KR100379642B1 - 대두 배아로부터 발효를 통한 고순도 이소플라본아글리콘의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대두 배아로부터 발효를 통한 고순도 이소플라본 아글리콘의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발효균주인 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)CK 11-4를 사용하여 대두 배아를 발효시켜, 대두 배아 내에 주로 배당체(glucosides) 형태로 존재하는 이소플라본(isoflavone) 성분을 생체내 흡수능이 우수한 아글리콘(aglycones) 형태로 전환시킴으로써, 종래 아글리콘 형태로 전환하기 위하여 산/알칼리로 처리하는 방법과 달리 인체에 거부감이 없고, 기존의 효소처리 방법보다 훨씬 저렴한 공정비용으로 경제적이며, 또한 상기 생물학적 발효를 거친 대두 배아를 특정 추출용매로 추출한 다음 스티렌계 다공성 흡착수지 및 재결정을 통해 정제함으로써, 순도 및 회수율이 월등히 향상된 고기능성 이소플라본 아글리콘의 생산방법에 관한 것이다.

Description

대두 배아로부터 발효를 통한 고순도 이소플라본 아글리콘의 생산방법{A process of manufacturing highly purified isoflavone aglycones by fermentation}

본 발명은 대두 배아로부터 발효를 통한 고순도 이소플라본 아글리콘의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발효균주인 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)CK 11-4를 사용하여 대두 배아를 발효시켜, 대두 배아 내에 주로 배당체(glucosides) 형태로 존재하는 이소플라본(isoflavone) 성분을 생체내 흡수능이 우수한 아글리콘(aglycones) 형태로 전환시킴으로써, 종래 아글리콘 형태로 전환하기 위하여 산/알칼리로 처리하는 방법과 달리 인체에 거부감이 없고, 기존의효소처리 방법보다 훨씬 저렴한 공정비용으로 경제적이며, 또한 상기 생물학적 발효를 거친 대두 배아를 특정 추출용매로 추출한 다음 스티렌계 다공성 흡착수지 및 재결정을 통해 정제함으로써, 순도 및 회수율이 월등히 향상된 고기능성 이소플라본 아글리콘의 생산방법에 관한 것이다.

대두는 우수한 영양원으로서 한국, 일본을 중심으로 중국, 동남아시아 지역에서 전통적인 식품으로 섭취되어 왔으며, 간장, 된장, 청국장, 납두, 템뻬(Tempeh) 등의 발효식품 외에도 두부, 두유 등 그 이용의 형태가 매우 다양하다. 최근 대두에 함유된 단백질, 올리고당, 레시틴(Lecithin), 사포닌(Saponin) 및 이소플라본(Isoflavones) 등 대두에 함유된 각종 성분의 인체에 대한 다양한 생리활성이 밝혀짐에 따라서 그 기능성이 전세계적으로 주목받고 있으며, 특히 콩과식물에 특이적으로 존재하는 이소플라본에 대한 관심재고와 기능성 소재로써의 개발은 더욱 빠르게 진행되고 있다.

문헌에 따르면 이소플라본은 여성 호르몬인 에스트로겐(Estrogen)과 유사한 작용기작을 가지고 있어 피토에스트로겐(Phytoestrogen)이라 불리며, 골다공증의 예방작용, 유방암과 전립선암 등에 대한 항암작용, 콜레스테롤 저하작용 및 항산화 작용 등 다양한 생리활성 기능이 있는 것으로 보고되고 있다[Toda, T.et al., Function of soybean isoflavone and its application, Food and Development, 31(6), 44-47, 1996; Murphy, P. A. Phytoestrogen contenrit of processed soybean products, Food Technol., 36, 60-64, 1982; Adlercreutz, C. H.et al., Soybean phytoestrogen intake and cancer risk, J. Nutr., 125(3S), 757-770,1995]. 대두 이소플라본의 상기와 같은 항암작용은 호르몬과 유사한 활성뿐만 아니라, 티로신 키나아제(Tyrosine kinase)의 저해작용, 토포이소머라아제(Topoisomerase)의 저해작용, 항산화 작용 등이 관여하는 것으로 보고되고 있으며[Ishimi, Y., Functionality of soy isoflavones, Foods and Development, 34(7), 3-7, 1999], 특히 대두의 대표적인 이소플라본인 제니스테인(Genistein)은 에스트로겐 대사에 관여하는 P450을 유도하여 에스트로겐의 합성을 억제하거나 성호르몬과 결합하는 글로블린(Globulin)의 합성을 촉진하여 유리 에스트로겐을 감소시켜 작용을 억제하는 기능이 있는 것으로 보고되고 있다.

대두에 함유된 이소플라본은 다음 표 1에 나타낸 화학식으로 표시되는 아글리콘과, 다음 표 2에 나타낸 화학식으로 표시되는 배당체가 있는데, 아글리콘은 제니스테인(Genistein), 다이드제인(Daidzein), 글리시테인(Glycitein)의 3가지가 있고, 배당체는 상기 아글리콘 각각에 대하여 3종씩 있어, 모두 12종의 이소플라본 화합물이 존재하는 것으로 알려져 있다.

선행문헌에 따르면 대두 종자에는 약 0.3%의 이소플라본 성분이 대부분 일반 배당체(Glucosides) 또는 말로닐배당체(Malonylglucosides)의 형태로 존재하며, 아세틸배당체(Acetylglucosides) 및 아글리콘은 매우 적게 함유되어 있으며, 말로닐배당체는 대두 가공시 열에 의해 쉽게 말로닐잔기가 분해되어 일반 배당체로 변환되는 것으로 보고되고 있다[Wang, H.et al., Isoflavone content in commercial soybean foods, J. Agric. Food Chem., 42, 1666-1673, 1994; Izumi, T.et al., An efficient preparation of acetyl isoflavone glucosides, Chem. Pharm. Bull., 45, 1593-1595, 1997]. 한편, 이소플라본은 일반적으로 배당체 보다는 아글리콘(aglycone)의 형태가 흡수능이 우수하여 생리적 활성이 높은 것으로 보고되고 있다.

대두의 부위별 이소플라본 함량은 선행문헌에 따르면 대두 배아 부분이 약 1.0 ∼ 1.5%로 가장 높은 것으로 알려져 있으며, 특히 글리시테인은 배아 부위에만 함유되어 있기 때문에 대두 종자 전체의 이소플라본 화합물의 조성과는 크게 다른 것으로 보고되고 있다[Takamatsu, K. Function of soy isoflavone as high degree application of soybean and its application to foods, New Food Industry, 40(8), 9-14, 1998].

상기의 대두 이소플라본에 관련된 현재까지의 연구와 그에 따른 특허분야는 대두 당밀로부터 이소플라본을 회수하는 방법[대한민국 특허출원 제97-23720호, 1996], 대두/대두 배아로부터 이소플라본 화합물을 제조하는 방법[일본특허공개 평11-263786, 1999; 일본특허공개 평10-316671, 1998; 일본특허공개 평7-14927,1995; 미국특허 5 670 632, 1997; 미국특허 제5,792,503호, 1998; 미국특허 제6,033,714호, 2000], 대두 단백질 추출물로부터 高이소플라본 성분의 제조법[일본특허공개 평10-23878, 1998; 미국특허 제5,702,752호, 1997] 등이 보고되어 있으며, 그 외 관련 연구로는 수용성 이소플라본을 제조하는 방법[일본특허공개 평10-298175, 1998; 대한민국 특허출원 제2000-10886호, 2000; 대한민국 특허출원 제2000-10926호, 2000] 등에 대한 보고가 있다.

상기의 연구와 특허들은 대두/ 대두 배아로부터 이소플라본 화합물을 제조하는 방법, 이소플라본 배당체에 산/알칼리를 처리하여 아글리콘을 제조하는 방법, 알파-1,4-글루코시드 결합(α-1,4-glucosidic bond)을 절단할 수 있는 효소들을 처리하여 일반 배당체로부터 아글리콘을 생산하는 방법들에 관한 것으로써, 95% 이상의 고순도 천연 이소플라본 화합물을 제조하는 방법이나, 대두 배아로부터 미생물을 이용한 생물학적인 발효법을 통해 생체내 흡수능이 우수한 형태인 이소플라본 아글리콘으로 전환시켜 이를 고순도로 분리하는 방법에 대한 연구와 특허는 보고된 바가 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 대두에 함유되어 있는 이소플라본 성분의 상기와 같은 우수한 효능을 인식하고, 산업적인면에서 좀더 효율적이며 다양하게 이용 가능하도록 하기 위하여 대두 배아로부터 이소플라본을 고순도로 추출하는 방법과 특히, 생체내 흡수능이 우수한 형태인 이소플라본 아글리콘으로 전환하는 방법에 대하여 다각도로 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들에 의해 선행보고[대한민국 특허등록 제114166호, 1995]된 바 있는 한국의 전통 재래식품인 청국장으로부터 분리ㆍ동정한 바실러스 리케니포미스 CK 11-4(KCCM 10042)를 이용하여 대두 배아를 발효시키면 상기 균주가 이소플라본 배당체의 당부분과 아글리콘 부분을 연결하는 알파-1,4-글루코시드 결합을 절단하는 글루코시다아제(β-glucosidase)의 활성이 우수하여 이소플라본 배당체를 이소플라본 아글리콘으로 용이하게 전환할 수 있음을 확인하였다. 또한, 전환된 아글리콘을 특정 추출용매, 온도 등의 조건으로 추출하고 다공성 흡착수지 및 재결정법을 이용하면 이소플라본 아글리콘을 고순도, 고회수율로 얻을 수 있음을 알게되어 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명은 종래의 화학적인 산/알칼리처리법에 대한 거부감을 해소하고, 종래 효소처리법에 비해 공정비용을 크게 감소시킬 뿐 아니라 이소플라본 성분의 순도를 월등히 향상시키며, 대두 전처리 공정에서 발생하는 막대한 양의 산업부산물로부터 경제적인 고부가가치화를 창출하는데 그 목적이 있다.

도 1은 실험예 3 ∼ 5를 통해 제조된 이소플라본 화합물의 HPLC 그래프이다.

도 2는 실시예 1 ∼ 2를 통해 제조된 이소플라본 아글리콘의 HPLC 그래프이다.

본 발명은 대두 배아로부터 이소플라본 아글리콘을 생산하는 방법에 있어서,

대두 배아에 물을 첨가하여 살균 및 완숙시킨 후 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액을 접종하여 30 ∼ 40 ℃에서 교반하면서 발효시킨 다음,

대두 배아 발효액 1 중량부에 대하여 100% 아세톤 및 100% 에탄올 중에서 선택된 용매를 2 ∼ 3 중량부 첨가하여 교반하면서 환류하여 추출한 후, 착즙, 분리 및 농축하여 농축물을 얻은 다음,

상기 농축물을 다공성 흡착수지에 충전시키고 물과 10% 에탄올 수용액으로 세척한 후 60% 에탄올 수용액 5 ∼ 10중량부를 첨가하여 용매 분획시키고 감압농축하여 고형분을 제조한 다음,

상기 고형분을 50 ∼ 60℃의 물 20 ∼ 40중량부에 첨가하여 가용성인 성분을 완전히 용해시킨 후, 4 ∼ 10℃의 저온조건에서 12 ∼ 24시간 동안 정치시켜 재결정화하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법에 그 특징이 있다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 미생물을 이용한 발효법을 통해 생체활성 및 효능이 우수한 이소플라본 아글리콘을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 대두 배아로부터 발효를 통한 고순도 이소플라본 아글리콘의 생산방법을 단계별로 더욱 구체화하여 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 크게 두 단계로 나눌 수 있는데, 첫 번째 단계는 미생물 발효를 통하여 대두 배아에 함유되어 있는 이소플라본 배당체를 생체내 흡수능이 우수한 이소플라본 아글리콘으로 전환시키는 과정이고, 두 번째 단계는 상기 이소플라본 복합체를 고순도로 추출하는 과정으로, 이를 다시 3가지 공정으로 나눌 수 있다.

첫 번째 단계로, 대두 배아 1중량부에 물 10중량부를 첨가하여 121℃에서 20분간 멸균 및 완숙시킨 후, 전통 청국장으로부터 분리한 대두 발효균주인BacilluslicheniformisCK 11-4의 전배양액(OD 1.5 ∼ 2.0)을 상기 대두 배아 혼합물에 대하여 0.02 ∼ 0.05 중량부 접종하여 30 ∼ 40 ℃에서 24 ∼ 48시간 동안 교반하면서 발효시킨다. 이때, 상기 발효균주 전배양액을 0.02 중량부 미만 접종할 경우 발효의 효율이 저하되며, 0.05 중량부를 초과하여 접종할 경우 접종균주를 대량으로 배양해야 하므로 소요비용이 상승하며 발효에 의한 이소플라본 성분의 손실율이 높아져 경제적으로 바람직하지 못하다.

두 번째 단계로, 상기 대두 배아 발효물에서 이소플라본 성분을 다음 3가지 공정을 통하여 추출ㆍ정제한다.

제 1 공정으로, 상기의 대두 배아 발효물에 대하여 추출용매로서 100% 아세톤(또는 100% 에탄올) 2 ∼ 3 중량부를 첨가하여 추출용매가 50 ∼ 70% 아세톤(또는 50 ∼ 70% 에탄올)이 되도록 한후, 60 ∼ 80℃의 온도에서 에지테이터 등으로 교반하면서 1 ∼ 2시간 동안 환류하여 추출한 후, 착즙 및 여과(또는 원심분리)하고, 감압 농축기로 농축하여 5 ∼ 7브릭스의 농축물을 얻는다. 이때, 상기 추출용매를 사용하는 이유는 열수, 50 ∼ 70% 메탄올 수용액, 50 ∼ 70% 이소프로판올 수용액을 사용하는 경우보다 대두 배아로부터 이소플라본의 추출수율이 높기 때문이다. 또한, 상기 추출용매를 대두 배아 1중량부에 대하여 5중량부 미만으로 첨가하면 안정적인 수율을 얻을 수 없고, 10중량부를 초과하여 과량으로 첨가하면 추출공정에서의 소요비용이 상승하여 경제적으로나 산업적으로 바람직하지 않다. 추출 온도는 60℃ 이상일 때 추출수율이 높아졌으며, 추출공정의 안정성과 에너지비를 고려할 때 80℃를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 그리고, 교반하였을때 이소플라본의 추출수율은 증가한다. 아울러, 상기 공정을 2회 반복하였는 바, 그 이유는 1차 추출물과 2차 추출물을 혼합할 경우 이소플라본의 추출수율이 증가되기 때문이다. 이와 같은 방법으로 제조된 추출물의 이소플라본 성분의 함량을 평가하기 위해 착즙, 여과(또는 원심분리)한 후, HPLC에 의한 분석방법으로 이소플라본 복합체의 총 함량을 측정한 결과, 1,260 mg%이었다.

제 2 공정으로, 상기 얻어진 대두 배아 발효물의 추출·농축물을 스티렌계 다공성 흡착수지에 충전시킨 후, 물 10 ∼ 20중량부를 첨가하여 1차 세척한 다음, 10% 에탄올 수용액 5 ∼ 10중량부를 첨가하여 2차 세척한다. 그런 다음, 60% 에탄올 수용액 5 ∼ 10중량부를 첨가하여 용출하고, 이 용출물을 40 ∼ 50℃의 온도에서 감압농축하여 이소플라본 아글리콘의 순도가 60% 이상인 분획물을 제조한다. 이때, 이소플라본 아글리콘의 회수율은 90% 이상이었다. 그리고, 상기 60% 에탄올 수용액을 5중량부 미만으로 첨가하면 유효성분이 충분히 용출되지 않아 바람직하지 않으며, 10중량부를 초과하여 과량으로 첨가하면, 제조비의 상승으로 경제적으로나 산업적으로 바람직하지 않다. 또한, 용출시 용매의 유속조건은 10 ∼ 100 ㎖/min이 바람직하며, 유속이 100 ㎖/min를 초과할 경우 흡착된 이소플라본 아글리콘을 용출해내는 시간이 충분하지 않아 수율이 저하되는 반면, 유속이 10 ㎖/min 미만일 경우 공정시간이 과도하게 길어져 바람직하지 않다.

제 3 공정으로, 상기 순도 60% 이상의 이소플라본 아글리콘의 분획물을 50 ∼ 60℃의 물 20 ∼ 40중량부에 첨가하여 가용성인 성분들을 완전히 용해시킨 후 4 ∼ 10℃의 저온조건에서 12 ∼ 24시간 동안 정치시켜 이소플라본 아글리콘의 재결정화를 유도하고, 원심분리(5,000 ×g, 20분)를 통해 상등액을 분리·제거한 후 결정화된 이소플라본을 자연건조한다. 이때, 건조된 이소플라본의 최종 순도를 HPLC법으로 검정한 결과 순도가 95% 이상이었으며, 당 공정에서 이소플라본 아글리콘의 회수율은 90% 이상인 것으로 분석되었다.

따라서, 본 발명에 따라 제조된 이소플라본 아글리콘은 생물학적으로 안정하고, 산업적으로 경제성이 우수하여 건강 보조 식품 및 기능성 식품 등에 광범위하게 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 접종균주(Bacillus licheniformis CK 11-4) 전배양액의 최적농도 선정 실험

대두 배아 100g에 500㎖의 물을 첨가하고 밀봉하여 121℃에서 20분간 살균 및 완숙시킨 후, 다음 표 3에 나타낸 바와 같은 농도로 접종균주 전배양액을 첨가하여 37℃의 온도에서 100rpm으로 교반하면서 24시간 동안 발효시켰다. 상기 발효물에 100% 아세톤 750㎖(먼저 첨가된 물과 혼합되어 최종 추출용매는 1,250㎖의 60% 아세톤 수용액이 됨)를 첨가하여 80℃의 온도에서 60rpm으로 교반하면서 2시간 동안 환류추출하였다. 추출이 종료된 후, 착즙 및 여과하여 추출액만을 모았다. HPLC법에 의한 분석방법으로 추출물에 함유되어 있는 이소플라본 성분중 배당체의 비율 및 아글리콘의 비율을 측정하고[참조 : Park, H. H.et al., Rapid metabolism of Isoflavonoids in Elicitor-treated cell suspension cultures ofPueraria lobata, Phytochem., 38(2), 373-380, 1995], 발효과정에서 손실된 이소플라본의 비율을 계산하여 그 결과를 다음 [표 3]에 나타내었다.

상기 표 3에 나타낸 결과를 통해서 볼 때, 접종균주 전배양액(OD 1.5)을 0.02 중량부 이상 사용하여 발효시켰을 때, 이소플라본 배당체로부터 아글리콘으로 전환되는 효율이 가장 높음을 알 수 있었다. 또한, 접종균주 전배양과정의 소요비용 및 시간, 발효공정에서 유래되는 이소플라본의 손실율 등을 고려할 때,0.02 ∼ 0.05 중량부를 사용하는 것이 바람직하다.

실험예 2 : 접종균주 전배양액을 이용한 최적 발효기간 선정 실험

상기 실험예 1에서 선정된 바, 접종균주 전배양액을 0.05 중량부 사용하여 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하되, 다음 표 4에 나타낸 바와 같이 발효기간을 달리하여 실험하였으며, 그 결과를 다음 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에 나타낸 결과를 통해서 볼 때, 접종균주 전배양액(OD 1.5) 0.05 중량부를 사용하여 발효 기간이 24시간일 때, 이소플라본 배당체로부터 아글리콘으로 전환되는 효율이 높고 손실율이 가장 낮음을 알 수 있었으며, 이때 이소플라본아글리콘의 함량은 733 mg%이었다. 또한, 발효기간이 길어질수록 균주에 의해 이소플라본 성분이 감소됨을 알 수 있었다.

실험예 3 : 최적 추출 용매 선정 실험

대두 배아 100g에 다음 표 5의 추출용매 500㎖를 첨가하여 80℃의 온도에서 에지테이터를 이용하여 60rpm으로 교반하면서 2시간 동안 환류추출하였다. 추출이 종료된 후, 착즙 및 여과하여 추출액만을 모았다(1차 추출물). 그리고, 남은 잔사에 동량의 추출용매를 첨가하여 동일한 추출과정을 반복 수행하였다(2차 추출물). 상기의 1, 2차 대두배아 추출물을 혼합하고 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 이소플라본 복합체의 추출량을 측정하여 그 결과를 다음 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에 나타낸 결과를 통해서 볼 때, 60% 아세톤 수용액을 추출용매로 사용할 때 이소플라본의 추출량이 가장 높았으며, 60% 에탄올 수용액을 추출용매로사용할 경우에도 거의 동등한 추출효과가 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 추출 용매로써 60% 아세톤 수용액, 60% 에탄올 수용액 중 어느 용매계를 사용하여도 무방한 것으로 판단되었다.

실험예 4 : 최적 추출온도 선정 실험

상기 실험예 3에서 선정된 추출용매(60% 아세톤 수용액)를 사용하여 실험예 3과 동일하게 수행하되, 다음 표 6에 나타낸 바와 같이 온도를 달리하여 실험하였다. 그리고, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 이소플라본의 추출량 및 추출효율을 측정하여 그 결과를 다음 표 6에 나타내었다.

상기 표 6에 나타낸 결과를 통해서 볼 때, 60% 아세톤 수용액을 사용하여 60 ∼ 80℃의 온도, 특히, 80℃의 온도에서 수행할 경우에 추출효율이 가장 높음을알 수 있었다.

실험예 5 : 최적 추출시간 선정 실험

상기 실험예 3 ∼ 4에서 선정된 추출용매(60% 아세톤 수용액)를 사용하여 80℃의 온도로 다음 표 7에 나타낸 바와 같은 시간동안 수행하는 것을 제외하고는 실험예 3과 동일하게 수행하였다. 그리고, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 이소플라본의 추출량 및 추출효율을 측정하여 그 결과를 다음 표 7 및 도 1에 나타내었다.

상기 표 7에 나타낸 결과를 통해서 볼 때, 60% 아세톤 수용액을 추출용매를 사용하여 80℃의 온도에서 수행할 경우, 추출시간을 1 ∼ 2시간으로 할 때 추출효율이 가장 높음을 알 수 있었다.

상술한 바와 같이 실험예 1 ∼ 5를 통해, 대두 배아 발효물의 추출물을 제조함에 있어서 최적조건을 알아내었다.

실시예 1 : 순도 60% 이상의 이소플라본 아글리콘의 제조

상기 실험예 1 ∼ 5에서 얻은 대두 배아 발효물의 추출물을 사용하였고, 이를 감압 농축기로 농축하여 7브릭스의 농축물을 제조하였다. 상기의 농축물 100g을 스티렌계 공업용 흡착수지로 충진된 칼럼(60 × 450 ㎜)에 충전시킨 후, 물 2000㎖를 사용하여 용출유속 50㎖/min로 컬럼을 통과시켜 세척한 후, 다시 10% 에탄올 수용액 1000㎖를 사용하여 동일한 방법으로 세척하였다. 여기에 다시 60% 에탄올 수용액 1000㎖를 동일한 방법으로 컬럼에 통과시켜 이소플라본 아글리콘이 함유된 용출분획물을 얻은 후, 각각의 용출분획물을 감압농축하여 건조 고형분을 제조하였다.

그리고, 상기 실험예 1에서 명시한 HPLC법을 이용하여 각 고형분내 이소플라본 아글리콘의 순도와 회수율 측정하였고, 그 결과를 다음 표 8에 나타내었다.

상술한 바와 같이, 순도 60% 이상의 이소플라본 아글리콘을 제조하였으나 순도가 더욱 향상된 고순도의 이소플라본 아글리콘을 제조하는 공정을 다음 실시예 2에서 상세히 설명하겠다.

실시예 2 : 순도 95% 이상의 이소플라본 아글리콘의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 순도 60% 이상의 이소플라본 아글리콘의 분획물을 사용하였고, 이 분획물 1g을 60℃의 물 40㎖에 첨가하여 가용성인 성분을 완전히 용해시켰다(용액의 점도가 높을 때에는 사용하는 물의 양을 2배로 늘린다). 상기 용액을 4℃의 조건에서 24시간 동안 정치시켜두어 이소플라본 성분이 결정화된 침전물을 얻었다. 이를 원심분리(5,000 ×g, 20분)하여 상등액을 제거한 후, 재결정화된 이소플라본 아글리콘을 자연건조하여 분말형태로 얻었다.

그리고, 상기 실험예 1에서 명시한 HPLC법을 이용하여 상기 분말의 이소플라본 아글리콘의 순도와 회수율 측정하였고, 그 결과를 다음 표 9 및 도 2에 나타내었다.

상술한 바와 같이 실시예 2를 통해서, 순도 95% 이상의 고순도 이소플라본 아글리콘을 제조하였다.

또한, 도 1 및 2에서 A는 이소플라본 배당체, B는 이소플라본 아글리콘을 나타내는데, 도 1의 대두 배아 이소플라본은 대부분 일반 배당체의 형태인 반면, 도 2의 미생물 발효법을 거친 대두 배아 이소플라본은 대부분 아글리콘의 형태로 전환되어 있음을 알 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명은 대두 배아 내의 이소플라본 배당체를 경제적이고 생물학적으로 매우 안정된 미생물 발효법을 통해 체내 흡수능이 우수한 이소플라본 아글리콘으로 전환시키는 방법을 개발하고, 또한 이를 추출하는데 있어서 용매 및 조건을 최적화할 뿐 아니라 다공성 흡착수지를 이용한 분획공정과 재결정화의 공정을 통해 고순도 이소플라본을 제조함으로써 산업적인 활용범위를 넓힘과 아울러, 산업 부산물인 대두 배아로부터 경제적 고부가가치화를 제공하는 효과가 있다.

Claims (5)

1. 대두 배아로부터 이소플라본 아글리콘을 생산하는 방법에 있어서,

   대두 배아에 물을 첨가하여 살균 및 완숙시킨 후 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)CK 11-4(KCCM 10042)의 전배양액을 접종하여 30 ∼ 40 ℃에서 교반하면서 발효시킨 다음,

   대두 배아 발효액 1 중량부에 대하여 100% 아세톤 및 100% 에탄올 중에서 선택된 용매를 2 ∼ 3 중량부 첨가하여 교반하면서 환류하여 추출한 후, 착즙, 분리 및 농축하여 농축물을 얻은 다음,

   상기 농축물을 다공성 흡착수지에 충전시키고 물과 10% 에탄올 수용액으로 세척한 후 60% 에탄올 수용액 5 ∼ 10중량부를 첨가하여 용매 분획시키고 감압농축하여 고형분을 제조한 다음,

   상기 고형분을 50 ∼ 60℃의 물 20 ∼ 40중량부에 첨가하여 가용성인 성분을 완전히 용해시킨 후, 4 ∼ 10℃의 저온조건에서 12 ∼ 24시간 동안 정치시켜 재결정화하는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 전배양액을 OD 1.5 ∼ 2.0 기준으로 상기 대두 배아 혼합물에 대하여 0.02 ∼ 0.05 중량부 접종하는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 발효는 24 ∼ 48 시간 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 추출시 환류는 60 ∼ 80℃의 온도에서 1 ∼ 2시간 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성 흡착수지에서 용출시 용매의 유속을 10 ∼ 100㎖/min으로 하는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘의 생산방법.