CN115215913A - 一种玉米须中分离纯化芦丁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玉米须中分离纯化芦丁的方法，属于生物化工技术领域。本发明公开了采用碱提取酸沉淀‑超声波法提取玉米须芦丁，采用双水相纯化法纯化玉米须芦丁的方法。利用碱提取酸沉淀‑超声波法提取玉米须芦丁时，料液比、超声时间、pH值对其提取率影响较大，经过优化，在料液比为1：10、超声时间40min、pH为9时，提取率达到9.158％。采用丙酮‑硫酸铵双水相体系纯化的方法对芦丁粗提物进行纯化，芦丁粗提物含量、pH值、丙酮浓度以及硫酸铵浓度均对纯化率有影响，经过优化，在pH值为6，(NH4)2SO4水溶液质量浓度38％，丙酮浓度70％时，纯化率达到90％。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种玉米须中分离纯化芦丁的方法。
背景技术
玉米须是一种农业副产物，资源丰富，来源广泛。玉米须中含有维生素和纤维素等多种营养物质，用来治疗高血压，糖尿病等疾病。芦丁，存在于玉米须中。芦丁具有抗氧化，抗辐射等多种生物学活性，经常被用作食品抗氧化剂和天然色素。玉米须中芦丁的提取具有一定的经济效益和社会价值。
芦丁(Rutin，RT)作为一种黄酮醇配糖体，具有一定的生物学活性，包括抗自由基作用、抗氧化作用、降胆固醇、抗血小板凝集等。在药理价值上，芦丁能改善血管通透性以及降低脆性，降低胆固醇，保护心脑血管，以及加快细胞生长和防止血细胞凝集成团等作用。可用于防治脑溢血、高血压、糖尿病等重大疾病；在食品生产中，芦丁属于食品添加剂，可被用作防腐剂和营养增强剂；在美妆行业，由于芦丁能够吸收320-400nm范围的紫外线，所以芦丁常单用或与吸收波长为280-320nm紫外线的黄芩苷混合使用，作防晒霜的主要成分。
近年来，国内外学者对黄酮类化合物的研究日渐增加。其中，在黄酮的化学成分、药理价值等方面，国内外研究学者都展开了广泛而深入的研究，但对黄酮的提取和纯化工艺方面的研究却少之又少。芦丁属于黄酮类化合物，具有资源丰富的优点。芦丁具有抗炎、抗敏、抗氧化、抑菌、降血糖、降胆固醇等作用，但是芦丁水溶性较低，稳定性差和膜渗透性有限，导致其生物利用度低。因此很多科学家致力于研究芦丁的提取和纯化工序，从而提高芦丁的获得率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玉米须中分离纯化芦丁的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明以玉米须为材料，采用碱提取酸沉淀-超声波法提取芦丁、丙酮-硫酸铵双水相体系纯化芦丁，确定了最佳分离纯化工艺，为分离纯化玉米须芦丁的实际生产应用提供理论依据。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种玉米须中分离纯化芦丁的方法，采用碱提取酸沉淀-超声波法提取玉米须芦丁，获取芦丁粗提物；采用丙酮-硫酸铵双水相纯化法纯化所述芦丁粗提物，获取芦丁样品。
进一步地，所述碱提取酸沉淀-超声波法提取玉米须芦丁，包括以下步骤：
(1)玉米须粉末中加入硼砂形成混合物，混合物中加入蒸馏水，煮沸，降温后调节pH为6-10，再进行超声处理；
(2)将经步骤(1)处理后的上清液离心，弃去沉淀收集上清液，调节pH为2-3，静置，过滤收集沉淀物，再用冷水洗涤，干燥即得芦丁粗提物。
进一步地，在步骤(1)中，在步骤(1)中，所述玉米须粉末与所述硼砂的质量比为20:1，所述混合物与所述蒸馏水的料液比为1g:(5-30)mL。
进一步地，在步骤(1)中，超声条件为：50℃超声20-50min。
进一步地，在步骤(2)中，离心条件为：4℃条件下，6000rpm离心5min；所述静置时间为12h；所述冷水洗涤次数为2-3次。
进一步地，所述丙酮-硫酸铵双水相纯化法纯化玉米须芦丁，包括以下步骤：
(1)芦丁粗提物中加甲醇溶解，之后加入(NH4)2SO4水溶液形成混合溶液，并调节pH为5-9；
(2)再加入丙酮溶液，超声处理2min，震荡溶解，静置分层，取上相干燥获取芦丁样品。
进一步地，在步骤(1)中，所述芦丁粗提物与所述甲醇的料液比为3g：10mL；所述(NH4)2SO4水溶液的质量浓度为18％-38％，所述芦丁粗提物与所述(NH4)2SO4水溶液的质量体积比为(0.3-1)g：10mL。
进一步地，在步骤(1)中，所述丙酮溶液的体积浓度为50％-90％，所述混合溶液与所述丙酮溶液的体积比为1:(1-2)。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以玉米须为材料，采用碱提取酸沉淀-超声波法提取芦丁、丙酮-硫酸铵双水相体系纯化芦丁，并在单因素考察和正交试验的基础上，对影响玉米须中提取芦丁的不同因素进行实验条件优化，确定最佳分离纯化工艺，实验结果表明：
(1)利用碱提取酸沉淀-超声波法提取玉米须芦丁时，料液比、超声时间、pH值对其提取率影响较大，经过优化，在料液比为1：10、超声时间40min、pH为9时，提取率达到9.158％。
(2)采用丙酮-硫酸铵双水相体系纯化的方法对芦丁粗提物进行纯化，芦丁粗提物含量、pH值、丙酮浓度以及硫酸铵浓度均对纯化率有影响，经过优化，在pH值为6，(NH4)2SO4水溶液浓度38％，丙酮浓度70％时，纯化率达到90％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是芦丁标准曲线；
图2是超声时间对玉米须中芦丁提取率的影响；
图3是pH值对玉米须中芦丁提取率的影响；
图4是芦丁粗提物添加量对芦丁纯化率的影响；
图5是硫酸铵浓度对芦丁纯化率的影响；
图6是丙酮浓度对芦丁纯化率的影响；
图7是pH值对芦丁纯化率的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所用玉米须采自内蒙古通辽市；芦丁对照品(纯度＞98％，西安开来生物工程有限公司)。
实施例1芦丁含量的测定
1、指定芦丁标准曲线
(1)芦丁标准曲线的制定
采用的测定方法是紫外-可见分光光度计的方法，具体如下：
精确称取芦丁标准品0.02g，置于100mL容量瓶中，加入体积分数为60％的乙醇溶解定容。分别精密吸取对照品溶液各0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL置于25mL容量瓶中，采用亚销酸钠－硝酸铝法。分别加水至6mL，加入1mL 5％亚硝酸钠溶液，混匀，放置6min加入1mL 10％硝酸铝溶液，混匀，静置6min。加入10mL4％NaOH溶液，定容至刻度，混匀，静置15min显色，以相应的试剂为空白，测定芦丁含量。将波长设置为501nm，测定吸光度，并以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线如图1，得到关系式为y＝11.345x-0.0118，R2＝0.9984，可知，芦丁浓度与吸光度呈正比关系，通过吸光度可求出芦丁的浓度。
(2)芦丁含量的测定
取样品溶液1mL，加入1mL 5％亚硝酸钠溶液，混匀，放置6min，加入1mL 10％硝酸铝溶液，混匀，静置6min。加入10mL4％NaOH溶液，定容至刻度，混匀，静置15min显色，以相应的试剂为空白，测定芦丁含量。将波长设置为501nm，测定吸光度，并以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线。
(3)芦丁提取率的测定
根据标准曲线线性回归方程计算出芦丁的质量浓度C，再按公式(1)计算出玉米须中芦丁的提取率。公式如下:
Y(％)＝C×a×V/W×100％ (1)
式中，C为提取液中芦丁的浓度(μg/mL)；a为稀释倍数；V为提取液体积(mL)；W为玉米须质量(g)。
(4)芦丁纯化率的测定
根据标准曲线线性回归方程计算出芦丁的质量浓度C，再按公式(2)(3)计算出芦丁的纯化率。公式如下:
w1＝C*10000*25/30/1000 (2)
含量＝w2/w1*C*100％(3)
C-测试液中芦丁的浓度，mg/mL；
w1-纯化后用于测量的重量；
w2-测量含量值。
2、玉米须芦丁的分离纯化方法
2.1碱提取酸沉淀-超声波法提取芦丁
称取2g玉米须粉末，加入0.1g硼砂，按料液比1:10的比例加入蒸馏水，煮沸后降温，用饱和石灰水调节pH为8。用超声波清洗器50℃下超声40min，放入离心机中，转速6000rpm离心5min后，取1mL的样品液，采用亚硝酸钠-硝酸铝法，测定其芦丁含量。将上清液用盐酸调节pH值至2-3，静置12h过滤收集沉淀物，再用冷水洗涤2-3次，干燥即得芦丁粗提物。
2.2不同因素对玉米须芦丁提取率的影响
(1)料液比对玉米须芦丁提取率的影响
称取12份2g玉米须粉末，分别放入12个烧瓶中，分别加0.1g硼砂，再按按料液比1：5、1:10、1:20、1：30的比例加入蒸馏水，煮沸再降温，用饱和石灰水调节pH为8，每个比例取三份。用超声波清洗器50℃下超声40min，6000rpm离心5min，取1mL的上清液，测定其芦丁含量。料液比对玉米须芦丁提取率的影响实验结果如表1。
表1料液比对玉米须中芦丁提取率的影响
从表1可以看出，玉米须中芦丁的提取率随料液比的增加呈现出先增后降的趋势，料液比为1:5时，溶剂量比较少，可溶性成分不能完全溶解，因此此时的提取率比较低。当料液比为1：10时，提取率达到最大值。之后料液比继续增加，提取率下降，因此，应选用1：10的料液比作为定量，既可以保证了高的芦丁提取率，又防止了溶剂的浪费。
(2)超声时间对玉米须芦丁提取率的影响
称取12份2g玉米须粉末，分别放入12个烧瓶中，加0.1g硼砂，再按料液比1：10的比例加蒸馏水，煮沸，降温后用饱和石灰水调节pH为8。用超声波清洗器在50℃下超声20min、30min、40min、50min(一个比例取三份)，用高速冷冻离心机在6000rpm离心5min，取1mL的上清液，测定其芦丁含量。
超声时间对玉米须芦丁提取率的影响实验结果如图2，在20min到40min这个范围内，玉米须中芦丁的提取率随超声时间的增加而增加，超过40min之后，芦丁提取率随超声时间的增加而减少，超声时间为40min时，芦丁提取率最高，说明在此时达到了平衡。
(3)pH值对玉米须芦丁提取率的影响
称取12份2g玉米须粉末，分别放入12个烧瓶中，加0.1g硼砂，再按料液比1：10的比例加蒸馏水，煮沸，降温后用饱和石灰水调节pH为5、6、7、8、9、10(一个比例取三份)，用超声波清洗器在50℃下超声40min，用高速冷冻离心机在6000rpm离心5min，取1mL的上清液，测定其芦丁含量。
将两组药品每一个精确称取芦丁标准品2mL，置于25mL试管中(共24个样品)，加入5％的亚销酸钠溶液1mL，混匀，放置分钟6min，加1mL质量浓度为10％的硝酸铝溶液，摇匀，静置6分钟，加10mL质量浓度4％氢氧化钠试液，再加水至刻度，摇匀，静置15分钟显色，在501nm处，测定波长。
pH值对玉米须芦丁提取率的影响的实验结果如图3，芦丁属于黄酮类化合物，大多数黄酮类化合物都含有酚羟基，易溶于碱水，可和碱水反应生成盐。从图3可以看出，提取率随pH增加而增大，当达到8时，芦丁提取率最大，pH继续增加，芦丁的可溶解性物质的溶解度基本达到稳定，提取率变化不大。因此考虑提取效率和节约成本等因素，选取pH达到8为最佳。
(4)碱提取酸沉淀-超声波法提取玉米须芦丁正交实验
在单因素实验的基础上，采用正交实验确定玉米须中提取芦丁的最佳提取工艺。选取超声时间，芦丁含量，料液比，pH四个因素为自变量，以芦丁提取率为指标，得到最佳提取工艺条件。进行实验设计，实验因素、水平安排如表2。
表2正交实验因素水平表
正交实验结果及其极差分析见表3。
表3正交试验结果及极差分析表
由表3极差分析可知，三个因素对玉米须中芦丁提取率的影响的主要顺序是：料液比＞pH值＞超声时间，即料液比的变化对芦丁提取率的影响最大，pH值次之，超声时间最小。最优水平组合为料液比1：10，超声时间40min，pH值为9，提取率达到9.158％。
实施例2芦丁的纯化
1.双水相纯化法
取5组0.3g芦丁粗提物，加入1mL甲醇溶解，加入10mL质量浓度为33％的(NH4)2SO4水溶液，用氨水和0.1％的盐酸将pH调为9，再加入等体积的体积分数为60％的丙酮溶液中，超声2min，将溶液震荡溶解，静置分层。
2.双水相纯化法纯化玉米须芦丁单因素实验
(1)芦丁粗提物含量对玉米须芦丁纯化率的影响
分别称取0.15g，0.2g，0.25g，0.3g，0.35g，0.4g芦丁粗提物，并进行标号，加入1mL甲醇溶解，加入10mL质量浓度33％的(NH4)2SO4水溶液，用氨水和0.1％的盐酸将pH调为9，再加入等体积的体积分数为60％的丙酮溶液，超声2分钟将溶液震荡溶解，静置分层。观察现象，比如是否分层，是否有沉淀等。如若分层则需读出上下相体积。芦丁粗提物含量对玉米须芦丁纯化率的影响结果如下表：
表4芦丁粗提物含量的影响
由于加入的芦丁粗提物含量从0.15g-0.4g均出现分层现象，分别取上相，采用硝酸铝-亚硝酸盐法通过紫外分光光度计测定OD值，并通过公式(2)(3)中的计算方法算出芦丁的纯化率，芦丁粗体物含量对玉米须芦丁纯化率的影响实验结果如图4，在研究范围内，芦丁纯化率随芦丁添加量的增加呈先上升后下降趋势，芦丁粗提物含量为0.3g时，芦丁提取率达到最大。因此，试验时选用0.3g的芦丁粗提取具有一定的经济效益，避免资源浪费。
(2)硫酸铵浓度对玉米须芦丁纯化率的影响
称取5组0.3g芦丁粗提物，并进行标号。加入1mL甲醇溶解，分别加入10mL质量浓度18％，23％，28％，33％，38％的(NH4)2SO4水溶液，用氨水和0.1％的盐酸将pH调为9，再加入等体积的体积浓度为60％的丙酮溶液，超声2分钟将溶液震荡溶解，静置分层，。观察现象，比如是否分层，是否有沉淀等。如若分层则需读出上下相体积。硫酸铵浓度对玉米须芦丁纯化率的影响如下：
表5硫酸铵溶液浓度的影响
由表5可知，硫酸铵质量浓度大于或等于33％时，才会出现分层现象。分别取上相，采用硝酸铝-亚硝酸盐法通过紫外分光光度计测定OD值，并通过公式(2)(3)中的计算方法算出芦丁的纯化率，硫酸铵浓度对玉米须芦丁纯化率的影响实验结果如下图5，在研究范围内，硫酸铵质量浓度在18％-23％之间时，芦丁纯化率随硫酸铵浓度的增加有小幅度的增长趋势，在23％-33％之间，芦丁纯化率随硫酸铵浓度的增加有大幅的增长趋势，在硫酸铵浓度大于33％时，芦丁纯化率随硫酸铵浓度的增加而降低，说明了硫酸铵浓度过大时可能会将杂质带到溶液中去，使纯化率下降。
(3)丙酮浓度对玉米须芦丁纯化率的影响
分别称取0.3g芦丁粗提物，并进行标号，加入1mL甲醇溶解，分别加入10mL质量浓度33％的(NH4)2SO4水溶液，用氨水和0.1％的盐酸将pH调为9，再分别加入到等体积的体积分数为50％，60％，70％，80％，90％，100％的丙酮溶液中，将溶液震荡溶解，静置分层。观察现象，比如是否分层，是否有沉淀等。如若分层则需读出上下相体积。
丙酮浓度对玉米须芦丁纯化率的影响如表6：
表6丙酮溶液浓度的影响
由表6可知，当丙酮浓度过低或过高时，均不会出现分层现象。分别取上相，采用硝酸铝-亚硝酸盐法通过紫外分光光度计测定OD值，并通过公式(2)(3)中的计算方法算出芦丁的纯化率，丙酮浓度对玉米须芦丁纯化率的影响实验结果如图6，在研究范围内，芦丁纯化率随丙酮浓度的增加呈现出先增后降的趋势，并且在丙酮浓度为60％左右纯化率达到最大，丙酮浓度为100％时，纯化率最低，这说明了丙酮浓度越大，其上下相的分配系数就越低，杂质更容易进入到上相溶液中，这就导致了芦丁纯化率的降低。
(4)pH值对玉米须芦丁纯化率的影响
分别称取0.3g芦丁粗提物，并进行标号，加入1mL甲醇溶解，分别加入10mL质量浓度33％的(NH4)2SO4水溶液，用氨水和0.1％的盐酸将pH分别调为5、6、7、8、9，再加入等体积的体积分数为60％的丙酮溶液中，将溶液震荡溶解，静置分层。观察现象，比如是否分层，是否有沉淀等。如若分层则需读出上下相体积。pH值对玉米须芦丁纯化率的影响结果如表7：
表7pH值的影响
由表7可知，pH5-9时，均出现了分层现象。分别取上相，采用硝酸铝-亚硝酸盐法通过紫外分光光度计测定OD值，并通过公式(2)(3)中的计算方法算出芦丁的纯化率，pH值对玉米须芦丁纯化率的影响实验结果下图7，在研究范围内，芦丁纯化率随pH的增加而持续增大，这说明了，芦丁属于黄铜类化合物，易溶于碱水。
3.双水相纯化法纯化玉米须芦丁正交实验
在单因素实验的基础上，采用正交实验对玉米须中芦丁的纯化实验进行优化，选取芦丁粗体物含量，硫酸铵浓度，丙酮浓度，pH值等因素为自变量，芦丁纯化率为指标，确定最佳纯化工艺条件。进行实验设计，实验因素、水平安排如下表8。
表8正交实验因素水平表
正交实验结果及其极差分析见表9：
表9正交试验结果及极差分析表
由表9极差分析可知，三个因素对芦丁纯化率的影响的主要顺序是pH值>丙酮浓度>硫酸铵浓度，即pH值的变化对芦丁纯化率的影响最大，丙酮浓度次之，硫酸铵浓度影响最小。最优水平组合为料pH值6，(NH4)2SO4水溶液浓度38％，丙酮浓度70％，此时的纯化率可达90％。
本发明采用碱提取酸沉淀-超声波法从玉米须中提取芦丁，并采用双水相纯化法对得到的芦丁粗提物进行纯化，通过实验得到以下结论：
(1)利用碱提取酸沉淀-超声波法提取玉米须芦丁时，料液比，超声时间，pH值对其提取率影响较大，料液比1：10，超声时间40min，pH9时，提取率达到9.158％。
(2)采用丙酮-硫酸铵双水相体系纯化的方法对芦丁粗提物进行纯化，芦丁粗提物含量，pH值，丙酮浓度，硫酸铵浓度均对纯化率有影响，pH值为6，(NH4)2SO4水溶液浓度38％，丙酮浓度70％，纯化率达到90％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种从玉米须中分离纯化芦丁的方法，其特征在于，采用碱提取酸沉淀-超声波法提取玉米须芦丁，获取芦丁粗提物；采用丙酮-硫酸铵双水相纯化法纯化所述芦丁粗提物，获取芦丁样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱提取酸沉淀-超声波法提取玉米须芦丁，包括以下步骤：
(1)玉米须粉末中加入硼砂形成混合物，混合物中加入蒸馏水，煮沸，降温后调节pH为6-10，再进行超声处理；
(2)将经步骤(1)处理后的上清液离心，弃去沉淀收集上清液，调节pH为2-3，静置，过滤收集沉淀物，再用冷水洗涤，干燥即得芦丁粗提物。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述玉米须粉末与所述硼砂的质量比为20:1，所述混合物与所述蒸馏水的料液比为1g:(5-30)mL。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，在步骤(1)中，超声条件为：50℃超声20-50min。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，在步骤(2)中，离心条件为：4℃条件下，6000rpm离心5min；所述静置时间为12h；所述冷水洗涤次数为2-3次。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述丙酮-硫酸铵双水相纯化法纯化玉米须芦丁，包括以下步骤：
(1)芦丁粗提物中加甲醇溶解，之后加入(NH4)2SO4水溶液形成混合溶液，并调节pH为5-9；
(2)再加入丙酮溶液，超声处理2min，震荡溶解，静置分层，取上相干燥获取芦丁样品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述芦丁粗提物与所述甲醇的料液比为3g：10mL；所述(NH4)2SO4水溶液的质量浓度为18％-38％，所述芦丁粗提物与所述(NH4)2SO4水溶液的质量体积比为(0.3-1)g：10mL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述丙酮溶液的体积浓度为50％-90％，所述混合溶液与所述丙酮溶液的体积比为1:(1-2)。
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