, 더욱 바람직하게는 0.2∼2배이다.
(4) 상 분리 보조제
수용액은 상 분리 보조제를 포함한다. 여기서 사용된 "상 분리 보조제"는 수용액과 극성 유기용매의 혼합물을 수성 상과 유기 상으로 분리하는 것을 보조하는 물질을 나타낸다. 사카라이드와 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 이들이 상 분리를 보조하는 작용을 지니더라도 상 분리 보조제가 아님을 주지해야 한다. 상 분리 보조제는 설팅-아웃(salting-out) 효과를 지닌 염 및 이온 강도를 증가시키는 수용성 물질이다. 상 분리 보조제는 염 또는 유기산이다. 상 분리 보조제의 예는 황산염(즉, 황산암모늄 및 황산마그네슘), 나트륨염(즉, 염화나트륨 및 황산나트륨), 인산염(즉, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산마그네슘 및 인산암모늄), 아세트산염(즉, 아세트산나트륨 및 아세트산칼륨), 유산염(즉, 유산나트륨 및 유산마그네슘), 유기산(즉, 구연산, 구연산나트륨, 아스코르브산, 아스코르브산나트륨 및 사과산) 및 염화암모늄을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 상 분리 보조제는 바람직하게는 염이고 더욱 바람직하게는 염화나트륨, 구연산나트륨, 황산마그네슘 및 황산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상 분리 보조제는 상 분리를 보조하는 충분한 양으로 수용액 내에 포함된다. 이러한 양은 당업자에게 알려져 있다. 상 분리 보조제의 농도는 바람직하게는 적어도 3% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 10% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 15% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 20% 이상이다. 상 분리 보조제의 양에 대한 특정한 상한선은 없으나 바람직하게는 50% 이하, 더욱 바람직하게는 40% 이하이다.
상 분리 보조제는 수용액에 미리 포함되는 것이 바람직하다. 그러나 수용액 및 극성 유기용매가 서로 접촉되는 동안 상 분리 보조제가 첨가될 수 있다.
소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 및 사카라이드를 포함한 수용액의 제조
소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 및 사카라이드를 포함한 수용액은 당업자에 알려진 방법에 의해 제조된다. 이러한 수용액은 효소 반응이 진행된 후 어떠한 처리도 되지 않는 효소 반응용액 또는 효소 반응 진행된 후 농축, 희석, 여과 또는 pH-조정되는 효소 반응용액이다. 특히, 효소 반응용액의 점도가 너무 높아서 교반되지 않으면 효소 반응용액을 희석하는 것이 바람직하다. 대안으로, 수용액은 상 분리 보조제를 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 및 사카라이드를 포함한 효소 반응용액 또는 그의 농축액 내로 첨가함으로서 제조된다.
수용액은 또한 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 포함한 동물 또는 식물로부터 선택된 생물체의 추출물이다. 이러한 추출물은 당분야에 알려진 방법에 의해 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 포함한 동물 물질 또는 식물 물질을 추출함으로서 제조된다. 전형적인 추출방법은 : 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 포함한 동물 물질 또는 식물 물질을 물(즉, 0℃ 이상 40℃ 이하의 온도를 지닌 물), 따뜻한 물(즉, 40℃ 이상 60℃ 이하의 온도를 지닌 물), 뜨거운 물(즉, 60℃ 이상 100℃ 이하의 온도를 지닌 물), 알코올, 피리딘, 에틸아세테이트 또는 그의 혼합물과 같은 추출 용매에 제공하고; 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 동물 물질 또는 식물 물질로부터 추출 용매로 이동되게 하고; 추출 용매로부터 동물 물질 및 식물 물질을 제거하여 추출 용액을 수득하고; 필요한 경우 추출 용액을 농축하거나 건조하는 것으로 구성된다. 추출물은 액체 또는 고체이다. 동물 물질 또는 식물 물질을 압착함으로서 수득된 주스는 추출물의 정의에 포함된다. 수용액은 바람직하게는 과일주스이다. 동물 물질은 전체 동물 또는 동물의 기관 또는 조직이다. 식물 물질은 전체 식물 또는 식물의 기관(즉, 꽃, 열매, 종자, 뿌리, 줄기 및 잎) 또는 조직이다. 추출되는 동물 물질 및 식물 물질은 비가공 또는 건조된다. 추출물이 수용액이면 추출물은 본 발명에서와 같이 사용된다. 수용액은 농축, 희석 등에 의해 추출물로부터 제조된다. 특히, 추출물의 점도가 너무 높아서 교반되지 않으면 추출물을 희석하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 사용되는 목적 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 수용액에 용해되는 한 어떠한 다른 성분도 여기에 현탁됨을 주지해야 한다. 대안으로 수용액은 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 및 사카라이드를 포함한 동물 추출물, 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 및 사카라이드를 포함한 식물 추출물 또는 이들 추출물의 농축액 또는 희석액에 상 분리 보조제를 첨가함으로서 제조된다. 예를 들어 수용액은 과일주스 또는 그의 농축액에 상 분리 보조제를 첨가함으로서 제조된다.
살리신, 코니페린, 알부틴, 센노시드, 스테비오시드, 럽소시드, 루틴, 헤스페리딘, 나린진, 다이드제인, 제니스테인, 발바로인, 바닐린, 사포닌스, 벨베린, 카엠프페롤, 바이칼린, 카필라린, 카테킨, 코리다린, 에스쿨레틴, 에피카테킨, 진제롤스 및 글리시리진으로 구성된 군으로부터 선택된 효과적인 성분은 바람직하게는 추출 용액 내에 용해된다.
소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 추출
본 발명에 따른 방법에서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물 및 사카라이드를 포함한 수용액은 극성 유기용매에 접촉되어 수성 상 및 유기 상을 수득함으로서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 유기 상으로 이동된다.
수용액 및 극성 유기용매는 예를 들어 수용액과 극성 유기용매를 혼합함으로서 서로 접촉된다. 수용액과 유기용매를 서로 접촉시키는 것도 추출이라고 불린다. 수용액과 극성 유기용매가 서로 접촉되는 온도는 바람직하게는 10∼50℃, 더욱 바람직하게는 25∼45℃, 더욱 더 바람직하게는 20∼40℃, 가장 바람직하게는 25∼35℃이다.
수용액과 극성 유기용매가 혼합되고 교반된 후 정치되어 수성 상 및 유기 상으로 분리된다. 일반적으로, 수성 상 및 유기 상은 각각의 층 즉, 물 층 및 유기 층을 형성한다. 일반적으로 더 큰 비중을 지닌 용매 층은 하위 층이다. 물 보다 더 작은 비중을 지닌 유기 용매가 사용되면 일반적으로 물 층은 하위 층인 반면 상위 층은 유기 층이다.
일반적으로 수성 상은 극성 유기용매의 적은 양을 포함하고 유기 상은 물의 적은 양을 포함한다. 예를 들어 아세톤이 수용액 또는 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 포함한 현탁액(즉 헤스페리딘 또는 루틴) 내에 첨가되고 이들은 교반된 후 정치된다. 이들이 수성 상과 유기 상(아세톤 상)으로 분리되면 적은 양의 물이 아세톤 상 내에 용해된다. 따라서 물이 유기 상 내에 포함되지 않는 경우와 비교하여 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 용해성은 증가하고 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물은 효과적으로 아세톤 내에 용해된다.
수용액 및 극성 유기용매가 서로 접촉되도록 혼합될 때 혼합물은 바람직하게는 교반된다. 교반방법의 예는 회전, 진탕 및 이 둘 모두를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 효과적으로 추출하고 정제하기 위해 다단계 역흐름 칸막이 장치(연속 액체-액체 추출 장치라고도 불림)이 사용될 수 있다.
페놀 유도체 글리코시드의 정제
본 발명의 방법은 페놀 유도체 글리코시드의 정제에 특히 유용하다. 페놀 유도체 글리코시드의 정제는 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.
페놀 유도체 글리코시드는 예를 들어 사카라이드(즉 말토-올리고사카라이드 또는 전분)를 효소의 존재시 페놀 유도체와 반응하게 함으로서 형성된다. 일반적으로 이러한 반응은 특정 수준에서 평형에 도달하고 더 이상 진행되지 않는다. 따라서 이러한 효소 반응용액에서 페놀 유도체, 페놀 유도체 글리코시드 및 사카라이드가 존재한다. 효소 반응용액이 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드를 포함하면 글루코아밀라제와 같은 글리코실릭 효소가 효소 반응용액에 첨가되고 효소 반응용액 내 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드가 모노사카라이드로 분해되도록 인큐베이션된다. 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드의 모노사카라이드로의 분해는 사카라이드의 총 질량의 변화 없이 몰 수치 즉, 몰 농도를 증가시켜 수성 상 및 유기 상 분리의 증진을 초래한다. 효소 반응용액 및 극성 유기용매가 적은 양의 물을 포함한 1차 수성 상 및 유기 상을 수득하도록 서로 접촉되면 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드는 유기 상으로 이동된다. 상기 논의된 바와 같이 상 분리를 증가시키기 위해 상 분리 보조제가 수성 상에 첨가되어 상 분리 보조제를 포함한 수용액을 수득하게 되고 이후 수용액은 극성 유기용매와 접촉된다.
이후 적은 양의 물을 포함한 유기 상이 회수된다. 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드는 사카라이드 보다 유기 상에 더 큰 친화력을 지니도록 유발하는 소수성 부분을 포함한다. 따라서 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드는 유기 상으로 효과적으로 이동되고, 사카라이드는 유기 상으로 덜 이동된다. 따라서 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드는 회수된 유기 상 내에서 추출된다. 일반적으로 극성 유기용매의 동일한 총량이 칸막이 추출에 사용된 된다는 가정 하에 극성 유기용매가 일부 알리쿼트 내로 분리되고 알리쿼트가 수용액으로부터 추출을 실행하는데 여러 번 사용되면 추출의 효율은 극성 유기용매의 총량이 추출을 위해 수용액에 접촉하는데 1회 사용될 때 보다 더 크다. 따라서 유기 상이 회수된 후 잔류 수성 상을 극성 유기용매와 접촉시켜 수성 상과 적은 양의 물을 포함한 유기 상을 다시 수득하는 유기 상을 회수하는 단계는 2회 이상 수행된다. 유기 상의 회수 실시는 적어도 2회 이상 수행되고, 수득된 유기 상은 함께 결합되고 다음 단계에 사용된다.
이후 극성 유기용매는 적은 양의 물을 포함한 유기 상으로부터 제거된다. 유기 상으로부터 극성 유기용매를 제거하는 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법도 된다. 이러한 방법의 예는 증발기와 증발을 이용한 농축을 포함한다. 극성 유기용매는 완전히 제거되거나 다음 단계를 방해하지 않는 적은 양으로 잔존한다. 극성 유기용매의 제거 후 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드는 극성 유기용매 내 포함된 적은 양의 물 내에 잔존한다. 이러한 제거 단계에서 많은 물이 제거되는 것을 방지하는 것이 바람직하다. 이러한 제거 단계에서 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드가 침전되지 않는 것이 바람직하다. 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드가 침전되면 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드는 물의 첨가에 의해 용해된다. 따라서 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드를 포함한 2차 수용액이 수득된다.
이후 2차 수용액은 2차 수성 상 및 에틸아세테이트 상을 수득하도록 에틸아세테이트에 접촉되어 페놀 유도체가 에틸아세테이트 상으로 이동된다.
이후 2차 수용액이 회수된다. 페놀 유도체가 글리코시드 모이어티를 포함하지 않기 때문에 페놀 유도체는 페놀 유도체 글리코시드 보다 에틸아세테이트 상에 대해 더 큰 친화력을 지닌다. 따라서 페놀 유도체는 에틸아세테이트 상으로 효과적으로 이동되는 반면 페놀 유도체 글리코시드는 에틸아세테이트 상으로 덜 이동된다. 따라서 페놀 유도체 글리코시드는 회수된 수성 상 내에 잔존한다. 적은 양의 사카라이드가 2차 용액 내에 잔존할 때 사카라이드는 수성 상 내에 잔존한다. 수용액과 극성 유기용매를 접촉시키는 단계 및 유기 상을 회수하는 단계로서 에틸아세테이트 상의 제거 후 잔존하는 수성 상을 에틸아세테이트에 접촉시켜 수성 상과 에틸아세테이트 상을 다시 수득하고 2차 수성 상을 회수하는 단계가 적어도 2회 이상 수행된다.
유기 상을 에틸아세테이트에 접촉시키는 단계가 수용액과 극성 유깅용매를 접촉시키는 단계 및 유기 상을 회수하는 단계 후 수행되는 방법이 여기에 기술되었더라도 수용액은 수성 상이 극성 유기용매에 접촉되기 전에 에틸아세테이트와 접촉되고 수성 상이 회수되기도 함을 주지해야 한다.
이후 페놀 유도체 글리코시드를 침전시키기 위해 2차 수성 상은 농축되고 냉각된다. 2차 수성 상을 농축하여 2차 수성 상 내 페놀 유도체 글리코시드가 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 15% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 20% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 25% 이상의 농도에 도달하는 것이 바람직하다. 이는 페놀 유도체 글리코시드의 물 내에서 포화 농도가 사카라이드의 물 내에서의 포화 농도보다 더 낮다는 사실을 이용함으로서 수행된다. 예를 들어 사카라이드가 글루코스이고 페놀 유도체 글리코시드가 하이드로퀴논 글리코시드라는 가정 하에 글루코스의 물 내에서의 포화 농도는 약 18% 이고 하이드로퀴논 글리코시드의 물 내에서의 포화 농도는 약 10% 라는 사실이 이용된다.
이하, 본 발명은 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하나 본 발명은 실시예에 한정적인 것은 아니다.
(실험실시예 1) 상 분리 상의 사카라이드의 영향
글루코스, 슈크로스 및 프럭토스는 사카라이드의 각각의 타입의 대표로서 사용되고 이들의 수용액과 극성 유기용매의 상 분리 상의 영향이 연구될 수 있었다.
특히 글루코스, 슈크로스 또는 프럭토스는 물에 용해되어 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 및 50% 수용액이 제조되었다. 10 ml의 아세토니트릴 또는 테트라하이드로푸란이 10 ml의 각 사카라이드 수용액 내에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 아세토니트릴과 테트라하이드로푸란 모두 물과 혼합할 수 있는 극성 유기용매이고 물과 혼합될 때 혼합물은 수성 상과 유기 상으로 분리되지 않는다. 교반 후 혼합물은 30분간 정치되었고 혼합물이 2개의 상, 수성 상과 유기 상으로 분리되는지 관찰하였다. 테트라하이드로푸란 또는 아세토니트릴의 각 수용액으로의 첨가 결과는 표 3 내지 5에 나타나 있다. 표에서 THF는 테트라하이드로푸란을 AcCN은 아세토니트릴을 나타낸다.
글루코스
50% 30% 25% 20% 15% 10%
AcCN Yes Yes Yes Yes Yes No
THF Yes Yes Yes No No No
Yes : 분리됨 No: 분리되지 않음
슈크로스
50% 30% 25% 20% 15% 10%
AcCN Yes Yes Yes Yes No No
THF Yes No No No No No
Yes : 분리됨 No: 분리되지 않음
프럭토스
50% 30% 25% 20% 15% 10%
AcCN Yes Yes Yes Yes No No
THF Yes Yes No No No No
Yes : 분리됨 No: 분리되지 않음
표 3 내지 5에서 나타난 바와 같이 아세토니트릴 또는 테트라하이드로푸란이 사카라이드 수용액과 혼합될 때 특정한 양의 사카라이드가 존재하면 상 분리가 발생함을 발견하였다.
결과에 따라 수용액 내에 포함된 사카라이드의 타입 및 농도의 조정이 상 분리를 촉진시키고, 예를 들어 적어도 약 12% 이상으로 사카라이드 농도를 조정하는 것이 바람직함을 발견하였다.
(실험실시예 2) 상 분리 상의 염의 영향
다음으로 상 분리 상의 염이 영향이 연구되었다.
특히 염화나트륨이 각각 25% 또는 50%의 글루코스 농도를 지닌 글루코스 수용액에 20% 또는 10%의 농도로 첨가되어 염화나트륨-함유 글루코스 수용액을 제조하였다. 극성 유기용매인 10 ml의 아세톤 또는 이소프로판올이 10 ml의 각 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 교반 후 혼합물은 30분간 정치되었고 혼합물이 2개의 상으로 분리되는지 관찰하였다. 결과는 표 6에 나타나 있다.
글루코스 50% + NaCl 20% 글루코스 25% + NaCl 10%
아세톤 Yes No
2-ProOH Yes Yes
Yes : 분리됨 No : 분리되지 않음
구연산나트륨이 25%의 덱스트린 농도를 지닌 수용액에 20%의 농도로 첨가되어 구연산나트륨-함유 덱스트린 수용액을 제조하였다. 덱스트린은 7∼9의 DE를 지닌 Matsutani Chemical Industry Co., Ltd.에서 제조된 PINE-DEX #1임을 주지해야 한다. 여기에 사용된 "DE"는 전분의 분해 정도를 나타내는 인덱스이고 고형 함량 내 글루코스로 전환된 직접 환원 사카라이드의 백분율이다. 황산마그네슘은 25%의 글루코스 농도를 지닌 수용액에 25%의 농도로 첨가되어 황산마그네슘-함유 글루코스 수용액을 제조하였다. 극성 유기용매인 10 ml의 아세톤이 10 ml의 각 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리제를 이용하여 강하게 교반되었다. 교반 후 혼합물은 30분간 정치되었고 혼합물이 2개의 상으로 분리되는지 관찰하였다. 결과는 표 7에 나타나 있다.
덱스트린 25% + 구연산나트륨 20% 덱스트린 25% + 황산마그네슘 10%
아세톤 Yes No
2-ProOH Yes Yes
Yes : 분리됨 No : 분리되지 않음
표 6 및 7에 나타난 바와 같이 염화나트륨-함유 글루코스 수용액, 구연산나트륨-함유 덱스트린 수용액 및 황산마그네슘-함유 덱스트린 수용액이 각각 아세톤 또는 이소프로판올과 혼합될 때 상 분리가 발생하였다. 염화나트륨, 구연산나트륨 또는 황산마그네슘과 같은 염의 첨가는 그렇지 않았다면 50%의 사카라이드 수용액의 경우 상 분리를 겪지 않을 극성 유기용매 내 상 분리의 발생을 유발할 수 있다. 그 결과로서 염화나트륨과 같은 염이 상 분리 보조제로서 작용함을 발견하였다. 염이 용해된 수용액의 이온 강도를 증가시킴으로서 염이 상 분리 보조제로서 작용한다고 여겨진다. 따라서 이온 강도를 증가시킬 수 있는 어떠한 물질도 상 분리 보조제로서 사용될 수 있는 것으로 여겨진다.
(실시예 1) 카테킨의 추출
(실시예 1a)
1 g의 카테킨 혼합물(SUNPHENON; Taiyo Kagaku Co., Ltd. 제조)이 30% 글루코스를 포함한 100 ml 수용액에 용해되어 표본 수용액을 수득하였다. 표본 수용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 10 ml의 테트라하이드로푸란이 10 ml의 표본 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 하부 상(수성 상)이 회수되었고, 그의 부피 및 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 상부 상(극성 유기용매 상) 내 추출된 카테킨의 양은 하부 상의 280 nm에서의 흡광도 및 하부 상의 용액 부피의 감소로부터 계산되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 카테킨의 시작 양의 94.1%가 테트라하이드로푸란 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 1b)
부가적 추출 실시가 10 ml의 테트라하이드로푸란 대신 10 ml의 아세토니트릴이 사용된 것을 제외하고는 실시예 1a와 동일하게 수행되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 카테킨 시작 양의 84.4%가 아세토니트릴 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 2) 카테킨의 추출
(실시예 2a)
1 g의 카테킨 혼합물(SUNPHENON; Taiyo Kagaku Co., Ltd. 제조)이 30% 글루코스 및 10%의 염화나트륨을 포함한 100 ml 수용액에 용해되어 표본 수용액을 수득하였다. 표본 수용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 10 ml의 아세톤이 10 ml의 표본 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 하부 상(수성 상)이 회수되었고, 그의 부피 및 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 상부 상(극성 유기용매 상) 내 추출된 카테킨의 양은 하부 상의 280 nm에서의 흡광도 및 하부 상의 용액 부피의 감소로부터 계산되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 카테킨의 시작 양의 91.8%가 아세톤 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 2b)
부가적 추출 실시가 10 ml의 아세톤 대신 10 ml의 이소프로판올이 사용된 것을 제외하고는 실시예 2a와 동일하게 수행되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 카테킨 시작 양의 93.2%가 이소프로판올 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 3) 헤스페리딘 글리코시드의 추출
(실시예 3a)
1 g의 헤스페리딘 글리코시드(Taiyo Sugar Refining Co., Ltd. 제조)이 30% 글루코스를 포함한 100 ml 수용액에 용해되어 표본 수용액을 수득하였다. 표본 수용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 10 ml의 테트라하이드로푸란이 10 ml의 표본 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 하부 상(수성 상)이 회수되었고, 그의 부피 및 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 상부 상(극성 유기용매 상) 내 추출된 헤스페리딘 글리코시드 양은 하부 상의 280 nm에서의 흡광도 및 하부 상의 용액 부피의 감소로부터 계산되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 헤스페리딘 글리코시드의 시작 양의 50.0%가 테트라하이드로푸란 상 내에 추출된 것으로 나타났다. 또한 테트라하이드로푸란 추출 후 회수된 수성 상에 5 ml의 테트라하이드로푸란을 첨가함으로서 유사한 실시 및 측정이 2회 더 수행되었다. 그 결과로서 헤스페리딘 글리코시드의 총 80.0%가 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 3b)
부가적 추출 실시가 10 ml의 테트라하이드로푸란 대신 10 ml의 아세토니트릴이 사용된 것을 제외하고는 실시예 3a와 동일하게 수행되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 헤스페리딘 글리코시드 시작 양의 27.6%가 아세토니트릴 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 4) 헤스페리딘 글리코시드의 추출
(실시예 4a)
1 g의 헤스페리딘 글리코시드(Taiyo Sugar Refining Co., Ltd. 제조)가 30% 글루코스 및 10%의 염화나트륨을 포함한 100 ml 수용액에 용해되어 표본 수용액을 수득하였다. 표본 수용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 10 ml의 아세톤이 10 ml의 표본 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 하부 상(수성 상)이 회수되었고, 그의 부피 및 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 상부 상(극성 유기용매 상) 내 추출된 헤스페리딘 글리코시드의 양은 하부 상의 280 nm에서의 흡광도 및 하부 상의 용액 부피의 감소로부터 계산되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 헤스페리딘 글리코시드의 시작 양의 43.5%가 아세톤 상 내에 추출된 것으로 나타났다. 또한 아세톤 추출 후 회수된 수성 상에 5 ml의 아세톤을 첨가함으로서 유사한 실시 및 측정이 2회 더 수행되었다. 그 결과로서 헤스페리딘 글리코시드의 총 90.0%가 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 4b)
부가적 추출 실시가 10 ml의 아세톤 대신 10 ml의 이소프로판올이 사용된 것을 제외하고는 실시예 4a와 동일하게 수행되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 카테킨 시작 양의 93.2%가 이소프로판올 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 5) 살리신의 추출
(실시예 5a)
1 g의 살리신이 30% 글루코스를 포함한 100 ml 수용액에 용해되어 표본 수용액을 수득하였다. 표본 수용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 10 ml의 테트라하이드로푸란이 10 ml의 표본 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 하부 상(수성 상)이 회수되었고, 그의 부피 및 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 상부 상(극성 유기용매 상) 내 추출된 살리신의 양은 하부 상의 280 nm에서의 흡광도 및 하부 상의 용액 부피의 감소로부터 계산되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 살리신 시작 양의 96.5%가 테트라하이드로푸란 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 5b)
부가적 추출 실시가 10 ml의 테트라하이드로푸란 대신 10 ml의 아세토니트릴이 사용된 것을 제외하고는 실시예 5a와 동일하게 수행되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 살리신 시작 양의 98.1%가 아세토니트릴 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 6) 살리신의 추출
(실시예 6a)
1 g의 살리신이 30% 글루코스 및 10%의 염화나트륨을 포함한 100 ml 수용액에 용해되어 표본 수용액을 수득하였다. 표본 수용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 10 ml의 아세톤이 10 ml의 표본 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 하부 상(수성 상)이 회수되었고, 그의 부피 및 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 상부 상(극성 유기용매 상) 내 추출된 살리신의 양은 하부 상의 280 nm에서의 흡광도 및 하부 상의 용액 부피의 감소로부터 계산되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 살리신 시작 양의 58.0%가 아세톤 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 6b)
부가적 추출 실시가 10 ml의 아세톤 대신 10 ml의 이소프로판올이 사용된 것을 제외하고는 실시예 6a와 동일하게 수행되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 살리신 시작 양의 97.0%가 이소프로판올 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 7) 카페인산의 추출
(실시예 7a)
1 g의 카페인산이 30% 글루코스를 포함한 100 ml 수용액에 용해되어 표본 수용액을 수득하였다. 표본 수용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 10 ml의 테트라하이드로푸란이 10 ml의 표본 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 하부 상(수성 상)이 회수되었고, 그의 부피 및 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 상부 상(극성 유기용매 상) 내 추출된 카페인산의 양은 하부 상의 280 nm에서의 흡광도 및 하부 상의 용액 부피의 감소로부터 계산되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 카페인산 시작 양의 88.6%가 테트라하이드로푸란 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 7b)
부가적 추출 실시가 10 ml의 테트라하이드로푸란 대신 10 ml의 아세토니트릴이 사용된 것을 제외하고는 실시예 7a와 동일하게 수행되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 카페인산 시작 양의 76.2%가 아세토니트릴 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 8) 카페인산의 추출
(실시예 8a)
1 g의 카페인산이 30% 글루코스 및 10%의 염화나트륨을 포함한 100 ml 수용액에 용해되어 표본 수용액을 수득하였다. 표본 수용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 10 ml의 아세톤이 10 ml의 표본 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 하부 상(수성 상)이 회수되었고, 그의 부피 및 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 상부 상(극성 유기용매 상) 내 추출된 카페인산의 양은 하부 상의 280 nm에서의 흡광도 및 하부 상의 용액 부피의 감소로부터 계산되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 카페인산 시작 양의 78.2%가 아세톤 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 8b)
부가적 추출 실시가 10 ml의 아세톤 대신 10 ml의 이소프로판올이 사용된 것을 제외하고는 실시예 8a와 동일하게 수행되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 카페인산 시작 양의 87.2%가 이소프로판올 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 9) 살리실알코올의 추출
(실시예 1a)
1 g의 살리실알코올이 30% 글루코스를 포함한 100 ml 수용액에 용해되어 표본 수용액을 수득하였다. 표본 수용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 10 ml의 테트라하이드로푸란이 10 ml의 표본 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 하부 상(수성 상)이 회수되었고, 그의 부피 및 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 상부 상(극성 유기용매 상) 내 추출된 살리실알코올의 양은 하부 상의 280 nm에서의 흡광도 및 하부 상의 용액 부피의 감소로부터 계산되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 살리실알코올의 시작 양의 98.7%가 테트라하이드로푸란 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 9b)
부가적 추출 실시가 10 ml의 테트라하이드로푸란 대신 10 ml의 아세토니트릴이 사용된 것을 제외하고는 실시예 9a와 동일하게 수행되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 살리실알코올 시작 양의 98.2%가 아세토니트릴 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 10) 살리실알코올의 추출
(실시예 10a)
1 g의 살리실알코올이 30% 글루코스 및 10%의 염화나트륨을 포함한 100 ml 수용액에 용해되어 표본 수용액을 수득하였다. 표본 수용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 10 ml의 아세톤이 10 ml의 표본 수용액에 첨가되었고, 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 하부 상(수성 상)이 회수되었고, 그의 부피 및 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 상부 상(극성 유기용매 상) 내 추출된 살리실알코올의 양은 하부 상의 280 nm에서의 흡광도 및 하부 상의 용액 부피의 감소로부터 계산되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 살리실알코올의 시작 양의 87.7%가 아세톤 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 10b)
부가적 추출 실시가 10 ml의 아세톤 대신 10 ml의 이소프로판올이 사용된 것을 제외하고는 실시예 10a와 동일하게 수행되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 살리실알코올 시작 양의 98.7%가 이소프로판올 상 내에 추출된 것으로 나타났다.
(실시예 11) 엘라디탄닌 및 그의 폴리머의 추출
(실시예 11a)
고구마 추출 수용액(SUNTENCHA; Suntory Ltd. 제조)이 물로 2배 희석되어 2배 희석액을 수득하였다. 글루코스 및 염화나트륨이 2배 희석액 내에 첨가되고 용해되어 각각 10% 및 10%로 농축되어 수용액을 수득하였다. 20 ml의 아세톤이 20 ml의 수용액에 첨가되었고 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 하부 상(수성 상)이 회수되었고, 그의 부피 및 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 상부 상(극성 유기용매 상) 내 추출된 유효 성분(즉, 엘라디탄닌 및 그의 폴리머)의 양은 하부 상의 280 nm에서의 흡광도 및 하부 상의 용액 부피의 감소로부터 계산되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 유효 성분의 시작 양의 43.1%가 아세톤 상 내에 추출된 것으로 나타났다. 더욱이 아세톤 상 내의 채색 수준은 수성 상의 약 1/3이었다. 따라서 추출 실시에 의해 유효 성분이 추출되었고 탈색 효과가 수득된 것으로 나타났다.
(실시예 12) 과일주스로부터 헤스페리딘의 추출
10 ml의 15% 염화나트륨 용액이 10 ml의 캘리포니아 오렌지주스 농축액에 첨가되었고 균질하게 교반되어 수용액을 수득하였다. 사용된 캘리포니아 오렌지주스 농축액 내 헤스페리딘의 양은 이동 상이 20 : 80의 아세토니트릴과 물의 혼합물이고 유속이 0.5 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 컬럼 ODS를 이용한 HPLC에 의해 측정되었다. 용출액의 흡광도는 280 nm에서 검출되었다. 헤스페리딘의 양을 검출하는 특정 방법은 일본 공개공보 제8-80177호에 기술되어 있다. 20 ml의 아세톤이 20 ml의 수득된 수용액 내에 첨가되었고 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 이후 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 상부 상(극성 유기용매 상)이 회수되었고 부피가 측정되었다. 헤스페리딘의 양은 상기 기술된 바와 같이 HPLC에 의해 측정되었다. 그 결과로서 단일 추출 실시에 의해 헤스페리딘의 75%가 아세톤 상 내에 추출되었다.
(실시예 13) 글리코실레이션 반응용액으로부터 헤스페리딘의 추출
5% 수용성 전분(Merck 제조) 및 0.5% 헤스페리딘이 용해된 수용액이 염산으로 pH 9.0으로 적정되었다. 알칼리성-수득된 CGTase(일본 공개공보 제7-107972호에 기술된)이 5 유니트/ml의 농도로 수용액 내로 첨가되었다. 이후 효소 반응이 37℃에서 16시간 동안 진행되었다. 효소 반응 종료 후 효소 반응용액의 일부가 수집되었고 헤스페리딘 및 헤스페리딘 글리코시드의 양이 HPLC 분석방법에 의해 측정되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 20 : 80의 아세토니트릴과 물의 혼합물이고 유속이 0.5 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 LiChrospher 100RP18(Merck; 4.0 x 250 mm) 컬럼이 사용되었다. 용출액의 흡광도는 280 nm에서 검출되었다. 헤스페리딘 및 헤스페리딘 글리코시드의 분석방법은 일본 공개공보 제8-80177호에 기술되어 있다. 그 결과로서 효소 반응에 의해 반응의 시작에 첨가된 헤스페리딘의 약 80%가 헤스페리딘 글리코시드로 전환된 것으로 나타났다.
이후 글루코스 및 염화나트륨이 효소 반응 후 각각 20% 및 10%의 농도로 효소 반응용액 내로 첨가되고 용해되어 글루코스 및 염화나트륨-함유 효소 반응용액을 수득하였다. 동일 부피의 아세톤이 글루코스 및 염화나트륨-함유 효소 반응용액에 첨가되었고 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 상부 아세톤이 수집되었고 부피가 측정되었고 헤스페리딘 글리코시드의 양은 상기 기술된 바와 같이 HPLC에 의해 측정되었다. 그 결과로서 효소 반응 종료 후 효소 반응용액 내 존재하는 헤스페리딘 글리코시드의 약 45%가 아세톤 상 내에 추출되었다. 또한 효소 반응용액 부피의 반인 아세톤의 양이 하부 수성 상에 첨가되었고 교반되었고 정치되었고 상부 상이 회수되었다. 부가적인 추출 실시가 3회 수행되었다. 그 결과로서 모든 헤스페리딘 글리코시드가 회수될 수 있었다.
(실시예 14) 글리코실레이션 반응용액으로부터 하이드로퀴논 글리코시드의 추출
35% 덱스트린(DE가 7∼0인 PINE-DEX #1; Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. 제조) 및 15% 하이드로퀴논이 용해된 수용액이 5N 수산화나트륨 수용액으로 pH 6.5로 적정되었다. 글리코실레이션 효소(일본 공개공보 제6-277053호에 기술된 아밀라제 X-23)가 20 유니트/ml의 농도로 수용액 내에 첨가되었다. 이후 45℃에서 40시간 동안 인큐베이션이 실행되어 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응을 유발하였다. 효소 반응 종료 후 효소 반응용액의 일부가 수집되었고 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양이 HPLC 분석방법에 의해 측정되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 80 : 19.7 : 0.3 (v/v)의 물, 메탄올 및 인산의 혼합물이고 유속이 0.5 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 컬럼 LiChrospher 100RP18(Merck; 4.0 x 250 mm)이 사용되었다. 용출액 내 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 자외선 분광기에 의해 검출되었다. 말토-올리고사카라이드 생성물의 양은 효소 반응용액을 이용한 HPLC 분석방법에 의해 측정되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 25 : 75의 물과 아세토니트릴의 혼합물이고 유속이 1.0 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 컬럼 LiChrosorb NH2(Merck; 4.0 x 250 mm)가 사용되었다. 용출액 내 말토-올리고사카라이드는 RI 검출기에 의해 검출되었다. 그 결과로서 효소 반응에 의해 약 35%의 하이드로퀴논이 하이드로퀴논 글리코시드로 전환되었고 덱스트린은 글루코스 및 말토-올리고사카라이드로 분해된 것으로 나타났다. 또한 글루코아밀라제(Nagase Chemtex 제조; 상품명 XL-4)가 효소 반응 종료 후 8.8 유니트/ml의 농도로 효소 반응용액 내에 첨가되었고 45℃에서 3시간 동안 인큐베이션 되어 효소 반응용액 내 올리고사카라이드를 글루코스로 분해하였다.
이후 동일한 부피의 테트라하이드로푸란이 올리고사카라이드의 분해 후 효소 반응용액에 첨가되었고 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 상부 테트라하이드로푸란 상이 회수되었고 부피가 측정되었다. 테트라하이드로푸란 상에 용해된 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 상기 기술된 바와 같이 HPLC에 의해 분석되었다. 그 결과로서 효소 반응 종료 후 효소 반응용액 내 존재하는 하이드로퀴논 글리코시드의 약 65%가 테트라하이드로푸란 상 내에 추출되었다. 또한 효소 반응용액 부피의 반인 테트라하이드로푸란의 양이 하부 수성 상에 첨가되었고 교반되었고 정치되었고 상부 상이 회수되었다. 부가적인 추출 실시가 3회 수행되었다. 그 결과로서 모든 하이드로퀴논 글리코시드가 회수될 수 있었다.
(실시예 15) 글리코실레이션 반응용액으로부터 하이드로퀴논 글리코시드의 추출
35%의 덱스트린(DE가 7∼9인 PINE-DEX #1; Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. 제조) 및 15% 하이드로퀴논이 용해된 수용액이 5N 수산화나트륨 수용액으로 pH 6.5로 적정되었다. 글리코실레이션 효소(일본 공개공보 제6-277053호에 기술된 아밀라제 X-23)가 20 유니트/ml의 농도로 수용액 내에 첨가되었다. 이후 45℃에서 40시간 동안 인큐베이션이 수행되어 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응을 유발하였다. 효소 반응 종료 후 효소 반응용액의 일부가 수집되었고 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양이 HPLC 분석방법에 의해 측정되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 80 : 19.7 : 0.3 (v/v)의 물, 메탄올 및 인산의 혼합물이고 유속이 0.5 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 컬럼 LiChrospher 100RP18(Merck; 4.0 x 250 mm)이 사용되었다. 용출액 내 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 자외선 분광기에 의해 검출되었다. 말토-올리고사카라이드 생성물의 양은 효소 반응용액을 이용한 HPLC 분석방법에 의해 측정되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 25 : 75의 물과 아세토니트릴의 혼합물이고 유속이 1.0 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 컬럼 LiChrosorb NH2(Merck; 4.0 x 250 mm)이 사용되었다. 용출액 내 말토-올리고사카라이드는 RI 검출기에 의해 검출되었다. 그 결과로서 효소 반응에 의해 약 35%의 하이드로퀴논이 하이드로퀴논 글리코시드로 전환되었고 덱스트린은 글루코스 및 말토-올리고사카라이드로 분해된 것으로 나타났다. 또한 글루코아밀라제(Nagase Chemtex 제조; 상품명 XL-4)가 효소 반응 종료 후 8.8 유니트/ml의 농도로 효소 반응용액 내에 첨가되었고 45℃에서 3시간 동안 인큐베이션 되어 효소 반응용액 내 올리고사카라이드를 글루코스로 분해하였다.
이후 올리고사카라이드의 분해 후 효소 반응용액은 증발기를 이용하여 약 1.4의 인자에 의해 진공 농축되었다. 황산암모늄이 20%의 농도로 농축액에 첨가되어 황산암모늄-함유 농축액을 수득하였다. 동일한 부피의 아세톤이 황산암모늄-함유 농축액에 첨가되었고 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 혼합물은 30분간 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 상부 아세톤 상이 회수되었고 부피가 측정되었다. 아세톤 상에 용해된 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 상기 기술된 바와 같이 HPLC에 의해 분석되었다. 그 결과로서 효소 반응 종료 후 효소 반응용액 내 존재하는 하이드로퀴논 글리코시드의 약 60%가 아세톤 상 내에 추출되었다. 또한 농축액 부피의 0.8배인 아세톤의 양이 하부 수성 상에 첨가되었고 교반되었고 정치되었고 상부 상이 회수되었다. 부가적인 추출 실시가 3회 수행되었다. 그 결과로서 모든 하이드로퀴논 글리코시드가 회수될 수 있었다.
(실시예 16) 글리코실레이션 반응용액으로부터 하이드로퀴논 글리코시드의 추출
35%의 덱스트린(DE가 7∼9인 PINE-DEX #1; Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. 제조) 및 15% 하이드로퀴논이 용해된 수용액이 5N 수산화나트륨 수용액으로 pH 6.5로 적정되었다. 글리코실레이션 효소(일본 공개공보 제6-277053호에 기술된 아밀라제 X-23)가 20 유니트/ml의 농도로 수용액 내에 첨가되었다. 이후 45℃에서 40시간 동안 인큐베이션이 수행되어 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응을 유발하였다. 효소 반응 종료 후 효소 반응용액의 일부가 수집되었고 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양이 HPLC 분석방법에 의해 측정되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 80 : 19.7 : 0.3 (v/v)의 물, 메탄올 및 인산의 혼합물이고 유속이 0.5 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 컬럼 LiChrospher 100RP18(Merck; 4.0 x 250 mm)이 사용되었다. 용출액 내 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 자외선 분광기에 의해 검출되었다. 말토-올리고사카라이드 생성물의 양은 효소 반응용액을 이용한 HPLC 분석방법에 의해 측정되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 25 : 75의 물과 아세토니트릴의 혼합물이고 유속이 1.0 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 컬럼 LiChrosorb NH2(Merck; 4.0 x 250 mm)가 사용되었다. 용출액 내 말토-올리고사카라이드는 RI 검출기에 의해 검출되었다. 그 결과로서 효소 반응에 의해 약 35%의 하이드로퀴논이 하이드로퀴논 글리코시드로 전환되었고 덱스트린은 글루코스 및 말토-올리고사카라이드로 분해된 것으로 나타났다. 또한 글루코아밀라제(Nagase Chemtex 제조; 상품명 XL-4)가 효소 반응 종료 후 8.8 유니트/ml의 농도로 효소 반응용액 내에 첨가되었고 45℃에서 3시간 동안 인큐베이션 되어 효소 반응용액 내 올리고사카라이드를 글루코스로 분해하였다.
이후 올리고사카라이드 분해 후 동일한 부피의 아세토니트릴이 효소 반응용액에 첨가되었고 5분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 교반되었다. 혼합물은 1시간 동안 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 상부 아세토니트릴 상이 회수되었고 그 양이 측정되었다. 아세토니트릴 상에 용해된 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 상기 기술된 바와 같이 HPLC에 의해 분석되었다. 그 결과로서 효소 반응 종료 후 효소 반응용액 내 존재하는 하이드로퀴논 글리코시드의 약 30%가 아세토니트릴 상 내에 추출되었다. 또한 효소 반응용액의 부피와 동일한 아세토니트릴의 부피가 하부 수성 상에 첨가되었고 교반되었고 정치되었고 상부 상이 회수되었다. 부가적인 추출 실시가 5회 수행되었다. 그 결과로서 효소 반응 종료 후 효소 반응용액 내 존재하는 하이드로퀴논 글리코시드의 약 90%가 회수될 수 있었다.
(실시예 17) 글루코아밀라제 처리에 대한 조건 연구
글리코실레이션 효소 반응이 시작 물질로서 덱스트린 또는 전분을 이용하여 수행될 때 시작 물질 보다 더 낮은 분자량을 지닌 많은 양의 글루코스 및 덱스트린이 반응 종료 후 효소 반응용액 내에 존재한다. 전체 사카라이드의 농도가 동일하더라도 몰 수치가 높을수록 유기 상으로의 사카라이드의 이동이 더 적어진다. 따라서 글리코실레이션 효소 반응의 종료 후 잔존하는 덱스트린을 글루코스로 효과적으로 분해하기 위해 덱스트린의 분해 반응에 대한 조건이 연구되었다.
35% 덱스트린(DE가 7∼9인 PINE-DEX #1; Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. 제조) 및 15% 하이드로퀴논이 용해된 수용액이 5N 수산화나트륨 수용액으로 pH 6.5로 적정되었다. 글리코실레이션 효소(일본 공개공보 제6-2777053호에 기술된 아밀라제 X-23)가 20 유니트/ml의 농도로 수용액 내에 첨가되었다. 이후 45℃에서 40시간 동안 인큐베이션이 수행되어 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응이 유발되었다.
1.4 ㎕(1배 양), 2.1㎕(1.5배 양) 또는 2.8㎕(2배 양)의 글루코아밀라제(Nagase Chemtex 제조; 상품명 XL-4)가 반응 종료 후 1 ml의 글리코실레이션 반응용액에 첨가되었다. 이후 혼합물은 45℃에서 4시간 동안 인큐베이트되었다. 인큐베이션 후 용액 내 글루코스와 말토스의 함량이 HPLC 분석방법에 의해 측정되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 25 : 75의 물과 아세토니트릴의 혼합물이고 유속이 1.0 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 LiChrosorb NH2(Merck; 4.0 x 250 mm) 컬럼이 사용되었다. 용출액 내 글루코스 및 말토스는 RI 검출기에 의해 검출되었다. 용출액 내 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 HPLC 분석방법에 의해 검출되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 80 : 19.7 : 0.3의 물, 메탄올 및 이산의 혼합물이고 유속이 0.5 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 LiChrospher 100RP18(Merck; 4.0 x 250 mm) 컬럼이 사용되었다. 용출액 내 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 자외선 분광기에 의해 검출되었다. 수득된 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드(HQG)의 수득 양에 기초하여 하이드로퀴논 글리코실레이션 이 계산되었다. 결과는 표 8에 나타나 있다.
표본 글루코스 농도 (%) 말토스 농도 (%) HQG 글리코실레이션 (%)
3시간 3시간 3시간 4시간 3시간 4시간
(XL-4) 1배 11.6 12.2 5.2 4.9 36.1 36.2
(XL-4) 1.5배 13.9 14.7 4.2 3.7 36.1 36.2
(XL-4) 2배 15.2 15.8 3.0 2.6 36.1 36.2
사카라이드 분해가 3 또는 4시간 동안 1배 양의 글루코아밀라제를 이용하여 수행되었더라도 효소 반응용액은 실질적으로 글루코아밀라제의 첨가 전과 동일한 조성물을 지녔다. 따라서 1배 글루코아밀라제로 약 1 또는 2시간까지의 반응의 연장은 말토스의 양을 극적으로 감소시킬 것 같지 않음을 나타내었다.
또한 글루코아밀라제의 양이 증가되더라도 글루코실레이션 은 실질적으로 변하지 않았다. 이는 글루코아밀라제가 목적 생성물인 하이드로퀴논 글리코시드를 분해하지 않고 덱스트린을 분해할 수 있음을 나타낸다. 따라서 덱스트린 분해의 증가를 위해 글루코아밀라제 양의 증가는 분해 반응 시간의 연장 보다 더 효과적이다.
다음으로, THF 처리 상의 글루코아밀라제 처리 간 변화의 영향이 연구되었다. 1 ml의 (XL-4) 처리 용액과 1 ml의 THF가 함께 혼합되었고 1분간 분리 깔때기를 이용하여 강하게 진탕되었다. 진탕 후 혼합물은 1시간 동안 정치되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 수성 상이 회수되었다. 물이 수성 상에 첨가되어 1 ml가 되었다. 글루코스 및 말토스의 양은 수성 상을 이용한 HPLC 분석방법에 의해 측정되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 25 : 75의 물과 아세토니트릴의 혼합물이고 유속이 1.0 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 LiChrosorb NH2(Merck; 4.0 x 250 mm) 컬럼이 사용되었다. 용출액 내 글루코스 및 말토스는 RI 검출기에 의해 검출되었다. 용출액 내 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 HPLC 분석방법에 의해 측정되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 80 : 19.7 : 0.3 (v/v)의 물, 메탄올 및 인산의 혼합물이고 유속이 0.5 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 LiChrospher 100RP18(Merck; 4.0 x 250 mm) 컬럼이 사용되었다. 용출액 내 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 자외선 분광기에 의해 측정되었다. 수득된 결과 및 상술된 글루코스 농도, THF로의 추출 전 말토스 농도 및 HQG 농도에 기초하여 THF 상에 대한 추출율이 계산되었다. 결과는 표 9에 나타나 있다.
표본 THF에 대한 추출율 (%)
글루코스 말토스 HQG
(XL-4) 1배 43.3 38.6 71.2
(XL-4) 1.5배 36.3 33.0 70.0
(XL-4) 2배 38.0 36.4 73.7
그 결과로서 글루코스 농도가 글루코아밀라제 처리에 의해 증가되면 THF 상에 대한 글루코스의 추출이 억제되는 경향이 있는 것으로 확인되었다.
표본에 첨가되는 글루코아밀라제의 양이 더 많을수록 THF와의 진탕 및 분리 후 회수된 수성 상의 부피가 더 적어지는(THF 상에 이동된 물의 양이 더 적어지는) 경향도 확인되었다.
(실시예 18) 테트라하이드로푸란 상으로의 추출 상의 사카라이드 농도의 영향
테트라하이드로푸란(THF) 상으로의 추출 상의 수용액 내 글루코스 농도의 영향이 연구되었다.
먼저, 42% 글루코스 및 9% 하이드로퀴논 글리코시드를 포함한 수용액이 제조되었다. 이러한 수용액은 물로 연속적으로 희석되어 40%에서 20%까지의 글루코스 농도를 지닌 수용액을 제조하였다. 물론 수용액의 희석에 의해 글루코스뿐만 아니라 하이드로퀴논 글리코시드도 희석되었다. 5 ml의 THF가 5 ml의 상기-제조된 수용액에 첨가되었고 믹서를 이용하여 55분간 30℃에서 교반되었다. 교반 후 혼합물은 5분간 3000 rpm으로 원심분리되었다. 상부 상이 회수되었다. 글루코스 농도가 감소함에 따라 THF의 양이 감소되었다. 글루코스 농도가 20%일 때 상 분리는 단일 추출 실시에 의해 발생하지 않았다. 5 ml의 THF가 하부 상에 다시 첨가된 후 상부 상이 유사하게 회수되었다. 수용액에 대해 수득된 2개의 상부 상이 함께 첨가되었다. 글루코스 및 말토스의 함량은 HPLC 분석방법에 의해 측정되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 25 : 75의 물과 아세토니트릴의 혼합물이고 유속이 1.0 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 LiChrosorb NH2(Merck; 4.0 x 250 mm) 컬럼이 사용되었다. 용출액 내 글루코스 및 말토스는 RI 검출기에 의해 검출되었다. 용출액 내 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 HPLC 분석방법에 의해 검출되었다. HPLC 분석방법에서 이동 상이 80 : 19.7 : 0.3 (v/v)의 물, 메탄올 및 인산의 혼합물이고 유속이 0.5 ml/분이고 컬럼 온도가 40℃인 LiChrospher 100RP18(Merck; 4.0 x 250 mm) 컬럼이 사용되었다. 용출액 내 하이드로퀴논 및 하이드로퀴논 글리코시드의 양은 자외선 분광기에 의해 측정되었다.
결과는 도 1에 나타나 있다. 도 1에 나타난 바와 같이 하이드로퀴논 글리코시드의 이동율은 글루코스 농도에 크게 의존적이지 않았다. 그러나 글루코스의 이동율은 글루코스 농도의 증가에 따라 감소하였다. 따라서 추출에 사용되기 위한 수용액의 사카라이드 농도가 증가하면 극성 유기용매로의 사카라이드의 이동이 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 이동보다 더 적어서 고-순도 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 수득될 수 있는 것으로 나타났다.
(실시예 19) 하이드로퀴논 글리코시드의 추출 상의 글리코실레이션 반응용액 농도의 영향
상술된 실시예 18에 나타난 바와 같이 수용액의 사카라이드 농도가 증가하면 유기 상으로의 사카라이드의 이동이 억제되어 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물이 유기 상으로 효과적으로 이동되는 것으로 나타났다. 따라서 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물을 포함한 효소 반응용액을 농축하던지 아니던지 유기 상으로의 사카라이드의 이동이 억제되어 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 추출 효율이 증가된 것으로 나타났다.
35% 덱스트린(DE가 7∼9인 PINE-DEX #1; Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. 제조) 및 15% 하이드로퀴논이 용해된 수용액이 5N 수산화나트륨으로 pH 6.5로 적정되었다. 글리코실레이션 효소(일본 공개공보 제6-277053호에 기술된 아밀라제 X-23)가 20 유니트/ml의 농도로 수용액에 첨가되었다. 이후 45℃에서 40시간 동안 인큐베이션이 수행되어 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응을 유발하였다. 2.1 ㎕(1.5배 양)의 글루코아밀라제(Nagase Chemtex 제조; 상품명 XL-4)가 반응 종료 후 글리코실레이션 반응용액의 ml 당 첨가되었다. 이후 글루코아밀라제 처리는 45℃에서 4시간 동안 수행되어 반응용액을 수득하였다.
5 ml의 상기 반응용액은 증발기에 의해 80%(4.0 ml) 또는 70%(3.5 ml) 부피로 농축되었다. THF의 동일 부피가 비농축된 반응용액, 80% 농축액 또는 70% 농축액에 첨가되었고 1분간 믹서를 이용하여 강하게 진탕되었다. 추출은 30℃의 조건 하에서 수행되었다. 혼합물은 1시간 동안 정치되었다. 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 상부 THF 상이 회수되었다. 수득된 THF 상은 글루코스, 말토스 및 하이드로퀴논 글리코시드의 함량에 대해 상기 기술된 바와 같이 HPLC에 의해 분석되었다. 수성 상 양의 0.5배 양의 THF를 하부 수성 상에 다시 첨가하고, 진탕하고, 추출하고, 상부 THF 상을 회수하는 단계가 2회 더 반복되었다. 수득된 THF 상은 함께 결합되었다. 상 분리 동안 중간층이 농축액 내에서 생성되더라도 중간층은 수성 상에 포함되었음이 주지되어야 한다. 결과는 표 10 내지 12에 나타나 있다.
비농축 아밀라제 처리 반응용액 (2배 희석액의 브릭스 농축 (Bx) = 24.5)
용액 부피 보정된 농도 (5 ml 등량) % 추출율 (%)
표본 (ml) 글루코스 말토스 HQG 글루코스 말토스 HQG
비농축 아밀라제 처리 반응용액 5 18.8 1.7 10.8
총 THF 상 9.5 7.4 0.1 9.9 39.2 3.2 90.9
80% 농축액 (2배 희석액 Bx = 29.5) (글루코스 : 22.7%, 말토스 : 1.3%, HQG : 13.5%)
용액 부피 보정된 농도 (5 ml 등량) % 추출율 (%)
표본 (ml) 글루코스 말토스 HQG 글루코스 말토스 HQG
GA 처리 용액 80% 농축액 4 18.2 1.1 10.8
총 THF 상 9.2 4.7 0 10.9 26.1 0 101.1
70% 농축액 (2배 희석액 Bx = 34.0) (글루코스 : 25.8%, 말토스 : 1.9%, HQG : 15.2%)
용액 부피 보정된 농도 (5 ml 등량) % 추출율 (%)
표본 (ml) 글루코스 말토스 HQG 글루코스 말토스 HQG
GA 처리 용액 70% 농축액 3.5 18 1.3 10.6
총 THF 상 7.7 3.9 0 10.1 21.7 0 95.2
그 결과로서 예측된 바와 같이 후-글루코아밀라제 처리 반응용액을 농축한 후 THF 추출을 수행함으로서 THF 상 내에서 추출된 글루코스 양이 비농축된 용액으로부터 추출된 것의 약 50∼60%로 억제될 수 있었다.
(실시예 20) 상 분리 상의 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 영향
실시예 17에 기술된 바와 같이 글리코실레이션 반응용액이 THF를 이용하여 추출될 때 수성 상은 글루코스 농도가 20% 이하이고 THF 상이 수성 상보다 더 크더라도 유기 상으로부터 완전히 분리되었다. 반대로 상술된 실시예 18에서 42% 글루코스 및 9% 하이드로퀴논 글리코시드(실질적으로 어떠한 하이드로퀴논도 포함하지 않은)를 포함한 용액이 20%의 글루코스 농도가 되도록 물로 희석될 때 상 분리는 THF의 첨가에도 불구하고 발생하지 않았다. 따라서 상 분리 상의 소수성 그룹 함유-수용성 유기 화합물의 영향이 조사되었다.
하이드로퀴논이 10%의 농도로 상술된 실시예 18에서 제조된 20% 글루코스-함유 희석액에 첨가되어 수용액을 수득하였다. THF의 동일 부피가 수용액에 첨가되었고 5분간 믹서를 이용하여 교반되었다. 이후 혼합물은 1시간 동안 정치되었다. 그 결과로서 THF 상은 수성 상으로부터 완전히 분리되었다. 더욱이 물은 THF 상에 혼합되어 THF 상이 수성 상 보다 더 커졌다. THF 상이 회수되었다. THF 내의 하이드로퀴논 글리코시드의 함량이 상기 기술된 바와 같이 HPLC에 의해 측정되었다. 그 결과로서 하이드로퀴논이 첨가되지 않을 때 보다 더 많은 양의 하이드로퀴논 글리코시드가 추출되는 것으로 나타났다. 그 이유는 THF 상 내 하이드로퀴논과 같은 우수한 수용성 물질을 수성 상에 첨가함으로서 THF는 수성 상으로 용이하게 이동되지 않고 분리는 더욱 효과적이고 더 높은 농도의 하이드로퀴논이 THF 내에 용해되어 하이드로퀴논이 글리코시드의 이동을 증가시키기 때문인 것으로 여겨진다.
(실시예 21) 테트라하이드로푸란 상으로의 추출 상의 온도의 영향
테트라하이드로푸란 상으로의 추출 상의 온도의 영향이 조사되었다.
먼저, 35% 덱스트린(DE가 7∼9인 PINE-DEX #1; Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. 제조) 및 15% 하이드로퀴논이 용해된 수용액이 5N 수산화나트륨 수용액으로 pH 6.5로 적정되었다. 글리코실레이션 효소(일본 공개공보 제6-2777053호에 기술된 아밀라제 X-23)가 20 유니트/ml의 농도로 수용액에 첨가되었다. 이후 45℃에서 40분간 인큐베이션이 수행되어 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응을 유발하였다. 반응 종료 후 2.1 ㎕(1.5배 양)의 글루코아밀라제(Nagase Chemtex; 상품명 XL-4)가 각 1 ml의 글리코실레이션 반응용액에 첨가되었다. 이후 혼합물은 45℃에서 4시간 동안 인큐베이트되어 후-글루코아밀라제 처리 반응용액을 수득하였다.
5 ml의 THF가 5 ml의 후-글루코아밀라제 처리 반응용액에 첨가되었고 5분간 3, 10, 22 또는 45℃에서 믹서를 이용하여 교반되었다. 이후 혼합물은 5분간 3000 rpm으로 원심분리되었다. 그 결과로서 혼합물은 2개의 상으로 분리되었다. 수성 상이 회수되었다. 물이 5 ml가 되도록 수성 상에 첨가되어 수용액을 수득하였다. 조정 후 수용액의 하이드로퀴논, 하이드로퀴논 글리코시드 및 글루코스 농도가 상기 기술된 바와 같이 HPLC에 의해 측정되었다.
결과는 표 13에 나타나 있다.
수성 상의 하이드로퀴논, 하이드로퀴논 글리코시드 및 글루코스의 농도
시작 3℃ 10℃ 20℃ 22℃ 30℃ 45℃
HQ 9.5 0.9 0.7 1.0 1.0 1.0 1.2
HQG 11.5 2.8 2.7 3.4 3.5 3.5 4.8
글루코스 19.4 11.1 11.5 13.3 13.4 13.4 16.6
단위 : %
표 13의 결과에 기초하여 하이드로퀴논 글리코시드 및 글루코스의 이동율이 계산되었다. 도 2는 이동율의 그래프를 나타낸다.
표 13 및 도 2에 나타난 바와 같이 추출 온도가 낮으면 더 많은 양의 사카라이드가 THF 상으로 이동되었다. 온도가 증가함에 따라 THF 상으로의 하이드로퀴논, 하이드로퀴논 글리코시드 및 글루코스의 이동율이 감소하였다. 그 이유는 수성 상에 대한 HQG 및 글루코스의 용해성이 온도의 증가에 따라 증가하여 THF 상으로의 이동이 감소하였기 때문인 것으로 여겨진다. 또한 온도가 더 높을수록 하이드로퀴논과 글루코스의 이동율 사이의 차이가 더 커진다. 따라서 하이드로퀴논 글리코시드의 순도는 가능한 높은 온도에서 추출을 수행함으로서 더 증가될 수 있는 것으로 나타났다.
도 1은 테트라하이드로푸란 추출 상의 글루코스 농도의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 하이드로퀴논 글리코시드 및 글루코스의 테트라하이드로푸란 상으로의 이동율을 나타낸 그래프이다.

Claims (4)

  1. ⅰ) 헤스페리딘 또는 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응용액으로부터 유래된 페놀 유도체; 헤스페리딘 또는 하이드로퀴논 글리코실레이션 반응용액으로부터 유래된 페놀 유도체 글리코시드; 및 D-글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 아라비노스, 자일로스, 람노스, 슈크로스, 락토스, 말토-올리고사카라이드, 갈락토-올리고사카라이드, 락토-올리고사카라이드, 프럭토-올리고사카라이드, 덱스트린, 아밀로스, 아밀로펙틴, 전분, 덱스트란, 셀룰로스로 구성된 군에서 선택된 사카라이드를 포함한 1차 수용액을 테트라하이드로푸란 또는 아세토니트릴 극성 유기용매에 접촉시켜 1차 수성 상 및 유기 상을 수득함으로서 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드를 유기 상으로 이동시키는 단계;
    ⅱ) 유기 상을 회수하는 단계;
    ⅲ) 유기 상으로부터 테트라하이드로푸란 또는 아세토니트릴 극성 유기용매를 제거하여 페놀 유도체 및 페놀 유도체 글리코시드를 포함한 2차 수용액 수득하는 단계;
    ⅳ) 2차 수용액을 에틸아세테이트에 접촉시켜 2차 수성 상 및 에틸아세테이트 상을 수득함으로서 페놀 유도체를 에틸아세테이트 상으로 이동시키는 단계;
    ⅴ) 2차 수성 상을 회수하는 단계;
    ⅵ) 2차 수성 상을 농축하고 냉각시켜 페놀 유도체 글리코시드를 침전시키는 단계로 구성된
    페놀 유도체 글리코시드의 정제방법
  2. 제 1항에 있어서, 극성 유기용매의 양은 1차 수용액의 부피 대비 0.2 내지 2배임을 특징으로 하는 정제방법
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 사카라이드는 D-글루코스 또는 말토스임을 특징으로 하는 정제방법
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